CS261460B1 - Vakcína proti trichofytoze koní a způsob její výroby - Google Patents

Abstract

Vakcína proti trichofytoze koní je biopreparét určený k injunoprofylaxi a imunoterapii trichofytozy koní. Vakcína obsahuje po naředění zředovačem 4 až 12 milionu konidií kmene Trichophyton equinum CCM P-787 v 1 cnr. Vakcinacní kmen má dobré imunogenní schopnosti, masívní tvorbu konidií a sníženou virulenci pro koně. K výrobě vakcíny je použita 9 až 17denní kultura tohoto kmene, pomnoženého na agarové živné půdě při 24 az 26 °C. Po homogenizaci kultury je ke vzniklé' suspenzi přidáno protekční lyofilizační médium. Vakcína je rozplněna do lékovék a lyofilizována. Při preventivním použití vakcíny ve veterinární praxi je zajištěna ochrana koní před onemocněním trichofytozou. V ohnisku trichofytozy koní se vakcína používá s terapeutickým cílem.

Description

Vynález se týká vakcíny proti trichofytoze koní a způsobu její výroby, Vakcína je určena k imunoprofylaxi a imunoterapii trichofytozy koní.

Onemocnění koní trichofytozou má v posledních letech u nás i v zahraničí stoupající tendenci. Nemocní koně jsou odvoláváni ze soutěží, aukcí a dostihů a jejich přísná izolace činí mnohé provozní a organizační potíže v chovech. K likvidaci této kožní nákazy koní je nutno vynaložit značné náklady na léčivé a dezinfekční prostředky. Závažná je také skutečnost, že onemocnění jé přenosné na lidi.

Dosud používané lokální terapeutické přípravky nepřinesly očekávaný efekt. V citlivé pokožce koní dochází často po jejich aplikaci k nežádoucím reakcím a ke vzniku dermatáz. Použitím léčivých prostředků se nezabrání vzniku nových trichofytických ložisek.

Vakcína k profylaxi trichofytozy koní bylo, připravena sovětskými autory (Sarkisov A.Ch., Petrovič S.V.: Pat. SSSR 130 7574 2/1969, pat. USA 4,229,434, Oct. 1980). Tato vakcína obchodního názvu S-P-l obsahuje virulentní lomen Trichophyton equinum, Po její aplikaci byly často zjištěny u koní postvakcinační reakce: bolestivý otok v místě aplikace vakcíny, zvýšení tělesné teploty až o 1,5 °C, zvířata byla poněkud skleslá a odmítala potravu /Petrovič S.V., Sarkisov A.Ch.: Veterinarija (Moskva), 1981, č. 9, s. 40-42/.

Podstatou našeho vynálezu je vakcína proti trichofytoze koní a způsob její výroby. Vakcína sa vyznačuje tím, že obsahuje po naředění zřecLovačem 4 až 12 milionů životaschopných lconidií kmene Trichophyton equinum CCM P-787 v 1 cm suspenze. Způsob výroby vakcíny se vyznačuje tím, že vakcinační lomen se kultivuje po dobu 9 až 17 dnů na agarové živné půdě při teplotě 24 až 26 °C, houbový porost se oddělí a homogenizuje ve fyziologickém roztoku, přidá se protekční lyofilizační médium, suspenze se rozplní, zmrazí a suší v lyofilizačním zařízení.

Předmět vynálezu, vakcína proti trichofytoze koní, je připravena z kmene Trichophyton equinum CCM P-787, který obsahuje změněnou genetickou informaci - mutaci, vyjádřenou avirulencí pro morčata a sníženou virulenoí pro koně. Po intramuskulární

- 2 261 460 aplikaci naší vakcíny nedochází k postvakcinačním komplikacím u vakoinovanýoh koní. V místě vpichu vakcíny nevznikají mykotická ložiska obsahující šupiny a krusty, které by mohly být potenciálním zdrojem další infekce. Předností naší vakcíny oproti vakcíně S-P-l je, že vedle velmi dobrého profylaktického účinku má i výrazný terapeutický efekt. Způsob výroby vakcíny proti trichofytoze koní umožňuje získat vyšší počet vakcinačních dávek než u vakcíny S-P-l při použití stejného množství kultivačních lahví.

Vakcína proti trichofytoze koní je určena k imunoprofylaxi a imunoterapii trichofyto*zy koní. Její dobrý profylaktický a terapeutický účinek byl potvrzen v čelenžních biologických pokusech a dále v chovech koní s výskytem dermatofytozy, vyvolané T. equinum, který je hlavním původcem kožních mykoz u koní.

Použitím vakcíny proti trichofytoze koní ve veterinární praxi dojde ke snížení nákladů, které bylo nutné vynaložit na léčbu koní postižených trichofyto*zou a na dezinfekci v ohnisku nákazy. Prevence trichofytozy koní účinnou vakcinaoí se příznivě projeví lve zdravotnictví, sníží se riziko profesionální infekce u ošetřovatelů a dalších pracovníků v chovech koní₀

Příklad 1 - výroba 60.000 dávek vakcíny

Vakcinační kmen T. equinum CCM P-787 byl inokulován na sterilní agarovou živnou půdu složení: 20 litrů destilované vody,

1,5 litrů kanditního sladového výtažku, 322,5 g agaru, 107,5 g peptonu. Množství inokula jsme zvolili tak, že na 1 cm . povrchu pomnožovacího média bylo naočkováno 85 tisíc konidií výrobního kmene. Použité inokulum bylo vyšetřpváno kontrolním výsevem a inkubací na běžných živných půdách (masopeptonový agar a bujón při 20 a 37 °C, krevní agar při 37 °0 a Sabouraudův agar při 28 °C) na nepřítomnost jiné mikroflory.

Kultivační láhve s inokulovanou živnou půdou byly umístěny do termostatu při 24 °C ve vodorovné poloze. Po 9 ůnech byla kultivace ukončena. Narostlá kultura byla opatrně s'ejmuta s povrchu živného média takj aby neobsahovala zbytky agarové půdy. Homogenizace byla prováděna kuchyňským mixérem ve fyziologickém roztoku

261 460 po dobu 4 minut. Vzniklá suspenze byla, přelita přes řídkou gázu do skleněné láhve. K suspenzi výrobní kultury ve fyziologickém roztoku jsme přidali stejné množství protekčního lyofilizačního 'média složení 7»5 g sacharozy a 5 g želatiny na 100 cm⁵ destilované vody.

Koncentrát vakcíny byl důkladně promíchán a odebrali jsme vzorek pro mikroskopické a kultivační vyšetření. Odebraný vzorek byl ředěn fyziologickým roztokem v předpokládaném poměru rozplnění vakcíny a v počítací komůrce byl zjištěn počet konidií. Ředěný vzorek obsahoval 6 milionů konidií v 1 cnr⁵.

Koncentrát vakcíny byl rozplněn ve stanoveném množství do pěnicilinových lékovek a lyofilizován v lyofilizačním zařízení. Po usušení vakcíny byly lékovky uzavřeny gumovými lyofilizačními zátkami ve vakuu₀

Před použitím byla, lyofilizovaná vakcína ředěna zřeSovačem A (složení: 8 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného,

2,38 g sekundárního fosforečnanu sodného, 0,2 g kyselého fosforečnanu draselného, 1 litr destilované vody).

S vakcínou byly prováděny následující kontrolní zkoušky:

1. Zkouška čistoty kultury a bakteriální sterility: inokulací 0,1 cnr vakcíny na krevní agar, masopeptonový agar a bujón, glukozový agar, Sabouraudův agar a posouzením po 24 h, 48 h, 72 h a 7 d inkubace při 37 °C» po 10 dnech inkubace při 20 °C a po 12 d inkubace při 28 °C.

2« Zkouška neškodnosti: 2,5 cm vakcíny bylo aplikováno i.m. dvěma králíkům živé hmotnosti 2,5 kg. Zdravotní stav zvířat byl sledován po dobu 14 dnů, nedošlo ani k úhynu ani k celkovým nebo místním klinickým změnám.

3. Zkouška na vakuum: tlak byl menší než 2,66 Pa.

4. Stanovení koncentrace vodíkových iontů: pH vakcíny bylo 6,5.

5. Stanovení počtu životaschopných vegetativních forem vakcinačního kmene: zjistili jsme plotnovou diluční metodou na Sabouraudově agaru. Vakcína obsahovala v 1 cm⁵ 5,5 milionů životaschopných vegetativních forem vakcinačního kmene.

- 4 ·*

261 460

Příklad 2 - lyofilizace vakcíny po ukončení zkoušek čistoty - kultury a bakteriální sterility . Výroba vakcíny proběhla jako v příkladu 1 v podmínkách sterilního prostředí,. Veškerý materiál a pomůcky, použité k výrobě vakcíny, byly sterilizovány v autoklávu při přetlaku 60 až 80 kPa. Sterilizace byla provedena dvakrát po dobu 30 minut.

K pomnožení vakcinačního kmene CCM P-787 jsme použili sladinkový agar složení: 20 litrů destilované vody, 2 litry kanditního sladového výtažku, 330 g agaru, 110 g peptonu. pH jsme upravili na 6,6. Inokulace byla provedena rozočkováním suspenze výrobního kmene po povrchu živného média v množství 450 tisíc p

konidií na 1 cm povrchu. Po 17 dnech inkubace při teplotě 26 °C bylu* sporulující kultura homogenizována ve fyziologickém roztoku a homogenizát byl filtrován přes gázu do skleněné láhve. Ochranné lyofilizační médium jsme přidali v takovém množství, že výslediiá koncentrace sacharózy byla 7,5 Získaný koncentrát vakcíny byl po odebrání vzorku umístěn do mrazničky při teplotě -28 °C po dobu 12 dnů. Po vyhodnocení zkoušky čistoty kultury a bakteriální sterility byl koncentrát rozmražen

-i a rozplnšn do lékovek tak, že 1 cm zředěné vakcíny obsahoval 12 milionů konidií vakcinačního kmene.

Způsob lyofilizace vakcíny a provedení kontrolních zkoušek byly stejné jako v příkladu 1.

Doba exspirace vakcíny je 1 rok, skladování je přípustné v temnu a suchu při teplotě 2 až 8 °C.

Claims (2)

1« Vakcína proti trichofytoze koní, vyznačující se tím, že obsahuje po naředění zřecLovačem 4 až 12 milionů životaschopných konidií kmene s nízkou virulencí Trichophyton equinum (Matruchot et Dassonville) Gedoelst 1902 CCM P-787 v 1 co? vzniklé suspenzeo

2. Způsob výroby vakcíny podle bodu 1, vyznačující se tím, že výrobní kmen Trichophyton equinum se inokuluje v množství 85.000 až 45O_eOOO konidií na 1 cm . povrchu živné agarové půdy, kultivuje se po dobu 9 až 17 dnů při teplotě 24 aŽ 26 °C, získaný porost se homogenizuje ve fyziologickém roztoku, přidá se protekční lyofilizační médium, vakcína se rozplní, zmrazí na -40 až -50 °C po dobu alespoň 6 hodin a suší v lyofilizačním zařízení₀