CS269748B1

CS269748B1 - Způsob přípravy enzymové elektrody na stanovení L-lysinu

Info

Publication number: CS269748B1
Application number: CS891899A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Doc Ing Csc Marek; Eva Ing Vrbova; Edmundas Ing Csc Ralys; Vytautas Ing Kraniauskas
Original assignee: Marek Miroslav; Vrbova Eva; Edmundas Ing Csc Ralys; Vytautas Ing Kraniauskas
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1990-05-14
Also published as: CS189989A1

Abstract

Způsob přípravy spočívá v tom, že se 1 až 20 ,ul enzymu L-lysinoxidasy o aktivitě 1 až'20 ,ukat v 1 ml roztoku enzymu imobilizuje reakcí s 1 až 10 ,ul roztoku s 1 až 5 % obj. glutaraldehydu při 4 °C po dobu 2 až 7 dní na nylonovou sítku předem aktivovanou parciální hydrolýzou roztokem s 10 až 25 Sí hmot. kyseliny chlorovodíkové po dobu 2 sekund až 20 minut nebo na kolagenovou membránu předem aktivovanou působením 4 až 6 mol.dm- močoviny po dobu 1 až 5 dnů a nylonová sííka nebo kolagenová 1 membrána s imobilizovaným enzymem se fixuje * na povrch elektrochemického kyslíkového * čidla.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy enzymové elektrody na stanovení L-lysinu.

Stanovení obsahu L-lysinu, pro člověka esenciální aminokyseliny, je důležitým kritériem vyhodnocení kvality surovin a výrobků zemědělsko-potravinářského komplexu předevSím z hlediska nutriční hodnoty potravin a krmiv. Množství L-lysinu obsažené v hydrolyzátech analyzovaných bílkovin se doposud běžné stanoví pomocí různých chromatografických technik, především ionexovou chromatograflí, popřípadě plynovou, papírovou a tenkovrstvou chromatografií bílkovinných hydrolyzátů. Jako klasickou metodu stanovení využitelného L-lysinu v různých surovinách rostlinného i živočišného původu je možno označit působení 2,4-dinitrofluorbenzenu na £-aminoskupinu v bílkovinách obsaženého lysinu s následným fotometrickým stanovením 2,4-dinitrofenylového derivátu L-lysinu v příslušném bílkovinném hydrolyžátu.

Společnou nevýhodou chromatografických metod stanovení lysinu je pracnost a především časová náročnost každé analysy. Naproti tomu přímá kolorimetrická stanovení lysinu jsou pro svoji nízkou speclfitu méně přesná. Z tohoto hlediska se jeví jako velmi atraktivní použití enzymů pro jejich vysokou substrátovou i účinkovou specifiťu. Reakce katalyzované enzymy probíhají při velmi nízkých koncentracích substrátu s vysokou reakční rychlostí, aniž by vyžadovaly extrémní hodnoty teploty, tlaku nebo pH reakční směsi. Z těchto důvodů je snížena na minimum možnost ovlivnění výsledku analys tvorbou vedlejších produktů reakce, popřípadě reakcemi jiných složek analyzované směsi látek.

Průběh enzymových reakcí je možno sledovat buá následnými reakcemi, například vzniklých reakčních produktů, nebo s výhodou fyzikálními nebo fyzikálně chemickými metodami. Vedle velmi často používané fotometrie má velký význam spojení enzymových reakcí s elektrochemickými Čidly detegujícími substráty, produkty nebo jiné látky ovlivňující průbšh enzymových reakcí. Pro stanovení L-lysinu je možno využít dekarboxylačních a oxidačních enzymových reakcí s elektrochemickým sledováním změn koncentrací Oj, HjOj, COj, H⁺, NH^*, respektive NHj.

Použití volných enzymů naráží v některých případech na technické nebo ekonomické problémy jejich získávání, obtížnou regeneraci z reakční směsi, poměrně malou stabilitou některých volných enzymů atd. Tyto problémy jsou postupně řešeny náhradou rozpustných enzymů imobilizovanýml enzymy použitelnými pro velký počet analýz. Ve spojení s elektrochemickou detekcí jsou získány biosenzory, se kterými je možno provádět analýzy bez spotřeby chemikálií v tzv. bezreagenční analýze. Velkou výhodou těchto biosenzorú je rychlost, přesnost a reprodukovatelnost stanovení a dále možnost analýzy roztoků barevných, kalných f nebo fluoreskujících, kde jsou jiné způsoby detekce obtížné.

Analytická využitelnost biosenzcrů je podstatná ovlivněna jejich stabilitou. Jedním f z hlavních faktorů, které ovlivňují stabilitu biosenzorú, je způsob imobilizace enzymů. Imobilizace se nejčastěji provádí zachycením ve struktuře gelu (polyakrylamidového gelu, želatiny, alginátu a podobně), sorpcí ve spojení s následným pokřížením pomocí bifunkčních činidel, popřípadě přímou kovalentní vazbou realizovanou některou z imobilizačních technik na přírodní nebo syntetické membrány, které jsou v těsném styku s elektrochemickým čidlem. Pro stanovení L-lyslnu byly připraveny enzymové elektrody na basi L-lysindekarboxylasy nebo mikroorganismů vykazujících tuto enzymovou aktivitu (Escherichia coli, Bacterium cadaverie, Clostridium welchii, Lastobacillus casei a podobně) ve spojení s detekcí vznikajícího oxidu uhličitého pomocí elektrochemického COj- senzoru. Hlavní nevýhodou tohoto typu enzymových, respektive mikrobiálních elektrod je příliš pomalá odezva senzoru potřebná k ustálení rovnováhy při potenciometrickém stanovení COj. Proto byly vyvinuty enzymové elektrody na stanovení L-lysinu obsahující vedle L-lysindekarboxylasy koimobilizovanou diaminoxidasu umožňující amperometrickou detekci k oxidaci vznikajícího žiaminu potřebného kyslíku. Oba enzymy byly koimobilizovány na polyamidovou sítku pomocí

CS 269 748 Bl glutaraldehydu za přídavku hovězího sérového albuminu. Přídavek diaminoxidasy sice výrazně zkrátil dobu analysy (možností spojení s kyslíkovým čidlem), na druhou stranu se však značně snížila selektivnost analysy, protože při stanovení L-lysinu může interferovat celá řada diaminů, které jsou samy o sobé substráty diaminoxidasy. Ke stanovení L-lysinu byla připravena také enzymová elektroda imobilisací L-lysinoxidasy do želatinové membrány. Nevýhodou tohoto druhu enzymové elektrody je způsob imobilizace L-lysinoxidasy, v důsledku kterého se vytváří bariérová vrstva želatiny zpomalující rychlost odezvy vlastního kyslíkového čidla, se kterým je želatinová vrstva s zmobilizovaným enzymem bezprostředně spojena.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy enzymové elektrody na stanovení L-lysi1 nu podle vynálezu spočívající v tom, že se 1 až 20 /U1 enzymu L-lysinoxidasy o aktivitě až 20 /Ukat/1 ml imobilisujs s 1 až 10 yul roztoku s 1 až 5 % obj. glutaraldehydu na předem aktivovanou nylonovou sítku nebo na kolagenovou membránu. Nylonová sítka se aktivuje před imobilizací enzymu parciální hydrolysou roztokem s 10 až 25 4 hmot, kyseliny chlorovodíkové po dobu 2 sekund až 20 minut. Kolagenová membrána se aktivuje před imobilizací enzymu působením 4 až 6 mol.dm^-3 močoviny po dobu 1 až 5 dnů. Nylonová sítka nebo kolagenová membrána s imobilizovaným enzymem se fixuje na povrch elektrochemického kyslíkového čidla.

Způsobem podle vynálezu se s výhodou na aktivovanou nylonovou sítku nebo* kolagenovou membránu společně s L-lysinoxidasou koimobilizuje další enzym katalasa o aktivitě 500 až 5 000 yukat/l ml především z. důvodu .zvýšené stability připraveného biosenzoru. Imobilizace enzymu L-lysinoxidasy je výhodné provádět v přítomnosti 0,1 až 5 yul isokyanidu, například cyklohexylisokyanidu. .

Výhodou způsobu přípravy biosenzoru na stanovení L-lysinu podle vynálezu je jednoduchost provedení, vysoká stabilita získaného biosenzoru, dostatečně rychlá odezva a šíře lineární odezvy biosenzoru v závislosti na koncentraci L-lysinu v analyzovaném vzorku.

Vynález je dokumentován příklady použití, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1

Kolagenová membrána byla podrobena 1 dennímu působení 6 mol.dm^-3 močoviny. Potom byla promyta vodou a 0,1 mol.dm^-3 fosfátovým pufrem pH 7,5. Na částečně vysušený povrch membrány bylo aplikováno 10 /U1 L-lysinoxidasy o aktivitě 2,07 ^ukat.cm'³ a 10 yul 2,5 \ (hmotn.) glutaraldehydu. Po 72 hodinovém působení při 4 °C byla membrána důkladně promyta 0,1 mol.dm'³ fosfátovým pufrem pH 7,5. Membrána s imobilizovanou l-lysinoxidasou bylá potom fixována na povrchu kyslíkového čidla.

< · ' Příklad 2

Nylonová sítka byla ponořena na 2 sekundy do 25 % hmot, kyseliny chlorovodíkové a potom ihned promyta vodou a 0,1 mol.dm'³ fosfátovým pufrem pH 7,5. Ha takto aktivovanou sítku bylo aplikováno 5 ^ul L-lysinoxidasy o aktivitě 5 yUkat.cm'³, 5 ul 2,5 % hmot, glutaraldehydu a 1 ,ul cyklohexyllisokyanidu. Po 48 hodinovém působení při 4 °C byla sítka promyta 0,1 mol.dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a potom byla fixována ra povrchu kyslíkového čidla.

Příklad 3

Na nylonovou sítku aktivovanou 20 minutovým působením 10 hmot. kyseliny chlorovodíkové bylo po jejím promytí vodou a 0,1 mol.dm ³ fosfátovým pufrem p^· 7,5 aplikováno 20 yul L-lysinoxidasy o aktivitě 1 /Ukat.cm ³, 10 /Ul katalasy o aktivitě 2 mkat.cm ³a 2 yul cyklohexalisokyanidu. Po 2 dnech reakce při 4 °C byla sítka oromyta 0,1 mol.dm ³

CS 269 748 Bl 3 fosfátovým pufrem pH 7,5 a potom byla fixována na povrchu kyslíkového čidla. '

Claims

přeomEt VYNÁLEZU

1. Způsob přípravy enzymové elektrody na stanovení L-lysinu, vyznačující se tím, že se 1 až 20 /ul enzymu L-lysinoxidasy o aktivitě 1 až, 20 yukat v 1 ml roztoku enzymu imobilizuje reakcí s 1 až 10 yul roztoku 3 1 až 5 % obj. glutaraldehydu při 4 °C po dobu 2 až 7 dní na nylonovou sítku předem aktivovanou parciální hydrolýzou roztokem s 10 ež 25 \ hmot, kyseliny chlorovodíkové po dobu 2 sekund až 20 minut nebo na kolagenovou membránu předem aktivovanou působením 4 až 6 mol.dm”·^ močoviny po dobu 1 až 5 dnů a nylonová éítka nebo kolagenová membrána s imobilizovaným enzymem se fixuje na povrch elektrochemického kyslíkového čidla.
2. Způsob přípravy enzymové elektrody na stanovení.L-lysinu podle bodu 1, vyznačující se tím, že se imobilizece enzymu L-lysinoxidasy provádí za přítomnosti 0,1 až 5 /U1 isokyanida, oapříkladčyklohexylisokyanidu.
3. Způsob přípravy enzymové elektrody na stanovení L-lysinu podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že sena nylonovou sítku nebo kolagenovou membránu koimobilizuje 0,5 až 10 /U1 enzymu katalasy o aktivitě 500 až 5 000 yukat v 1 ml.