CS259178B1

CS259178B1 - Process for preparing gamma-globulin

Info

Publication number: CS259178B1
Application number: CS865084A
Authority: CS
Inventors: Jiri Sourek; Ludmila Zelenkova
Original assignee: Jiri Sourek; Ludmila Zelenkova
Priority date: 1986-07-04
Filing date: 1986-07-04
Publication date: 1988-10-14
Also published as: CS508486A1

Abstract

Řešení ae týká způsobu přípravy gamaglobulinu z nové výchozí suroviny, tj. z odtučněné a dekaseinované kolostrální formy mateřského mléka savců, imunizovaných před porodem bakteriálními imunogeny, z nichž jeden je společný mikroorganismům čeledí Enterobacteriaceae. tedy. z tzv. mleziva, a to tak, že se z výchozí suroviny nejprve vysráží síranem amonným frakce , surového gama-globulinu, ta se po odsolení a odstranění balastů, které nemají charakter protilátek, znovu frakcionuje síranem amonným, potom se frakce purifikovanóho gama-globulinu odsolí a získaný roztok se lyofilizuje. Takto připravený gama-globulin slouží k protiinfekční ochraně novorozených mláSat hospodářských zvířat v prvních dnech jejich života.The solution ae relates to a method of preparing gamma globulin from a new starting material, i.e. from the defatted and decaseinated colostral form of breast milk of mammals, immunized before birth with bacterial immunogens, one of which is common to microorganisms of the Enterobacteriaceae family. i.e. from the so-called colostrum, in such a way that a fraction of crude gamma globulin is first precipitated from the starting material with ammonium sulfate, which, after desalting and removal of ballasts that do not have the character of antibodies, is fractionated again with ammonium sulfate, then the fraction of purified gamma globulin is desalted and the obtained solution is lyophilized. The gamma globulin prepared in this way serves for the anti-infective protection of newborn young livestock in the first days of their life.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy gama-globulinu, a to z nové dosud nepopsané výchozí suroviny, tj. z odtučněné a dekaseinované kolostrální formy - mleziva - mateřského mléka savců, imunizovaných před porodem bakteriálními imunogeny, z nichž jeden je společný mikroorganismům čeledi Enterobacteriaceae·The invention relates to a process for the preparation of gamma-globulin from a novel raw material not yet described, i.e., defatted and declassified colostral form - colostrum - of breast milk of mammals immunized prior to delivery with bacterial immunogens, one of which is common to microorganisms of the Enterobacteriaceae family.

Jak je známo, získávají se globuliny, tedy i gama globulin, specifická, v klinické praxi užívaná léčiva, z krevního séra, což je surovina, zejména v případě lidského séra, drahá a omezeně přístupná.As is well known, globulins, including gamma globulin, specific drugs used in clinical practice, are obtained from blood serum, a raw material, particularly in the case of human serum, expensive and limited in access.

Je známo, že v mateřském mléce savců, zejména v jeho kolostrální formě, tzv. mlezivu, je daleko vyěěí obsah protilátek než v séru /přibližně 16krát vyěěí/, což znamená, že mateřské mléko, resp. jeho kolostrální forma, tedy představuje vydatný zdroj věech druhů protilátek, hlavně proti střevním chorobám, jenž může u novorozených mláďat hospodářských zvířat hrát významnou roli účinné protiinfekční ochrany v prvních hodinách a dnech života. Především u novorozených telat, a to v prvních pěti dnech jejich života, kdy mohou být ztráty značně vysoké.It is known that in mammalian breast milk, especially in its colostral form, the so-called colostrum, the antibody content is far higher than in serum (approximately 16 times higher), which means that breast milk, respectively. its colostral form, therefore, is a powerful source of all kinds of antibodies, mainly against intestinal diseases, which can play an important role in effective infectious protection in the early hours and days of life in newborn livestock. Especially in newborn calves, in the first five days of their lives, when the losses can be quite high.

Gama-globulin/připravený z odtučněné a dekaseinované kolostrální formy mateřského mléka savců, jejíž protilátková aktivita je navíc posílena imunizací vhodnými vakcinami, například bakteriálními imunogeny, z nichž jeden je společný mikroorganismům čeledi Enterobacteriaceae, aplikovanými v době březosti, může podstatně ovlivnit přežití novorozených mláďat se sníženou schopností sání, nebo jinak oslabených. Podávání dostatečných dávek gama-globulinu /popřípadě dalěíoh imunoglobulinů/, připraveného z kolostrální formy mateřského mléka a upraveného do vhodné aplikační formy, může zabránit velkým národohospodářským ztrátám.Gamma globulin / prepared from defatted and declassified colostral form of mammalian breast milk, whose antibody activity is additionally enhanced by immunization with suitable vaccines, such as bacterial immunogens, one of which is common to microorganisms of the Enterobacteriaceae family, applied during pregnancy may significantly affect the survival of newborn pups. reduced suction ability, or otherwise weakened. Administration of sufficient doses of gamma-globulin (or other immunoglobulins), prepared from the colostral form of breast milk and adjusted to a suitable dosage form, can prevent large economic losses.

Mléko savců, zejména v době porodu a po porodu, kdy přechází v mlezivo, se stává účinným obranným protiinfekčním mechanismem, který mohou matky, kromě vlastního přenosu protilátek placentámí oestou, poskytnout navíc nové generaci.Mammalian milk, especially at the time of delivery and postpartum, when it becomes colostrum, becomes an effective defensive anti-infective mechanism that mothers, in addition to the actual transmission of antibodies by the placenta oest, can provide a new generation.

Ovšem mléko savců, zejména jeho kolostrální forma, obsahuje značné množství tuku a kaseinu, jež je zapotřebí v co největší míře odstranit. Při izolaci gama-globulinu je však nutno dbát především toho, aby se při odstraňování balastních látek nesnižoval jeho obsah a aby nenastala degradace a tím i celkový pokles biologického účinku.However, mammalian milk, especially its colostral form, contains a considerable amount of fat and casein, which should be removed as much as possible. However, when isolating gamma-globulin, care must be taken not to reduce the content of the ballast substances and to prevent degradation and thus an overall decrease in the biological effect.

Protože až dosud nebyl Znám způsob přípravy gama^globulinu z kolostrální formy mléka savců, účelně imunizovaných před porodem, bylo nutno takový způsob vyvinout, samozřejmě s přihlédnutím ke specifické povaze výchozí suroviny. Bylo nutno také zvolit vyhovující podmínky, které by umožnily co nejrychlejší Izolaci gama-globulinu a jeho purifikaci do ekonomicky únosného stupně čistoty, při zachování biologické aktivity a minimálním snížení jeho původního obsahu. Způsob přípravy gamaglobulinu podle vynálezu se podstatně liší od běžného způsobu přípravy z krevního séra savců.Since there has not been known to date a method for preparing gamma globulin from colostral milk form of mammals expediently immunized before delivery, such a method has to be developed, of course, taking into account the specific nature of the starting material. It was also necessary to select suitable conditions that would allow the isolation of gamma-globulin as quickly as possible and its purification to an economically viable degree of purity, while maintaining biological activity and minimizing its original content. The process for the preparation of gamma globulin according to the invention differs substantially from the conventional process for the preparation of mammalian blood serum.

Vynález se tedy týká způsobu přípravy gama-globulinu z odtučněné a dekaseinované kolostrální formy - mleziva - mateřského mléka savců, imunizovaných před porodem bakteriálními imunogeny, z nichž jeden je společný mikroorganismům čeledi Eníerobacteriaceae, jehož podstata spočívá v tom, že se z výchozí suroviny při hodnotě pH 6,5 až 7,5 vyloučí přídavkem nasyceného vodného roztoku síranu amonného ve formě sraženiny. frakce surového gama-globulinu, která se po rozpuštění ve vodě dialýzuje proti vodě při teplotě nejvýše 10 °C, ze získaného roztoku se fyzikálně, například filtrací s aktivním uhlím nebo odstředěním a/nebo chemicky, zejména působením vyšší kvartémí amoniové soli, například dimethyllaurylbenzylamůniumbromidu, odstraní balasty, potom se při hodnotě pH 6,5 až 7,5 přídavkem nasyceného vodného roztoku síranu amonného vyloučí purifikovaný gama-globulin, který se po rozpuštění ve vodě dialýzuje proti vodě při teplotě nejvýše 10 °C a nakonec se získaný roztok zbaví vody, například lyofilizací.The invention therefore relates to a process for the preparation of gamma-globulin from a defatted and decasinated colostral form - colostrum - of breast milk of mammals immunized prior to delivery with bacterial immunogens, one of which is common to microorganisms of the family Enerobacteriaceae. A pH of 6.5 to 7.5 is eliminated by the addition of a saturated aqueous ammonium sulfate solution as a precipitate. a crude gamma-globulin fraction which, when dissolved in water, is dialysed against water at a temperature of not more than 10 ° C, from the solution obtained is physically, for example by filtration with activated carbon or by centrifugation and / or chemically, in particular by treatment with a higher quaternary ammonium salt, e.g. remove ballasts, then, at pH 6.5 to 7.5, the addition of a saturated aqueous ammonium sulfate solution precipitates purified gamma-globulin, which, when dissolved in water, dialyses against water at a temperature of not more than 10 ° C and finally frees the resulting solution, for example by lyophilization.

Způsobem podle vynálezu lze získat za technologicky přijatelných podmínek významné léčivo z dostupné a levné výchozí suroviny, ve vyhovující čistotě a dobrých výtěžcích.According to the process of the invention, an important drug can be obtained from technologically acceptable conditions from an available and inexpensive starting material in satisfactory purity and good yields.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujícího příkladu provedení, který samozřejmě není omezen . 259178Further details of the process according to the invention are given in the following non-limiting example. 259178

- 3 pouze na podmínky v něm uvedené, nýbrž dovoluje i různé obměny, pokud je lze zahrnout do požadovaného rozsahu ochrany.- 3 only to the conditions set out therein, but also permits various variations as long as they can be included within the scope of protection sought.

Kravské mléko, získané ihned po porodu /tzv. první nádoj/, se odstřeluje na chlazené centrifuze při 3000 ot/min po dobu 30' min. Oddělená vrstva tuku se kvantitativně odstraní. Potom se odtučněné mléko okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 4,2 až 4,5 a nechá se stát pří teplotě místnosti přes noc. Druhý den se mléko odstředí v chlazené centrifuze při 3000 ot/min po dobu 40 min, sediment /kasein/ se odstraní a supernatant se dále zpracovává.Cow's milk, obtained immediately after delivery / the first vessel (1) is centrifuged in a chilled centrifuge at 3000 rpm for 30 min. The separated fat layer is quantitatively removed. Thereafter, the skimmed milk is acidified to pH 4.2-4.5 with hydrochloric acid and allowed to stand at room temperature overnight. The next day, the milk is centrifuged in a chilled centrifuge at 3000 rpm for 40 min, the sediment (casein) is removed and the supernatant is further processed.

800 ml supematantu se upraví 0,\_N hydroxidem sodným na pH 7,0, přidá se stejný objem nasyceného vodného roztoku síranu amonného /74,5 g síranu na 100 ml destilované vody/ a míchá se 60 min při teplotě místnosti. Potom se nechá ustát v lednici přes noc a odstředěním za chlazení /3000 ot/min/ po dobu 30 min se izoluje sediment; supernatant se odstraní. Sediment surového gama-globulinu se rozpustí v malém množství destilované vody a proti ní se dialýzuje při 4 °C tak dlouho, až výsledek zkoušky dialyzátu v dialyzační trubici na přítomnost amonných a šíráno« vých iontů je negativní. Dialýza trvá přibližně 5 až 7 dní, při dvou až třech výměnách destilované vody a za občasného promísení obsahu dialyzačních trubic v průběhu dne.800 ml of the supernatant was adjusted to pH 7.0 with 0.1 N sodium hydroxide, an equal volume of saturated aqueous ammonium sulfate solution (74.5 g of sulfate per 100 ml of distilled water) was added and stirred for 60 min at room temperature. It is then left to stand in the refrigerator overnight and sediment is collected by centrifugation under cooling (3000 rpm) for 30 min; the supernatant was discarded. The crude gamma-globulin sediment is dissolved in a small amount of distilled water and dialysed against it at 4 ° C until the result of the dialysate test in the dialysis tube for the presence of ammonium and propagated ions is negative. Dialysis lasts approximately 5 to 7 days, with two to three changes of distilled water and occasionally mixing the contents of the dialysis tubes throughout the day.

Tekutina z dialýzy se zalkalizuje 0,1 NJtiydroxidem sodným na pH 8,0 a přidá se 10# vodný roztok dimethyllaurylbenzylamoniumbromidu /nebo obdobné kvartérní amoniové soli/ v množství 45 ml na 1 litr dialyzátu /potřebné množství kvartérní amoniové soli se stanoví předem elektroforetickým testem/. Směs se zahřeje na vodní lázni na 40 °C, po dosažení této teploty se ihned z lázně odstraní a nechá stát při teplotě místnosti do druhého dne. Druhý den se případně vyloučený sediment balastních látek odstředí za chlazení /3000 ot/min po dobu 30 min/ a supernatant se okyselí 0,l_N kyselinou chlorovodíkovou na pH 5,0 až 5,5 /optimum 5,3/. Do takto upraveného supernatantu se přidá 5 # hmot. práškového aktivního uhlí. Po důkladném promíchání se nechá stát přes noc při teplotě místnosti a druhý den se uhlí odstraní jednak odstředěním /3000 ot/min po dobu 30 min/ jednak filtrací supernatantu přes Seitzův filtr. Pil259178The dialysis fluid is made alkaline with 0.1 N sodium thyroxide to pH 8.0 and a 10 # aqueous solution of dimethyllaurylbenzylammonium bromide (or a similar quaternary ammonium salt) is added (45 ml per 1 liter of dialysate). . The mixture was heated in a water bath to 40 ° C, after reaching this temperature, immediately removed from the bath and allowed to stand at room temperature the next day. On the next day, the possibly deposited ballast sediment is centrifuged under cooling (3000 rpm for 30 min) and the supernatant is acidified with 0.1 N hydrochloric acid to pH 5.0-5.5 (optimum 5.3). To the treated supernatant was added 5 wt. powdered activated carbon. After thorough mixing, it is allowed to stand overnight at room temperature and the next day the coal is removed by centrifugation (3000 rpm for 30 min) and by filtration of the supernatant through a Seitz filter. Pil259178

- 4 trát se upraví Ο,Ι^Ν hydroxidem sodným na pE 7,0· Neutrální roztok se vysráží stejným objemem nasyceného vodného roztoku síranu amonného, který se přidává po kapkách, za stálého míchání. Míchá se 60 min při teplotě místnosti a potom se směs uloží přes noc do lednice. Druhý den se směs za chlazení odstřečuje při 3000 ot/min po dobu 30 min. Po odstranění seperaatantu se sediment, tj. purifikovaný gama- gl obul in, rozpustí v malém objemu destilované vody a dialýzuje se za podmínek uvedených výše. Po posledním odstředění se supernatant lyofilizuje. Výtěžek gama^gl obul inu z 800 ml výchozího upraveného mléka je 11, 2 g, jeho elektroforetická čistota je 97The pH of the neutral solution is precipitated with an equal volume of a saturated aqueous solution of ammonium sulphate which is added dropwise, with stirring. Stir for 60 min at room temperature and then store in a refrigerator overnight. The next day, the mixture is centrifuged at 3000 rpm for 30 min with cooling. After removal of the seperaatant, the sediment, i.e., purified gamma-globulin, is dissolved in a small volume of distilled water and dialysed under the conditions described above. After the last centrifugation, the supernatant is lyophilized. The yield of gamma-glutamine from 800 ml of the treated treated milk is 11.2 g, its electrophoretic purity is 97 g.

Takto izolovaný gama-globulin tvoří bílý nehygroskopický práěek, který lze uchovávat v uzavřené nádobě při teplotě místnosti. Lyofilizát je dobře rozpustný ve vodě a používá se v roztoku, nejlépe do koncentrace 16 hmot. Sterilitu roztoku lze zajistit za podmínek běžných pro obdobný preparát připravený ze séra.The gamma globulin thus isolated forms a white, non-hygroscopic powder that can be stored in a sealed container at room temperature. The lyophilisate is well soluble in water and is used in solution, preferably up to a concentration of 16% by weight. The sterility of the solution can be ensured under the conditions customary for a similar preparation prepared from serum.

Claims

Process for the preparation of gamma globulin from defatted and declassified colostral form - colostrum - of breast milk of mammals immunized prior to delivery with bacterial immunogens, one of which is shared with microorganisms of the Enterobacteriaceae family, characterized in that it is derived from the starting material at pH

6.5 to 7.5, by addition of a saturated aqueous ammonium sulphate solution in the form of a precipitate, precipitates a fraction of the crude gamma-globulin which, after dissolution in water, dialyses against water at a temperature of not more than 10 ° C, physically, for example by filtration with activated charcoal or by centrifugation and / or chemically, in particular by treatment with a higher quaternary ammonium salt, for example dimethyllaurylbenzylammonium bromide, the ballasts are removed, then at pH 6.5 to 7.5 by addition of a saturated aqueous ammonium sulfate solution, purified gamma-globulin precipitates. dialyzed against water at a temperature of not more than 10 ° C and finally the solution obtained is dehydrated, for example by lyophilization.