CS267799B1

CS267799B1 - The method of heat stabilizing the activity of the alpha-amylase enzyme

Info

Publication number: CS267799B1
Application number: CS888264A
Authority: CS
Inventors: Jiri Ing Csc Zemek; Viera Ing Povazanova; Ludovit Doc Ing Csc Polivka; Jozef Rndr Kocan
Original assignee: Zemek Jiri; Viera Ing Povazanova; Ludovit Doc Ing Csc Polivka; Jozef Rndr Kocan
Priority date: 1988-12-14
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 1990-02-12
Also published as: CS826488A1

Abstract

RieSonio sa týká sposobu tepelnej stabilizáoie enzýmu alfa—amylázy v prostředí vodnýoh roztokov orgoniokýoh zlúéenin a dvoma až tromi hydroxylovými skupinami za přítomnosti chloridu vápenatého, Postup má využitie v textilnom priemyslu pri odstraňovaní Škrobových Slíoht.The solution relates to a method of thermal stabilization of the alpha-amylase enzyme in the environment of aqueous solutions of organometallic compounds and two to three hydroxyl groups in the presence of calcium chloride. The procedure is used in the textile industry for removing starch stains.

Description

Vynález ea týká sposobu tepelnej stabilizácie aktivity technického preparátu alfa-amylázy alfa-1,4-glukan glukanohydroláza, EC 3.2.1.1., ktorý ea používá v textilnom priemysle v procese odstranovania Škrobových Šlicht.The invention relates to a process for the thermal stabilization of the activity of the technical preparation of alpha-amylase alpha-1,4-glucan glucan hydrolase, EC 3.2.1.1., Which ea uses in the textile industry in the process of removing starch sizings.

K odstraňovaniu Škrobových Šlicht sa použivajú nestabilizované preparáty alfa-amylázy produkované niektorými metofilnými kmeňmi rodu Baoillus. Nevýhodou týchto enzýmov je, že neznéšajú vyšSie teploty, pri teplotách nad 60 °C sa tepelne denaturujú a v dósledku toho strácajú svoje katalytické vlastnosti. Nie sú proto využitelné v procesech, kde odšlichtovnnie ea prevádza při teplotách vyššich ako 70 °C. Existujú pritoecelý rad metéd k stabilizáoii enzýmových aktivit. Tieto metody využivajú chemické, fyzikálně alebo fyzikálno-ohemické postupy k tepelnej etabilizáoii enzýmovýoh aktivit. Moderně koncepcia termostability enzýmov sa odvodzuje od dvoch základných teérií:Unstabilized alpha-amylase preparations produced by some metophilic strains of the genus Baoillus are used to remove Starch Sizings. The disadvantage of these enzymes is that they do not withstand higher temperatures, they are thermally denatured at temperatures above 60 ° C and, as a result, they lose their catalytic properties. They are therefore not usable in processes where the sizing plant is carried out at temperatures higher than 70 ° C. There are a number of methods available for stabilizing enzyme activities. These methods use chemical, physical or physicochemical procedures to thermally stabilize enzymatic activities. The modern concept of thermostability of enzymes is derived from two basic theories:

1. Zvýšené stabilita enzýmov sa připisuje spoluúčasti ňalšich zložiek buňky (lipidov, polysacharidov, proteínov apod.) na suboeluléraej úrovni. Výsledkem takto prirodzene imobilizovanýoh systémov, napr. v biomembránach Je skutečnost, že v týchto Struktúrach doohádza k uchovaniu katalyticky aktívnej konformácie aktívneho centra aj za teplotně extrémnych podmienok. Ovplyvnením interakci! enzýmového proteinu s nosičem možno reguloval počet konformačných fluktuácii a tým potlačil u enzýmov denaturačný přechod tak reverzibilnáho (Davidov, R.M. , Vesterman, B.G., Genkin, M.V., Blumenfeld, L.A., Krylov, O.V.: Dokl. Akad. Nauk SSSR, 256, 491, 1981) ako aj ireverzibilného charakteru (Martinek, K., Klibanov, A,M., Goldmacher, V.S., Berezin, I.V.: Biochim. Biophys. Aota, 485, 1 ’977).1. The increased stability of enzymes is attributed to the participation of other components of the cell (lipids, polysaccharides, proteins, etc.) at the suboellular level. As a result of such naturally immobilized systems, e.g. in biomembranes It is a fact that in these Structures the catalytically active conformation of the active center is preserved even under temperature extreme conditions. Influencing interaction! of a carrier protein with a carrier can regulate the number of conformational fluctuations and thus suppress the denaturing transition so reversible in enzymes (Davidov, RM, Vesterman, BG, Genkin, MV, Blumenfeld, LA, Krylov, OV: Dokl. Akad. Nauk SSSR, 256, 491, 1981) as well as of an irreversible character (Martinek, K., Klibanov, A, M., Goldmacher, VS, Berezin, IV: Biochim. Biophys. Aota, 485, 1977).

2, ϋ termofilných mikroorganizmoT sa zvýšená termostabilita enzýmov, katalytickou Specif itou analogických enzýmov produkovaných mezefilnými organizmami, odvodzuje od čiastočne pozměněnoj konformácie, ktorá na úrovni primárnéj Struktúry sa odlišuje od obdobných proteínov, produkovaných mezefilnými organizmami. Tak napr. termostabilná alfa-amylézá z Bacillus stearothermophilus (Manning, G.B., Cambell, L.L. : J. Biol. Chera, 236, 2952 196l) má na rozdiel od alfa-amylézy z Baoillus subtilis nezložeiru štruktúrou, blízkou tzv. random coil, u viacerých dalších enzýmov z termofilných orgonizmov sa popisuje právě globulárna štruktúra enzýmového proteinu. U enzýmov niektorých termostabilných mikoorganizmov sa popisuje niekedy rigidnejšia štruktúra proteinu, ani tento aspekt (ako sa však zistilo při detailněJšich štúdiách) nemá obecnú platnosl (Amelunxen, R.E., Murdock, A.L.: Microbial life at extreme enviroments, Kusher, D. ed., Academic Press, London, New York, San Francisco, 217, 1978).2, ϋ thermophilic microorganismsT, the increased thermostability of enzymes, catalytic specificity of analogous enzymes produced by mesophilic organisms, is derived from a partially altered conformation, which at the level of the primary structure differs from similar proteins produced by mesophilic organisms. For example. thermostable alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus (Manning, G.B., Cambell, L.L.: J. Biol. Chera, 236, 2952 196l) has, in contrast to alpha-amylase from Baoillus subtilis, a non-complexing structure close to the so-called random coil, for several other enzymes from thermophilic orgonisms, the globular structure of the enzyme protein is described. Enzymes of some thermostable microorganisms sometimes describe a more rigid protein structure, nor is this aspect (as found in more detailed studies) of general application (Amelunxen, RE, Murdock, AL: Microbial life at extreme enviroments, Kusher, D. ed., Academic Press, London, New York, San Francisco, 217, 1978).

Z uvedeného teoretického přehledu vyplývá, že existuje celý rad obecných technik, ktoré však v konkrétných případech stabilizácie onzýmov nie sú využivateíné z technických alebo ekonomických dovodov.The above theoretical overview shows that there are a number of general techniques, which, however, in specific cases of stabilization of enzymes are not usable for technical or economic reasons.

V případe topelnej stabilizácie aktivity alfa-amylézy produkovanej mezofilnými zástupeami rodu Baoillus, uvedené nedostatky odstraňuje postup pódia vynálezu, kterého podstata spočívá v tom, že enzýmový protein alfa-anrylázy o aktivitě 0,5 /Ukat až ImkatIn the case of heat stabilization of alpha-amylase activity produced by mesophilic representatives of the genus Baoillus, the above-mentioned process is eliminated by the process of the invention, the essence of which consists in the fact that the alpha-anrylase enzyme protein with activity 0.5 / Ukat to Imkat

O * , sa rozpustí vo vodnom roztoku o objeme 1 dnr organických di- alebo trihydroxy- zlučenin, napr. glykolu, dietylénglykolu, trietylénglykolu, glyoerolu a to Jednotlivo alebo ich zmesi o koncentrácii 0,1 až 10 % hmot. 3 obsahem chloridu vápenatého o koncentrácii 5 až 50 mmol.l^-’. Uvedeným zásahom sa teplotně optimum alfa-amy lázy predlží od 40 °C až po 100 °C, Výhodou uvedeného postupu Je Jeho technické nenáročnost, Jednoduchost prevedenia a skutočnosí, že teplotně zévislosl aktivity takto upravenoJ alfa—amylězy Vykazuje súvislú úroveň v širokom rozsahu teplot, prakticky od JO °C až po 100 °C. Výhodou Je aj ekonomické nenéročnosl použitých vstupných surovin.O *, is dissolved in an aqueous solution with a volume of 1 dnr of organic di- or trihydroxy compounds, e.g. of glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, glycerol individually or mixtures thereof in a concentration of 0.1 to 10% by weight. 3 containing calcium chloride in a concentration of 5 to 50 mmol.l ^- '. This advantage prolongs the temperature optimum of alpha-amylase from 40 ° C to 100 ° C. practically from JO ° C up to 100 ° C. The advantage is also the economic simplicity of the used raw materials.

cs 2Ó7 799 B1cs 2Ó7 799 B1

Příklad 1Example 1

Enzým alfa—amyláza (Baoillua subtilis), 2 g o aktivitě 0,5 ,ukat sa rozpustí vo vodnom roztoku monootylénglykolu (etán-1,2-diolj 1 dm^J) o koncentraci! 0,1 jí hmot, obsahujúcom chlorid vápenatý o konoentrácii 50 mmol.l ¹. Zatiaí čo póvodný enzým stráca katalytická aktivitu při expozici! na 90 °C po dobu 5 minát, alfa-amyláza upravená uvedeným spósobom si zachovává katalytická aktivitu bez poklesu s porovnáním s aktivitou pri JO °C aj při expozíoii na 100 °C po dobu 5 minát.The enzyme alpha-amylase (Baoillua subtilis), 2 go activity 0.5, ukat is dissolved in an aqueous solution monootylénglykolu (ethane-1,2-dm ^J diolj 1) hydrochloride! 0.1 wt.%, Containing calcium chloride with a concentration of 50 mmol.l ¹ . While the original enzyme loses catalytic activity upon exposure! at 90 ° C for 5 minutes, the alpha-amylase treated in this way retains its catalytic activity without decreasing compared to the activity at 10 ° C even when exposed to 100 ° C for 5 minutes.

Příklad 2Example 2

Enzým alfa-amyláza X Bacillus licheniformií. ! g o aktivitě i mkat sa rozpustí vo vodnom roztoku diotylónglykolu (2,2'-bis/etonol/éter; 1 dm-¹) o konoentrácii 5 £ hmot, obsahujúoom chlorid vápenatý o konoentrácii 10 mmol.l^- . Zatiaí -δο povodný enzým stráca svoju aktivitu při expozíoii na 85 °C po dobu 5 minát, alfa-amyláza upravená uvedeným spósobom si zachovává svoju katalytická aktivitu bez poklesu s porovnáním s aktivitou při JO °C aj pri expozíoii na 100 °C po dobu 10 minát.Enzyme alpha-amylase X of Bacillus licheniformia. ! To activity, mkat is dissolved in an aqueous solution of diotylene glycol (2,2'-bis / ethanol / ether; 1 dm- ¹ ) with a concentration of 5% by weight, containing calcium chloride with a concentration of 10 mmol.l ^- . While the flood enzyme loses its activity when exposed to 85 ° C for 5 minutes, the alpha-amylase treated as such retains its catalytic activity without decreasing compared to the activity at 10 ° C even when exposed to 100 ° C for 10 minutes. minate.

Příklad JExample J

Enzým alfa-amyláza z Bacillus subtilis, 1,5 β o aktivitě 50 ,ukat sa rozpustí vo vodnom roztoku triotylónglykolu ( 1,8-dihydroxy-3,6-dioxa-oktári) 1 dm^J) o konoentrácii 10 hmot, obsahujácom chlorid vápenatý o konoentrácii 5 mmol.l^-1, Zatiaí čo póvodný enzým stratil aktivitu při oxpozícii na 90 °C po dobu 5 min., alfa-amyláza upravená uvedeným spósobom si zachovává svoju katalytická aktivitu bez poklesu s porovnáním a aktivitou pri 30 °C aj při expozíoii na 100 °C po dobu 5 minát.The enzyme alpha-amylase from Bacillus subtilis, 1.5 β with activity 50, is dissolved in an aqueous solution of triotylene glycol (1,8-dihydroxy-3,6-dioxa-octar) (1 dm ^J ) at a concentration of 10 wt., Containing calcium chloride At a concentration of 5 mmol.l ^-1 , while the original enzyme lost its activity when oxposed at 90 ° C for 5 min, the alpha-amylase treated in this way retains its catalytic activity without decreasing compared to the activity at 30 ° C even at exposure to 100 ° C for 5 minutes.

Příklad 4Example 4

Postupuje sa pódia příkladu 1, s tým rozdielom, že sa použije alfa-amyláza z Bacillus 3tearothermophilus, 2 g o aktivitě 10 /Ukat a k stabilizéoii namiesto monootylénglykolu sa použije glyoerol.The procedure of Example 1 was followed, except that alpha-amylase from Bacillus 3thearothermophilus, 2 g with an activity of 10.

Příklad 5Example 5

Postupuje sa podlá příkladu 2 s tým rozdielom, že sa k stabilizáoii použije ekvimoláma zmes monoetylénglykolu, dietylénglykolu, trietylánglykolu a glyoerolu o úhrnnej koncontráoii 5 jí hmot. Enzým alfa-amyláza stabilizovaný v uvedenom prostředí si zachovává svoju enzýmovú aktivitu bez poklesu aj pri expozíoii na 100 °C po dobu 10 mírnit.The procedure of Example 2 is followed, except that an equimolar mixture of monoethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol and glycerol with a total concentration of 5% by weight is used for stabilization. The alpha-amylase enzyme stabilized in said medium retains its enzyme activity without decreasing even when exposed to 100 ° C for 10 minutes.

Vynález má využitie v prooese stabilizáoie alfa-amylázovej aktivity voči účinku vyšších teplot, například pře proces odstranovania škrobových šlicht při zvýšenaj teplote,The invention has utility in the process of stabilizing alpha-amylase activity against the effects of higher temperatures, for example in the process of removing starch sizings at elevated temperatures.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

A process for the thermal stabilization of alpha-amylase activity, characterized in that the alpha-amylase enzyme protein with an activity of 0.5 .mu.m to 1 mcat is dissolved in an aqueous solution of 1 dnP of organic di- or trihydroxy compounds, e.g. glycol, i.e. ethane-1,2-diol, diethylene glycol, i.e. 1,5-dihydroxy-3-oxapentane, triethylene glycol, i.e. 1,8-dihydroxy-3,6-dioxa-octane, glyoerol, singly or in any mixture with a concentration of 0.1 to 10% by weight, with a calcium chloride content of 5 to 50 mmol.l ^-1 .