CS269539B1 - Sposob přípravy chroaolytického substrátu k stanoveniu aktivity enzymu endo-beta-1,4- glukan glukanohydrolázy - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká přípravy chroaolytického substrátu na stanovenie celulázovtj C aktivity /endo-beta-1,4-glukan glukaňohydroláza, EC 3.2.1.4/ postu?oa, kedy vodorozpustná hydroxyetyIcelulóza sa najprv sletuje 2,2 *-bis/oxiranýlaetyl/ éteroa alebo 2-chlóroaetyloxiránoa v reakčnej zaesi zloženej popři hydroxyetylceluloze /1 haotnostný diet/ z 6 až 12,5 haotnostných dielov roztoku, připraveného z 5 až 9 haotnostných dielov metanolu alebo etanolu, jednoho až 5 haotnostných dielov destilovanej vody, 0,01 až 0,07 haotnostných dielov hydroxydu sodného alebo draselného a 0,03 až 0,08 haotnostného dielu sietovadla, při teplote 20 až 40 °C po dobu 2 až 8 hodin, na ío vymytý sletovaný gél sa ďalej kovalentne farbi v prostředí 9 až 15 haotnostných dielov destilovanej vody za pritoanosti 0,1 až 0,5 haotnostného dielu hydroxydu sodného alebo draselného a 0,08 až 0,12 haotnostného dielu farbiva, s výhodou dvojsodnej soli kyseliny 8-aaino-5-|-3 /sulfoetylsulfonyl/anilino,-6-antrachinonsulfonovej a ďalej sa přidá 0,3 až 0,7 haotnostných dielov tuhého chloridu alebo siřenu sodného a táto zaes sa nechá reagovat při teplote 15 až 30 °c po dobu 1 až 3 hodin a chroaolytická hydroxyetytcelulóza sa na to dokonale vyaýva od nezreagovaného farbiva a suší, Riešenie aá uplatnenie pri připraví štandardných subttrátov celulázy C vo forae tabletových aonotestov, s Oplatnenia v biotechnológiach pri přesných sériových analýzach aktivity celulázovej C zložky, pri šlachteni aikroorgani zoo v, přodukujúcieh celulázy C , při priemyselných kultlváciach producentov celuláz a při dávkováni celuláz do krmných zaesi, ako aj pri analýze enzýaového vybavenia aikroflory bachorových átaiv prežúvavcov.

Description

CS 269539 81 1

Vynález rleii přípravu chroaolytIckého substrátu vhodného na stanovenle eelulázovejaktivity, beta-1,4-glukan glukanohydroláza. V sůiasnostl je známy celý rad metod stanovením eelulázovej C* aktivity lbeta-1,4--glukan glukanohydroláza, EC 3.2.1.41 a celý rad spósobov vyjadrovanla eelulázovej C*aktivity. Tlete aetódy sú založená na stanoveni koncentráele uvolněných redukujůeleheukrov Iglukózy, eeloblózy, celotriózy a pod.I z natlvnej celulózy alebo jej derlvá-tov. T1eto aetódy sů však neipeclf1eké, nakolko nezohladňujů Interferencím beta-glu-kanáz, posobladch exo-mechanlzrno· |H.J. Balley, K.M.H. Nevalalnen, Enzyae Hlerob.Teehnol. 3, 143-159, 19811. V1skoz1aetr1cké a nefeloaetrlcké aetódy sú podstatné ipe-c1f1ckejš1e ale natolko zložlté, že nevyhovujů k rutlnnýa stanovenlaa |T.H. Enarl, P.Harkkanen, Advances 1n Blochealcal Englneerlng, ZT.K. Chose, A. Flechter, H. Blakes-brough, eds/, Sprlnger Verlag, Berl1n-Nev Tork, 1977, Vol.5, 1-14 ; M. Nuaal, P.C.

Fox, H.L. Niku-Paavola, Z.H. Tenarl, Anal. Biochem. 116, 133-136, 1981). Stanovenleeelulázovej C* aktivity sa zjednodušilo zavedením chroaolytlekýeh substrátov, využl-vajůclch fyzlkálnych 1nterakc11 nlektorých chroaofórov s celulózovýa retazcoa alebosubstrátov, obsahujúdch kovalentne vlažené farblvo na retazee aaorfnej celulózy ale-bo jej analogu Ij. Zeaek, Z. Pavlicová, J. Kovář, L. Kunlak, Progress 1n Biotechnolo-gy. Vol. 5, Enzyae Technologies ZA. Blažej, J. Zeaek, eds.Z Elsevler Sc1. Publ., Am-sterdam-New York-london-Tokyo, 1988, 469-478I. Uvedené chroaolytlcké substráty sú viaknei tandardné, s ohladom na velkost povrchu fázového rozhrania, neoptlaálne modifikova-né, vzhladoa na typ zavedenej funkínej skupiny Ineipedflcké Interakde s ionogénnymikarboxylovýml skuplnaall a neoptiaálnom zosieteni chroaolytlckého gélu.

Uvedené nedostatky odstraňuje postup podlá vynálezu, kterého podstata spoiiva vtom, že v prvnoa stupni sa jeden haotnostný dlel hydroxyetylcelulózy sletuje v 6 až 12,5 haotnostných díeloeh roztoku vztlahnuté na haotnost hydroxyetylcelulózy, připra-veného z pletich až devlatlch haotnostných dlelov aetanolu alebo etanolu, jednoho ažplatlch haotnostných dlelov destllovanej vody, 0,01 až 0,07 haotnostného dielu hydro-xidu sodného alebo draselného a 0,03 až 0,08 haotnostného dlelu sletovadla, s výhodou2,2'-bis/oxiranýleetyl/éteru alebo 2-chlóronetyloxiránu pri teplote 20 až 40 °C podobu 2 až 8 hodin, na čo sa v druhom stupni získaný gél sletovanej hydroxyetylceluló-zy neutralizuje a preayje vodou a v tretom stupni sa sletovaný gél hydroxyetylceluló-zy suspenduje v 9 až 15 haotnostných díeloeh destllovanej vody na haotnost východlsko-vej hydroxyety leelulózy a přidá sa jeden až dva hmotnostné dlely vodného roztoku, ob-sahujúceho 0,1 až 0,5 haotnostného dlelu hydroxidu sodného alebo draselného a Sílejjeden haotnostný dlel vodného roztoku 0,08 až 0,12 haotnostného dlelu farblva s výho-dou dvojsodnej soli kyseliny 8-aa1no-5-I-3ZsulfoetylsulfonyIZanllino!-6-antraehinon-sulfónovej a Sálej sa přidá 0,3 až 0,7 haotnostných dlelov tuhého chloridu sodnéhoalebo síranu sodného a táto zaes sa nechá reagovat pr1 teplote 15 až 30 °C po dobu 1až 3 hodin a na to sa v itvrtom stupni reakiná zaes zneutra11 zuje a chroaolytlcké hyd-roxyetylcelulóza sa dokonale vyayje od nezreagovaného farblva najprv destilovanou vo-dou a potoa zriedeným až koncentrovaným etanoloa alebo acetónoa a vysuší volné na vzdu-chu alebo vákuovo pr1 60 až 70 °C. Připravený gél chroaolyt1ckej sletovanej hydroxyetylcelulózy sa frakcionuje na sí-tách na 0,25 až 0,35 aesh. Obsah vlazaného farblva na hydroxyetylcelulózovom géli je6 až 9 haotnostných X. Napučacl objem sletovaného chroaolytlckého gélu je 10 až 16 al.g"1. Výhodou uvedeného postupu je příprava substrátu dalej aplikovatelného v enzýaovejanalýze vo forae tabletového aonotestu, lo zabezpečuje Štandardizovate(nosí a unlflko- 2 CS 269539 Bl vatetnost analytického postupu. Výhodou jo vysoké citlivost připraveného ehromolytlcké-ho substrétu a épeclflelta pro ůčlnok celulázy a rosslahla pásao linearity, ktoréuvedený substrát poskytuje v závislosti na aktivitách použitých ctluláz Ιχ. Přiklad 1.

Do skloněna] 2 litrové] nádoby opatrenaj aleiadloa sa přidal atanol /0,5 kg/ a des-tilovaná voda /0,5 kg/ obsahujůc.e 0,8 g hydroxidu sodného a 2,4 g 2,2*-b1s/ox1ranylae-tyl/étaru a 80 g hydroxyatylcelulózy /rozpustná] vo voda, poskytujůea] v svojoa 2 Xvodnoa roztoku pr1 25 °C vlskozltu 5000 nPa.s/ a raakda sletovanla sa uskutečnila přiteplota 20 °C po dobu 8 hodin. Sletovaný gél sa zneutrallzoval kyselinou octovou apraayl nadbytkoe vody /2 x 1000 «1/ a suspendoval v. 720 al destilované] vody a přida-lo sa 80 g roztoku destilované] vody, obsahujůceho 8 g NaOH a Sálej 80 al roztoku ob-sahujůceho 6,4 g dvojsodne] soli kyseliny 8-ea1no-5-I-3/sulfoetylsulfonyl/an1l1nol-6--antrachlnonsulfonovej a Salt] sa přidalo 24 g tuhého chloridu sodného. Kovalentnéfarbenle sletovaného gélu hydroxyetylcelulózy sa uskutečnilo prl teplota 15 °C po do-bu 3 hodin. Potoa sa reakčná zaes zneutrallzovala a preaývala postupné 3 x 1000 aldestilované] vody na frlte, potoa 3 x 1000 al etanolu /50 X/ a nakonlec sa suspendo-val tento gél 3 x 500 al etanolu /96 X/. Vyaytý gél neobsahujúel fyzikálně zachytanéfarblvo sa vysuill na rotačně] vákuovej odparke prl 70 °C, aeehanlcky rozmělnil a vy-siloval na s1te s 0,35 aesh. Obsah navlazaného farbiva bol 6 X. Napučad objea chro-aolytlckého celulózového gélu bol 16 al.g"1. Přiklad 2.

Do sklenenej 2 litrové] nádoby opatrenej aleiadloa sa přidal etanol /0,9 kg/, des-tilovaná voda /0,1 kg/, obsahujůca 11,2 g Na OH a 12,8 g 2-chlórometyloxi ránu a nako-nlec 160 g hydroxyatylcelulózy /viskosita 1 X vodného roztoku pr1 25 °C 1500 aPa.s/a reakčná zaes sa aleiala pr1 teplete 20 °C po dobu 8 hodin. Sletovaný gél sa zneutra-llzoval kyselinou chlorovodíkovou a prenyl nadbytkon vody /2 x 1000 »1/ a suspendovalv 2,4 kg destilované] vody obsahujůcej 80 g KOH a ďalej 160 al roztoku obsahujůceho19,2 g dvojsodne] soli kyseliny 8-aa1no-5-I-3/sulfoetylsulfonyl/anil1noI-6-antraeh1-nonsulfónovej, prlčoa sa přidávalo súčasne 112 g síranu sodného. Kovalentné farbenlesletovaného gélu hydroxyetyleelulózy sa uskutečnilo prl teplete 30 °C po dobu 1 hodi-ny. Potoa sa reakčná zaes zneutrallzovala a preaývala postupné 3 x 2000 ml destilova-né] vody na frlte, potoa 3 x 1000 al etanolu /50 X/ a nakonlec sa tento gél suspendo-val v 1000 al acetonu, čo sa opakovalo 2 krát. Vyaytý gél neobsahujúel fyzikálně za-chytané farblvo sa vysušil prl Izbovej teplote v digestoři, mechanicky rozmělnil avysiloval na $1te s 0,35 aesh. Obsah navlazeného farbiva bol 9 X haotnostnýeh. Napu-čad objea sletovaného gélu chroaolytlckej hydroxyetylcelulózy bol 10 al.g”1. Přiklad 3.

Postupuje sa tak, ako je uvedené v přiklade 1 s týa rozdleloa, že naalesto etano-lu sa použil metanol. Získaný gél chroaolytlckej hydroxyetylcelulózy obsahoval 7,2 Xhmotnostného navlazaného farbiva, napučad objea gélu bol 14,8 al.g”1. Přiklad 4.

Postupuje sa tak, ako je uvedené v přiklade 2, s týa rozdleloa, že k sietovaniu sa použije hydroxyetylcelulóza, ktorej 1 X vodný roztok poskytuje vlskozltu 3500 mPa.s

prl 25 °C. Připravený sletovaný gél chroaolytlckej hydroxyetylcelulózy obsahoval 6,5 X haotnostnýeh navlazaného farbiva a napučad objem vo vodě mal 10,5 al.g”1.

Claims (1)

1. CS 269539 B1 3 Vynález ni použitie v bloteehnológiach při přesných sériových analýzach aktivitycelulázovej C* zložky, pri ilachteni mikroorganizmov produkujůcich celulézy C*, priprieayselných kultiváciach mi kroorganiznov, produkujůcich celulézy C* a pri dávkovániceluláz do krmných zmesi, ako aj pri analýze enzýnového vybavenia mikroflóry báchoro»vých štiav prežůvavcov. PREOMET VYNÁLEZU Sposob pripravy chromolytického substrátu na stanoveníe aktivity endo-beta-1,4--glukanohydrolázy vyznačený tým, že jeden hmotnostný diel hydroxyetylcelulózy sa vprvom stupni sletuje v 6 až 12,5 hmotnostných dielov roztoku vztiahnuté na hmotnosthydroxyetylcelulózy, připraveného z 5 až 9 hmotnostných dielov metanolu alebo etano-lu, jednoho až 5 hmotnostných dielov destilovanej vody, 0,01 až 0,07 hmotnostného die-lu hydroxidu sodného alebo draselného a 0,03 až 0,08 hmotnostného dielu sietovadla, svýhodou 2,2*-bis/oxiranytmetyl/éteru alebo 2-chlórometyloxiránu pri teplete 20 až 40°C po dobu 2 až 8 hodin, na čo v druhom stupni získaný gél sietovanej hydroxyetylce-lulózy sa neutralizuje a premyje vodou a v tretom stupni sa sletovaný gél hydroxy-etylcelulózy suspenduje v 9 až 15 hmotnostných dieloch destilovanej vody na hmotnostvýchodiskovej hydroxyetylcelulózy a pridajú sa 1 až 2 hmotnostné dlely vodného roz-toku, obsahujůceho 0,1 až 0,5 hmotnostného dielu hydroxydu sodného alebo draselnéhoa želej jeden hmotnostný dlel vodného roztoku 0,08 až 0,12 hmotnostného dielu farbi-va, s výhodou dvoj sodnéj soli kyseliny e-amino-S-l-S/sulfoetytsulfonyl/anilinol-ó--antrachinonsulfónovej a ďalej sa přidá 0,3 až 0,7 hmotnostných dielov tuhého chloridusodného alebo síranu sodného a táto zmes sa nechá reagovat pri teplote 15 až 30 °C podobu 1 až 3 hodin a na to sa v itvrtom stupni reakčná zmes zneutralizuje a chromoly-tieká hydroxyetylcelulóza sa dokonale vymyje od nezreagovaného farbiva najprv destilo-vanou vodou a potom zriedeným etanolom až koncentrovaným etanolom alebo acetonem a vy-suší volné na vzduchu alebo vakuovo pri 60 až 70 °C.