CS258607B1 - Spdsob izolácie SH-aminokyselín, peptidov a proteínov - Google Patents

Description

2586 3

Vynález sa týká spósobu izolácie SH-amí-nokyselín, peptidov a proteínov zo zmesiobsahujúcej sulfhydrilové a nesulfhydrilovézložky proteínov kovalentnou chromátogra-fiou. SH-skupiny majú v štruktúre žívej hmotyesenciálny význam (P. J. Jocelyn: Bioche-mistry of SH-group, Academie Press, London— N. Y. 1972). Sú súčasťou enzýmových aproteinových struktur, v peptidoch sa zú-častňujú oxidačno-redukčných, katalytic-kých, detoxikačných procesov atď. Izoláciapeptidov a proteínov je vo všeobecnosti dosťzložitý problém. Jednou z možností jeho rie-šenia je imobilizáčia týchto látok na růz-ných sorbentoch cez SH-skupiny zabudova-ného cysteinu (K. Brocklehurst: Int. J. Bio-chem. 10, 259(1979], D. Podhradský, P. Kris-tián: Chem. zvěsti 35, 567 [1981]). Tieto me-tódy izolácie však narážajú na problém de-sorpcie z nosiča, ktorá sa vačšinou uskutočňuje vytěsňováním iným tiolom, čím savlastně znehodnocuje izolovaný produkt. I-ným problémom bývá poměrně malá život-nost sorbenta, alebo neschopnost jeho rege-nerácie. Napriek tomu je reverzibílna kova-lentná chromatografia pre izoláciu SH lá-tok velmi perspektivná.

Otázka váčšieho využitia kovalentnejchromatografie sa týká hlavně výboruvhodného ligandu, ktorý by specificky a re-verzibilne reagoval s S.H-skupinami amino-kyselin, peptidov a proteínov. Bol popísanýligand fenylhydrazónopropándinitrilovéhotypu, ktorý po naviazaní na celulózu umož-ňuje zachytávat nízkomolekulové tioly (V.Marko, P. Gemeiner, M. Antalík, E. Šturdík,li. Drobnice, P. Kristián: Reactive Polymers1, 91 (1983). Desorpcia z takéhoto nosiča 07 4 prebieha však len pri vysokých hodnotáchpH (cca 12), kedy váčšina SH-skupín sa o-xiduje na disulfid. Pri próteínoch vedie ta-káto imobilizáčia k nevratným štrukturál-nym změnám a u enzýmov sa stráca aktivi-ta.

Uvedené nevýhody v podstatné) miere od-straňuje spůsob izolácie SH-amínokyselín,peptidov a proteínov podlá vynálezu, kto-rého podstata spočívá v tom, že vzorka sananesie na kolónu obsahujúcu 2-nitrofenyl-hydrazónpropándinitrilové deriváty polymé-rov obecného vzorca I X N *C(CNl, ~^NO, - Z (/) kde X znamená Y—O—CO alebo Y—NH—COa Y je' aiihydroglukózový polymér, polyhyd-roxymetylmetakrylát, gél na báze agarózyalebo celulóza za přítomnosti tlmivého roz-toku o pH 4 až 5 a po přetečení celého ob-jemu vzorky sa kolona premyje tlmivýmroztokom o pH 7 až 8. Polyméry 2-nitrofe-nyl-hydrazónoprppándinitrilového typu má-jů výhodu v tom, že pKa hodnota ich amíno-skupín sa nachádza v rozmedzí 5,3-5,6, čoprincipiálně znamená, že sorbujúca látka saviaže pri pH 4—5 a uvolňuje pri pH 7—8.Viazanie a uvolňovanie SH-látok na poly-mersa,může znázornit rovnicou λ ” \Ρζ NH ~ N ~C(Cn)z+R~ N0z

pričom X je hoře uvedené.

Popísaná metóda izolácie SH-amínokyse- lín, peptidov a proteínov podTa vynálezu máoproti iným metodám výhody v tom, že: via-zanie a uvolňovanie látky sa uskutočňujevelmi jednoducho — změnou pH v režime 4—8, čím SH-skupiny imobilizovanej látkyzostávajú zachované, pri vytěsňovaní sa ne-používá iná látka, ktorá by kontaminovalavzorku, ďalej odpadá regenerácia nosiča,stačí ekvilibrácia kolóny na pH viazania anakoniec v dósledku vysokej reaktivity li-gandu je aj vázobná schopnost nosiča vel-mi vysoká. Přikladl

Izolácia SH-amínokyselín, peptidov a prote-ínov

Vzorka v ktorej sa nachádza glutatión,cystein, alebo iný SH-proteín v koncentrá-cii najviac 2 mg/ml (napr. vodný extrakt zkvasiniek, deproteínovaný homogenát živo-čišných, alebo rastlinných tkaniv a pod.)sa nanesie na 10 cm stípec nosiča s 2-nitro-fenylhydrazónopropándinitrilovým ligan-dom, ktorý bol ekvilibrovaný na pH 4—5.Po premývaní pufrom o rovnakom pH, kto-

Claims (3)

1. 258607 5 ry obsahuje 0,01 % EDTA, sa z kolony od-stránia všetky zložky neobsahujúce SH-sku-piny. Po zmene pH na 8 sa z kolony vymyjúSH-amínokyseliny, peptidy alebo proteiny.Detekcia sa urobí Ellmanovým činidlom (G.L. Ellman; Arch. Biochem. Biophys. 74, 443[1958]}, alebo UV detekciou v případe pro-teínov. Návratnost sorpcie je 96—97 %.Příklad
2. 2 Separácia SH-proteínov V pufri o pH 4—5 sa rozpustia 2 mg pro-teínov, ktoré sú zmesou sulfhydrilových anesulfhydrilových zložiek. Po nanesenívzorky na kolonu s 2-nitrofenylhydrazón-propándinitrilovým ligandom sa pri pH 4až 5 oddelia proteiny, ktoré neobsahuji! SH-skupiny zabudovaného cysteinu. Po gradien- 6 tovej zmene pufru na pH 8 sa vytesnia SH-proteíny. Detekcia z kolony vychádzajúcichzložiek sa robí pomocou UV254, alebo UVzoe.Příklad
3. 3 Koncentrovanie enzýmu 2 mg enzýmu, ktorý obsahuje SH-skupi-ny [napr. ureáza, oxidoreduktázy a pod.)sa rozpustí v 5 dm3 pufru o pH 4—5 v kto-rom sa nachádza 0,01 % EDTA. Uvedený roz-tok enzýmu sa přečerpává cez kolonu po-mocou peristaltického čerpadla, pri prieto-ku 2 ml/min. Po přečerpaní celého objemusa na kolóne zachytený enzým uvolní puf-rom o pH 7—8. Pomocou zmeranej enzýmo-vej aktivity je možné zistiť 100-násobné za-koncentrovanie enzýmu. PEEDMET Sposob izolácie SH-kyselín, peptidov a-proteínov zo zmesi obsahujúcej sulfhydrido-vé a nesulfhydrilové zložky proteínov kova-lentnou chromatografiou pomocou nosiča sfenylhydrazónpropándinitrilovým ligandomvyznačujúci sa tým, že vzorka sa nanesie nakolonu obsahujúcu ako sorbent 2-nitrofenyl-hydrazónpropándinitrilové deriváty polymé-rov obecného vzorca I kde X znamená Y—O—CO alebo Y—NH—COa Y je anhydroglukózový polymer, polyhyd-roxymetylmetakrylát, gél na báze agarózyalebo celulóza za přítomnosti tlmivého roz-toku o pH 4 až 5 a po přetečení celého ob-jemu vzorky sa kolona premyje tlmivýmroztokom o pH 7 až 8. NH—N=C(CN)2 NO2 (0