CS265006B1 - Způsob přípravy zmobilizovaných mikrobiálních a rootlinnýcb buněk a enzymů - Google Patents

Abstract

Způaob imobilisace mikrobiálních a rostlinných buněk a enzymů do polymerní matrice spočívá v tom, So ao mikrobiální, popřípadě rostlinná buňky nebo enzymy zhomogcnizují při teplotě 29 až 35 °C 3 polymervií matricí, připravenou reakcí epoxydovc pryskyřice dianového typu a arainopolyethy.te/ioxiáu v molárním poměru 1 : 0,2 až 2 při teplotě 10 až 120 °C po dobu 0,2 až óO h, po homogenizaci pokračuje polymerační reakce ječte po dobu 4 až 24 ho i pří teplotě 25 až 55 °C, vzniklý prouukt ae mechanicky upraví na požadovanou velikost částic a promyje se pufrem.

Description

Vynález se týká přípravy imobilizovaných mikrobiálních buněk bakterií, kvasinek, vláknitých hub, rostlinných buněk a enzymů, který spočívá v zabudování připravených buněčných populací a roztoků enzymů do polymerní matrice.

Ve vývoji způsobu přípravy preparátů imobilizovaných enzymů a enzymových systémů představuje imobilizace celých buněk jejich producentů směr, kterému je v současné době věnována pozornost především pro značné funkční a operativní výhody®

Dosud známé způsoby přípravy preparátů imobilizovaných buněk obecně vycházejí z metod imobilizace čistých enzymů a lze je rozdělit do následujících kategorií:

a/ vazba buňky fyzikálním zachycením v gelu, membráně nebo mikropouzdru;

b/ vazba buňky adsorbcí na ionex nebo biospecifický adsorbent biologické povahy;

c/ vazba buňky kovalentní vazbou na pevný nosič;

d/ vznik stabilních buněčných agregátů.

Žádná z metod uvedených kategorií není ideální a její volba je podřízena druhu imobilizováného biologického materiálu a řadě dalších kriterií. Obecnou nevýhodou zakotvení buněk na povrchu nosiče je jejich snadný mechanický otěr, snadné uvolňování potomstva v případě reprodukce,,zakotvených buněk a ekorxo-, micky nákladná příprava nosiče. Zabudování buněk do matrice určitého polymeru je v případě nejčastěji používaných materiáLů provázeno jejich omezenou stabilitou, závislostí na dovozu po- _:užitých monomerů, negativními fyziologickými vlivy a negativním vlivem výrazné difůzní bariery, kterou tyto materiály obvykle vytvářejí. Uvedené nedostatky v imobilizací celých buněk odstra ňuje předkládaný vynález.

265 006

Podle vynálezu podstata imobilizace nepermeabilizováných i permeabilizovaných buněk bakterií, kvasinek, vláknitých hub, buněk rostlinných i roztoků enzymů spočívá v tom, že se mikrobiální, popřípadě rostlinné buňky nebo enzymy zhomogenizují při teplotě 25 až 35 °G s polymerni matricí, připravenou reakcí epoxydové pryskyřice dlaňového typu a aminopolyethylenoxidu. v molárním poměru 1:0,2 až 2 při teplotě 10 až 120 °C po dobu 0,2 až 60 h, po homogenizaci pokračuje polymerační reakce ještě po dobu 4 až 24 hod při teplotě 25 až 35 °G, vzniklý produkt se mechanicky upraví na požadovanou velikost částic a promyje se pufrem. Polymerni matrice je tvořena reakcí 28 až 65 hmot» % epoxydové pryskyřice dianového typu a 70 až 30 hmot. % aminopolyethylenoxidu. Jako epoxydové pryskyřice dianového typu je vhodné použít adiční produkt bisfenolu A a epichlorhydrinu o molekulové hmotnosti 301 až 2 500 a jako aminopolyethylenoxid lze použít , Cú -diaminopolyethylenoxid o molekulové hmotnosti 208 až 2 400. Do polymerni matrice se zabudovává 0,1 až 30 hmot. % aktivní biosložky.

Na epoxydovou složku dianového typu se působí aminopolyethylenoxidem v molárním poměru 1:0,2 až popřípadě v přítomnosti urychlovače polyadiční reakce při teplotě 10 až 120 °C po dobu 0,2 až 60 hodin, to je do vzniku viskózní hmoty předpolymeru, do které se pak zamíchá biologický materiále Polymerace déle probíhá při teplotě 25 až 35 °C po dobu 4 až 24 hodin. Reakce probíhá při teplotě 10 až 120 °C po dobu 2 až 6 hodin, a to v závislosti na typu složek a jejich poměru_o

Nejúčinnějšími urychlovači polyadiční reakce jsou organické dusíkaté látky^ jako je. guanidin, hydrazin, imidazol, pyridin a jeho deriváty, dále hexamethylentetramin Použitím uvedených urychlovačů se polymerační doba tvorby polymerni matrice zkrátí řádově 2 až 5x· V tomto prvním stupni se získá silně viekózní hmota předpolymeru, která se ochladí, respektive temperuje při teplotě 30 až 36·· °C po. dobu, 0,5 až 1 hodinu a pak se do takto upravené hmoty přidá suspenze biologického materiálu v pufru a dokonale zhomogenizuje mícháním. Zhomogenizovaná směs ještě dále polymeruje při teplotě 30 až 36 °G po·dobu

265 tu6 až 24 h, kdy vzniká konečný produkt, jehož tvar odpovídá tvaru formy, resp. nádoby, ve které byl produkt připraven.

Gelovitá hmota obsahující vázaný biologický materiál v polymerní matrici se pak zpracovává na požadovaný tvar řezáním nebo drcením, promyje se pufrem, a tím je připraven preparát imobilizováného biologického materiálu.

Účinek tohoto způsobu imobilizace celých buněk spočívá ve vyloučení izolace a purifikace enzymů a enzymových systémů a v jejich zachování v intracelulárním prostředí průmyslově významné biochemické aktivity, zaručuje optimální podmínky pro vlastní enzymovou reakci a izolaci enzymu a chrání enzymový systém od negativních vlivů extracelulárního prostředí,, Použitý polymerní materiál je fyziologicky inertní, nevytváří výraznou difuzní barieru, je stabilní v jakémkoliv kultivačním prostředí a v širokém rozsahu teplot a pH. Jeho příprava vychází z firemních materiálů a probíhá ve fyziologicky výhodných podmínkách. Preparát imobilizováných buněk je možno připravit v libovolném tvaru částic a v žádané velikosti. V případě, že preparát imobilizovaných buněk připravený podle vynálezu je aplikován v prostředí umožňujícím reprodukci zakotvených buněk, je možné částice preparátu pokrýt vrstvou použitého polymeru neobsahujícího buňky a tímto způsobem zamezit uvolňování buněk potomstva zabudované buněčné populace.

Způsob přípravy preparátu zmobilizovaných bunék podle vynálezu zajišťuje homogenní distribuci biologického materiálu v celé hmotě polymerní matrice a který, je přístupný substrátům rozpuštěným ve vodném prostředí. Polymerní matrice je tvořena hydrofobní a hydrofilní složkou. Struku, pu nosiče bioloí gického materiálu, resp. polymerní matrici, je možno, modelovat.. a hustotu sítě upravovat molárním poměrem výchozích slcžek₀ Podle druhu a množství vázaného, resp. imobilizováného biomateriálu se polymerní matrice upravuje tak, aby se biologický materiál neuvolňoval a aby se dosahovalo jeho maximální aktivity,

265 006

- 4 Mechanické vlastnosti polymerního nosiče se řídí typem výchozích složek, to je hydrofobní a hydrofilní, jejich koncentrací, resp. molárním poměrem a jejich molekulovou hmotností. V zó~ . vislosti na uvedených podmínkách přípravy polymerního nosiče se jeho mechanické vlastnosti mění od měkké gelovité hmoty až po látky pevné a houževnaté až rohovité konzistence. Mechanické vlastnosti konečného produktu, to je imobilizovaného biologického materiálu jsou též ovlivňovány množstvím imobilizované aktivní složky a množstvím přidaného pufru.

Povrch částic imobilizovaných buněk připravených podle vynálezu je možno sterilovat chemickými a fyzikálně-chemickými prostředky a způsoby.

V dalším je vynález blíže objasněn na. příkladech, které vsak rozsah vynálezu nijak neomezují.

Příklad 1 g adičního bisfenolu A a epichlorhydřinu o molekulové hmotnosti 1 200 a 10 g íZ , áO-diaminopolyethylenoxidu o molekulové hmotnosti 1 600 bylo smícháno při teplotě 50 °C a směs ponechána při této teplotě po dobu 5 hodin. Viskozní tekutá hmota předpolymeru byla ochlazena na 55 °C a do ní zamíchána suspenze biologického materiálu. Tato zhomogenizována směs byla ponechána při 55 °C po dobu 10 hodin. Vzniklý produkt byl znracován mechanicky na potřebnou velikost částic, promyt pufrem a použit jako preparát zmobilizovaných buněk.

Příklad 2 g adičního produktu připraveného jako u příkladu 1. . o molekulové hmotnosti 501 bylo smícháno se 100 g frč , CO -diaminopolyethylenoxidu o molekulové hmotnosti 5 000 při teplotě 60 °C, ostatní jako u příkladu 1.

Příklad 5 g adičního produktu připraveného postupem popsaným u příkladu 1 o molekulové hmotnosti 1 200 a 15 g CXj, Cx? -diarninopolyethylenoxidu o molekulové hmotnosti 1 700 bylo smí5 265 006 cháno při teplotě 60 °C a ponecháno po dobu 3 hodin. Do vzniklé viskózni hmoty předpolymeru ochlazené na 33 °C byla zamíchána suspenze biologického materiálu v pufru a zhomogenizovaná směs byla ponechána po dobu 20 hodin při teplotě 33 °G. Ze vznik lé gelovité fólie o síle 3 mm byly vyřezány válečky o průměru 3 min a zality do polymerní hmoty připravené postupem popsaným v tomto příkladu, to je do polymerní hmoty bez buněk. Směs byla opět ponechána po dobu 16 hodin při teplotě 33 °G· Z takto připraveného gelu byly mechanicky vypreparovány válečky obsahující buňky, avšak s vnější obalovou polymerní vrstvou matrice bez buněk. Vzniklý produkt byl promyt pufrem a použit jako pre-. pařát imobilízováných buněk.

Příklad 4 g adičního produktu bisfenolu A a epichlorhydrinu o molekulové hmotnosti 600 a 11 g gxf , u/ -diaminopólyethylenoxidu o molekulové hmotnosti 500 bylo smícháno při teplotě 50 °C, ostatní postup byl jako u příkladu 1.

Příklad 5 g adičního produktu bisfenolu A a epichlorhydrinu o molekulové hmotnosti 1 500 a 25 g ,á4?~diaminopolyethylenoxi~ du o molekulové hmotnosti 1 680 bylo smícháno při teplotě 50 °G, dále bylo pokračováno jako u příkladu 1.

Příklad 6

Postupem uvedeným u příkladu 3 byly zmobilizovány 2 g buněčné pasty bakteriálního kmene Zymomonas mobilis, převedené do fosfátového pufru pH 7,0. Povrch částic získaného preparátu byl sterilizován ethanolem /90 obj. %/, a to opláchnutím nebo máčením po dobu 25 sekund. Částice preparátu byly přelity kompletním kultivačním mediem neobsahujícím zdroj uhlíku a ponechány botnat při 20 °C 6 h. Částice preparátu byly pofcsa staticky inkubovány v prostředí téhož sterilního media s glukosou při 30 °G, s opakovaným promícháváním náplně použitého reaktoru a pravidelnou výměnou.média v intervalu 30 h. preparát imobilizovaných buněk byl sledován jako producent ethanolu.

V tomto uspořádání činila průměrná maximální hladina ethanolu

265 006 v mediu 2,6 obj. %, a to po 50 h inkubace použitého preparátu. Kultivační prostředí nebylo kontaminováno volnými buňkami producenta ethanolu.

Příklad '(

Postupem uvedeným v příkladu 5 byly imobilizovány 2,0 g buněčné pasty kvasinkového kmene Saccharomyces cerevioiac, převedeno do citrenového pufru pH 5,0. Povrch částic získaného preparátu byl sterilizován jako v příkladu 6. Preparát byl použit jako producent ethanolu v uspořádání uvedeném v příkladu 6 s tím rozdílem, že bylo použito kompletní kultivační médium s glukosou pro kvasinkové kmeny· Průměrná maximální hladina ethanolu Činila 5,6 obj. % po 50 h kultivace₀ Kultivační prostředí nebylo kontaminováno volnými buňkami producenta ethanolu.

Příklad 8

Využití untracelulární enzymatické aktivity imobilizováných buněk je'podmíněno jejich permeabilizací, která byla v tomto j., .l t λ o j ρ v e léna *x c j.bu ne onu suspenze bym po 0,1 ml objemech nanášena na střed membránového filtru, přičemž každé následující nanesení bylo provedeno vždy po úplném odsátí média. Po nanesení 1 ml objemů byly filtry přeneseny na skleněnou desku a zachycené buňky byly vystaveny proudu teplého vzduchu o konstantní teplotě 60 °C po dobu 70 s. Permeabilizované buňky byly z povrchu filtrů smyty 0,05 K fosfátovým pufrem /pH 7,0/.

1,5 g vlhké hmoty takto permeabilizovaných buněk.bakteriálního kmene Escherichia coli, které byly zísuány kultivací v prostředí laktosy, bylo imobilizováno postupem uvedeným v příkladu 1. Částice preparátu byly přelity fosfátovým pufrem pH 7,0 a ponechány botnat ,4 h. Po tam byly staticky inkubovány v prostředí fosfátového pufru pil 7,2 s o-nítrofenyl-^X-D-galaktopyranosidem. Specifická aktivita takto připraveného a testovaného preparátu vázané /2 -galaktosidasy činila při teplotě 57 °C 12,5yimolu. o-nitrofenolu/min/mg vlhké hmoty částice preparátu.

Příklad 9

Suspenze buněk Kluyveromyces lactis, .které byly získány

- 7 265 006 kultivací v prostředí s laktosou byla v prostředí citranového pufru pH 5)0 vystavena účinku dimethylsulfoxidu /40 obj. %/ při teplotě 25 °C. Po 30 min kontaktu byly takto permeabilizované buňky promyty pufrem, separovány centrifugací a 1,5 g získané buněčné pasty bylo imobilizováno postupem uvedeným v příkladu 1.

Způsobem popsaným v příkladu 8 byly získané částice testovány jako preparát imobilizované kvasinkové -galaktosidasy. Specifická aktivita činila 10,5yumolu o-nitrofenolu/min/mg vlhké částice preparátu.

Příklad 10

Postupem uvedeným v příkladu 3 bylo imobilizováno 1,5 g pasty nepermeabilizováných buněk Escherichia coli, které byly získány kultivací v prostředí glukosy. Částice preparátu imobilizovaných buněk byly povrchově sterilizovány účinkem UV záření a pot«(ň přelity tryptosovým mediem a ponechány botnat 5 h při 20 °0. Částice byly pctcsu převedeny do prostředí tryptosového média s isopropylthio- ^/-D-galaktopyranosidem a za stálého míchání inkubovány při teplotě 37 °C 4 h. Částice preparátu byly separovány a převedeny do fosfátového pufru pH 7,0 s dimethylsulfoxidem /55 obj. %/ a při teplotě 30 °G inkubovány 45 min. Částice byly pctor4 převedeny do pufru bez dimethylsulfoxidu inkubovány 20 min, separovány a čerstvým pufrem promyty. Způsobem popsaným v příkladu 8 byly získané částice testovány jako preparát imobilizované bakteriální -galaktosidasy, jejíž syntéza byla indukována v již imobilizovaných buňkách. Specifická aktivita preparátu činila 8,2yumolu o-nitrofenolu/ /min/mg vlhké hmoty částice preparátu.

Příklad 11

Postupem uvedeným v příkladu 1 byly imobilizovány 2 g vlhké hmoty mycelia Asperillus oryzae_;, které bylo připraveno , kultivací v prostředí laktosy a permeabilizováno způsobem uvedeným v příkladu 9. Způsobem popsaným v příkladu 8 byly získané částice testovány jako. preparát imobilizované -galaktosidasy vláknité houby. Specifická aktivita činila 7,6 urnolú o-nitrofenolu/min/mg vlhké hmoty částice preparátů.

- 8 26b 006

Příklad 12 .

Postupem uvedeným v příkladu 2 byla imobilizována /9 -galaktosidasa ve formě bezbuněčného extraktu buněk Escherichia coli získaných kultivací v přítomnosti laktosy. Bezbuněčný extrakt byl připraven desin£egrací buněk, získaný homogenát byl centrifugován a separovaná rozpustná frakce byla imobilizována. Způsobem popsaným v příkladu 8 byly získané částice testovány jako preparát imobilizované technické β -galaktosidasy bakteriálního původu. Specifická aktivita částice činila 5,3/umolu o-nitrofenolu/min/mg vlhké hmoty částice preparátu.

Příklad 13

Postupem uvedeným v příkladu 3 bylo zmobilizováno 1,5 g buněčné pasty kmene Saccharomyces cerevisiae X3, který je extra čelulárním producentem bílkoviny zymocinu. Získané částice preparátu byly povrchově .sterilizovány účinkem UV záření a potof*) inkubovány v kompletním médiu' , jehož složení podmiňuje produkci zymocinu u volných buněk. Částice preparátu byly dále kultivovány za aktivní aerace při 28 °C. Po šesti hodinách kultivace byly částice preparátu odstraněny a filtrát kultivačního media byl testován jako hrubý preparát zymocinu. Aktivita přítomného zymocinu byla stanovena rhodamidovým testem podle Dr. V. Vondrejse. Paralelně byla testována schopnost extracelulární produkce zymocinu u stejného množství buněk téhož kmene, které nebyly vystaveny procesu imobilizace. Ostatní manipulace s touto buněčnou populací byly identické a stanovená kladina extrnceluiárního zymocinu byla označena jako 100 7 této souvislosti hladina zymocinu produkovaného preparátu imobilizovaných buněk producenta odpovídá 75 % hodnoty produkce stanovené v případě volných buněk.

Příklad 3.4

Postupem uvedeným v příkladu 1 bylo imobilizováno 2,5 g sedimentu rostlinných buněk Nicotiana tabacum. Částice preparátu byly přelity médiem podle kurashige a - Skoog a ponechány botnat při teplotě 20 °C 5 h. Po 4& h byla provedena mechanická.destrukce částic preparátu a hodnocen mikroskopický obraz náhodně uvolněných buněk. Bylo prokázáno, že prostředí póly- 9 265 006 měrní matrice nepodmiňuje destrukci buňky ani nevyvolává změny morfologie velkých rostlinných buněk_o

Claims (3)

1«. Způsob imobilizace mikrobiálních a rostlinných buněk a enzymů do polymerní matrice, vyznačující se tím, že se mikrobiální, popřípadě rostlinné buňky, nebo enzymy zhomogenizují při teplotě 25 až 55 °C s polymerní matricí, připravenou reakcí epoxydové pryskyřice dianového typu a aminopolyethylenoxidu v molárním poměru 1:0,2 až 2 při teplotě 10 až 120 °G po dobu 0,2 až 60 h, po homogenizaci pokračuje polymeracní reakce ještě po dobu 4 až 24 hod při teplotě 25 až 55 °C, vzniklý produkt se mechanicky upraví na požadovanou velikost částic a promyje se pufrem»

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že Částice imobilizovaných buněk nebo enzymů se obalí vrstvou polymerní matrice.

»

A.

I

5. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že se polymerní matrice připraví reakcí adičního produktu bisfenolu Δ a epichlorhydrinu o molekulové hmotnosti 501 až 2 500 a y, X -diaminopolyethylencxidu o 203 až 4 000.

molekulov ;mo tnosti

4. Způsob podle bodu 1 až 5 vyznačující se tím, že se polymerace provádí v přítomnosti urychlovače po merace, například guanidinu, hydrazinu, imidazolu, pyridinu .nebo hexaraethylentetraminuo