CS256197B1 - Sposob indikácie a kvantitativného hodnotenia herhicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu - Google Patents

Description

256197

Vynález sa týká sposobu indikácie a kvan-titativného hodnotenia herbicídnej účinnostilátok inhibujúcich fotosyntézu. Inhibitoryfotosyntézy tvoria prevažnú časť herbicíd-ne účinných látok. Před zavedením nového herbicidu do pra-xe je potřebné na herbicídnu účinnost bio-logicky otestovat desattisíce zlúčenín. Pře-vážná časť komerčně dostupných herbicí-dov patří svojim mechanizmom účinku me-dzi inhibitory fotosyntézy. Svojim inhibič-nym účinkom postupné vyraďujú životné dů-ležité asimilačné pochody tvorby biomasy,čo sa v konečnom důsledku prejaví v uhy-nutí rastliny [Buchel, K. H.: Pěst. Sci. 3, 89až 110 (1972)].

Doteraz najviac používané skríningovémetody na hodnotenie herbicídnej účinnostisú založené prevažne na sledovaní fytotoxi-city vyjadrenej bonitačnou stupnicou připad-ne pri upřesnění výsledkov sa hmotnostněsleduje časový úbytok biomasy v závislostina koncentrácii skúmaných inhibítorov vv porovnaní s kontrolnými neošetrenýmirastlinami [Bradbury, D. T.: Proč. 10th Bri-tish Weed Control Conf. 1970, 986 — 996(1970); Saggers, D. T.: Herbicídne Acade-mie Press London, ed AUDUS, 447 — 473(1976)]. Tieto metody sú časovo, pracovněa energeticky náročné, vyžadujú vel'ké skle-níkové priestory, čím je podstatné limito-vaný rozsah testovaných zlúčenín. Herbi-cídne symptomy sa prejavujú často onesko-rene, čím sa na dlhší čas blokujú testova-cie priestory. Spůsob aplikácie a přípravapostrekových roztokov vyžadujú aspoň nie-kofkogramové množstvá testovaných sub-stancií, čo kladie vyššie nároky na přípra-vu a dostupnost týchto zlúčenín. Vzhfadomna kapacitně obmedzenie sa tieto metodypoužívajú pri systematickom výskume zná-mých herbicídne účinných skupin a ciele-nora výskume syntéz nových herbicídnychzlúčenín, kde je výskyt herbicídne aktívnejlátky pravděpodobnější. Tieto metody sú ne-vyhnutné pre upresnenie výsledkov hodno-tenia herbicídnej aktivity v podmienkachpraktickej aplikácie na ošetřené kultúry vpríslušnom spoločenstve burín.

Pri hfadaní nových herbicídne účinnýchskupin třeba otestovat desattisíce zlúčeníns výrazné účinnými štruktúrami. Pre tietoúčely třeba mať k dispozícii velmi rýchle,pracovně, energeticky a priestorovo nená-ročné testovacie metody, maximálně sa pri-bližujúce podmienkam praktickej aplikácies minimálnymi nárokmi na množstvo skú-manej látky. Tieto požiadavky len čiastočnesplňujú niektoré tzv. „in vitro“ metody, za-ložené napr. na inhibícii Hillovej reakcieizolovaných chloroplastov, připadne foto-syntézy na segmentoch listov sledovánímhmotnostného úbytku sušiny biomasy, akoaj potápania plávajúcich ošetřených seg-mentov [Moreland, D. E., Hill, K. L.: 1B,229 — 236 (1962); Šesták, Z., Čadský, J.:Metody studia fotosyntetické produkce rost- lin, Academia, 1966, str. 396; Truelove, B.al. Weed Sci. 22, 15 — 17 (1974); Saltzman, S., Heuer, B.: Pestic. Sci. 16, 457 — 462(1985)]. Uvedené metody sú pracovně ná-ročné, nakofko z aspektu preukaznosti vý-sledkov vyžadujú velké štatistické súborya neumožňujú automatizáciu vyhodnocova-nia výsledkov. Ďalšie metody využívajú na stanovenieherbicídnej účinnosti intaktné mikroorga-nismy, nižšie rastlinné organismy ako súriasy aj v kombinácii s fluorescenčnou me-todou [Addison, D. A., Bardsley, C. E., WeedSci. 16, 427 — 429 (1968) Bohme, H. et al.:Weed Sci. 29, 371 — 375 (1981)], alebo me-raním spotřeby COz IČ spektrofotometric-kou, připadne rádiometrickou metodou (DD212 985—A). Kvantitativné hodnotenie inhi-bície fotosyntézy je zatažené veíkou chy-bou, nakofko spotřebované množstvo oxiduuhličitého CO2 je v porovnaní s celkovýmmnožstvom oxidu uhličitého CO2 velmi níz-ké. Metoda založená na inhibícii Hillovejreakcie, využívajúca vhodný redox-indiká-tor na detekciu nanogramových množstievinhibítorov [Kováč, J., Henselova, M.: Pho-tosynthetica 10 (3), 343 — 374 (1976)], spí-ňa základné požiadavky rýchlej rutinnejtestovacej metody, pokial' mechanismus ú-činku nespočívá v inhibícii iných fotosyn-tetických pochodov. Metoda v sebe neza-hřňa změny v účinnosti, zapříčiněné trans-portom inhibítora k miestu účinku.

Podobné metoda [Okut, T., Kawahara, H.,Tomita, G.: Plant cell physiol. 12 (4), 559až 566 (1971)], založená na vyhodnoteníinhibície Hillovej reakcie meraním obsahukyslíka v homogenáte izolovaných chloro-plastov kyslíkovou elektrodou neindikuje ú-činné látky zasahujúce do iných fotosynte-tických procesov.

Uvedené nedostatky testovacích postupovpri indikovaní a hodnotení herbicídnej ú-činnosti velkého počtu z aspektu inhibíciefotosyntetických procesov odstraňuje spů-sob indikácie a kvantitativného hodnoteniaherbicídnej účinnosti látok inhibujúcich fo-tosyntézu podl'a vynálezu. Podstata vynále-zu spočívá v tom, že na vykrojené rastlinnélistové segmenty sa topikálne nanesie roz-tok testovanej látky, tieto sa spolu so sy-metrickými, ale neošetrenými kontrolnýmisegmentami vložia do fotosyntetickej ko-mory, kde sa za působenia rádioaktívneho14CO2 podrobia svetelnej expozícii. Po ex-pozícii sa zmeria rádioaktivita ošetřenýchaj neošetrených segmentov a z poklesu rá-dioaktivity ošetřených segmentov v porov-naní s kontrolnými segmentami sa indikujepřítomnost látok inhibujúcich fotosyntézua z poklesu rádioaktivity sa kvantitativnévyhodnotí inhibícia fotosyntézy v %. Výhoda spůsobu indikácie a kvantitativ-ného hodnotenia herbicídnej účinnosti látokinhibujúcich fotosyntézu spočívá predovšet-kým v tom, že vzhfadom na vysokú citli- 5 vosť rádiometrickej metédy možno poklesradioaktivity při ošetřených listových seg-mentech postřehnut už při krátkej svetel-nej expozícii. Toto umožňuje s využitím au-tomatické] rádiometrickej techniky nieletiotestovat v krátkom čase velký počet vzo-riek v množstvích niekolkých miligramov,ale aj kvantitativné rýchle vyhodnotit koe-ficient selektivity při použití seemenťov zróznych rastiinných materiálov ako aj vplyvaditívov a finálnej úpravy na biologická ak-tivitu herbicídov.

Na priloženom obrázku je zobrazené za-riadenie na fotosyntézu v atmosféře s ob-sahom 14CO.?, tvořené fotosyntetickou komo-rou 2 z plexiskla s podložkou 1 na uloženicsegmentov, křídlovými maticami 3 a ventil-mi Í5, 9 na hermetizáciu, s otvorom 7 nazavedenie injekčnej striekačky s ihlou 5prostrcdníctvom gumovej zátky 4, pričomna ihls injekčnej striekačky 5 je uchytenýknot 5 z fillračného papiera. Sňčasťou za-riadenia na fotosyntézu, je aj membránovéčerpadlo 10 na recirkulovanie ovzdušia fo-tosyntetickej komory 2 a ahscrbér 11 naahsorpciu neasimilovanébo 14CO?.

Uvedené příklady ilustruji';, ale ncobmed-zujú predmet vynálezu. Příklad 1 Rádiometrická indikácia iuhibítorov foto-syntézy na báze močovinových triazínových,diazínových a karbamátových herbicídov.

Zariadenie: automatický kvapalný scinti-lačný merač rádioakdvity Rack-Beta LKB;zariadenie na fotosyntézu v atmosféře s ob-sahom 14CO?, obr. 1; Hamiltonova striekačka(10 mm3).

Roztoky a chemikálie: vodný roztok rá-dioaktívneho uhličitanu sodného (Na214COj),konc. 11,1 mg. cm'3 s celkovou aktivitou37 MBq, roztok NaOH konc. 2 mol.. 1_1, roz-tok H?SOa konc. 2 mol.. 1_1, etylalkoholovéroztoky účinných látok herbicídov-inhibíto-rov fotosyntézy - konc. 2 mg . cm"3. Účinné látky: 2-etylamíno-4-chlor-6-terc.butylamíno- -1,3,5-triazin (terbutylazin), 2-etylamíno-4-metyltio-6-terc.butyl-a.míno-l,3,5-triazin (terbutryn), N,N-dimetyl-N-(3-chlor-4-tolyl)-močovina (chlorotoluron), N-4- (4-chlorf enoxy) -f enyl-N,N-dimetyl-močovina (chloroxuron), 4-amíno-3-metyltio-6-terc.butyl-l,2,4- -triazin-5-on (metribuzin),

B 2-chlor-4-etylamíno-tí-isopropylaimno- -1,3,5-triazin (atrazin), N- (4) -metoxvf enoxy) -fenyl)-N,N-dimetyl-rnočovina (difenoxuron), N-(3.4-dichlorfenyl )-N-metoxy-N-metyl- močovina (linuron), N-(4-bromfenyl)-N-metyl-močovina (metobromuron), N,N-dirnetyl-N- (4-isopropylf enyl) - -močovina (isoproturon), O-(3-metoxykarbonylanilino)-N-(3-metyl-fenyl j-karbamát (feumedifam), 2- metyltio-4,6-bis-isopropylamíno-l,3,5- -triazin (prometryn), 3- isopropyl-1.-hydro-2,.l,3-benztiadiazin- -4-011-2,2-dioxid (bentazon), 4- chlor-2-oxo-3-benztiazolinoclová kyselina (benazolin), N-( 4-chlor tenylj-N-metoxy-N-metyl-močovina (monolinuron), 3- cyklohexyl-5,&-trimetylenuracil (lenacil), 4- amíno l-fenyl-S-chlor-B-pyridazon (chloridazon), l,l-dimetyl-3-trifluormetylfenyl-močovina (fluometuron). Z listovéj plochy fazule (Phaseolus vulg.)vo vývojovom stádiu prvých dvoch listov savykrojila dvojica kruhových segmentov po-zd ž nervu listu tak, že sa zachovala syme-tria u příslušných druhov listov. Z každéholistu sa vykrojili minimálně štyri dvojicesegmentov. Segmenty sa uložili na diskyz filtračného papiera (0 1 cm] rovnoměrnězmáčané destilovanou vodou, umiestnené nasklenenej podložke. Segmenty miernym při-tlačením přilnuli k vlhkej podložke, čím saznížilo odparovanie vody z povrchu seg-mentov a dosiahla sa požadovaná fixáciasegmentov na povrchu podložky. Potom sana povrch segmentu príslušnej dvojice vzor-ka — kontrola nanieslo kapilárnou mikro-pipetou (5 mm3) etylalkoholového roztokuskúmanej látky. Podložka 1 so segmentamisa vsunula do fotosyntetickej komory 2 zplexiskla. Po uzavretí fotosyntetickej ko-mory 2 krytom 12 s gumovým těsněním apo jej dokonalej hermetizácii křídlovýmimaticami 3 a ventilmi 8, 9 sa z otvoru 7 fo-tosyntetickej komory 2 vybrala gumová zát-ka 4, prepichnutá ihlou injekčnej striekač-ky 5 na konci ktorej bol uchytený knot 6z filtračného papiera. Injekčná striekačkaS sa čiastočne naplnila zriedeným roztokomkyseliny sírovej, ihla sa vyměnila za ihlu 25B197 so zátkou 4 a na konci knotu 6 z filtračné-ho papiera sa Hamiltonovou striekačkou na-nieslo 5 mm3 roztoku rádioaktívneho uhli-čitanu sodného. Potom sa do otvoru 7 foto-syntetickej komory 2 vsunula gumová zát-ka 4 s injekčnou striekačkou 5 a ihlou sknotom 8. Po uzavretí ventilu 8, 9 sa foto-syntetická komora 2 zakryla čiernym pa-pierom a vytlačením kvapky roztoku kyse-liny sírové] z injekčnej striekačky 5 sa knQt6 zmáčal a kyselina sírová uvolnila z uhli-čitanu sodného rádioaktívny 14CO2 do prie-storu fotosyntetickej komory 2. Po 15-minú-tovom zrovnovážnení ovzdušia fotosyntetic-kej komory 2 sa segmenty vystavili 30-mi-nútovej expozícii světelného žiarivkovéhozdroja (3 x 40 W), umiestneného 20 cm odpodložky 1 so segmentami. Po ukončení ex- pozície otvorením ventilov 8, 9 a zapnutímmembránového čerpadla 10 ovzdušie foto-syntetickej komory 2 recirkulovalo cez ab-sorbér 11 s roztokom hydroxidu sodného.Absorpcia neasimilovaného 14CO2 prebehlapočas 30 minút. Potom sa otvoril zadný u-záver fotosyntetickej komory 2 a podložka1 so segmentami sa vysunula. Segmenty savnlesli do scintilačných meracích nádobieka zaliali sa 10 ml kvapalného scintilátoraSLT-31. Meranie rádioaktivity sa uskutečni-lo na automatickom kvapalnom scintilač-nom merači rádioaktivity Rack-Beta LKB(je možné použit aj iný ekvivalentný pří-stroj). Pokles rádioaktivity, poukazujúci nastupeň inhibície fotosyntézy a tým aj naherbicídnu účinnost, je zřejmý z tabulky 1.

Tabulka 1 Rádiometrická indikácia biologickej účinnosti herbicídov na segmentech z listov fazulevyjádřená inhibíciou fotosyntézy v %

Testovaná Rádioaktivita Rádioaktivita

Inhibícia fotosyntézy účinná kontrol, seg. ošetr. seg. (c.p. m.) (i--^-).100 (%) látka (c. p. m.) Terbutryn 31 445 75 99,8 Prometryn 30 060 85 99,7 Ghloridazon 31 665 90 99,7 Atrazín 30 055 95 99,7 Difenoxuron 29 905 105 99,6 Lenacil 29 470 170 99,4 Fluometuron 29 435 175 99,4 Fenmedifam 30 565 210 99,3 Izoproturon 31115 235 99,2 Bentazon 31 765 245 99,2 Monolinuron 30 230 260 99,1 Metobromuron 29 705 315 98,9 Metribuzin 29 970 335 98,9 Terbutylazin 30 795 425 98,6 Linuron 31 305 550 98,2 Chlortoluron 30 385 605 98,0 Chlorroxuron 31 205 815 97,4 Benazolin 31400 995 96,8 Příklad 2 medzí koncentrácií 0,001 až 2,00 mg . cm'3.Z jednotlivých roztokov sa nanieslo mikro- Kvantitativné rádiometrické hodnotenie ú- pipetou na vykrojené segmenty z listov činnosti herbicídov vyjádřené závislosťou fazule rovnakým postupom ako v příklade fotosyntézy od koncentrácie účinnej látky 1 a po svetelnej expozícii sa vyhodnotila v aplikačnom roztoku. z nameraných rádioaktivit ošetřených a ne- ošetřených segmentov inhibícia fotosyntézy Postup: Připravili sa vodné roztoky v %, ako je to zřejmé z tabulky 2 a 3. Vý- finálnych prípravkov herbicídov na báze ú- sledky sú priemerom šiestich paralelných činných látok atrazínu a bentazonu v roz- stanovení. 256197 9 10

Radiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (%] v závislosti od koncentrácie atrazínu v aplikačnom roztoku

Tabulka 2

Koncentrácia atrazínu(mg. cm~3j radioaktivitakontrolného segmentu(c. p. m.)

A radioaktivitaošetřeného segmentu(c.p. m.)

B inhibícia fotosyntézy °/o(1--?—) · 100 0,001 25 030 20150 19,5 0,002 24 750 16 530 33,2 0,004 24 710 11 970 51,6 0,020 26 045 8 190 68,6 0,040 25 150 5 147 79,5 0,400 26 570 305 98,9 2,000 24 775 125 99,5 Tabulka 3 Rádiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (% j v závislosti od koncentrácie bentazonu v aplikačnom roztoku Koncentrácia rádioaktivita rádioaktivita inhibícia fotosyntézy bentazonu kontrolného segmentu ošetřeného segmentu (%) (mg. cm'3) (c. p. m.) (c. p. m.) p Í1 1 1ΠΠ A B [i a * 1UU 0,001 25 970 21 960 15,4 0,002 26 160 19 310 26,2 0,004 25 035 13 745 45,1 0,020 24 030 8 980 62,6 0,040 24 220 5 980 75,3 0,400 25 005 1 990 92,0 2,000 26 970 270 99,0 Příklad 3

Radiometrické vyhodnotenie potenciácieherbicídneho účinku vplyvem aditívu.

Postup: Na segmenty listov fazule sananiesli vodné roztoky finálnych produktovskúšaných herbicídov Zeazínu (účinná lát-ka bentazon) bez přídavku ako aj s prídav-kom aditívu, pri odstupňovaných koncen- tráciách atrazínu a bentazonu. Připravil savodný 0,2 %-ný roztok aditívu (Sloviol-R,obsahujúci 16 % polyvinylalkoholu). Porov-nala sa inhibícia fotosyntézy odstupňova-ných koncentrácií příslušných herbicídov,získaných riedením vodou a vodným rozto-kom aditívu. Další postup bol rovnaký akov predchádzajúcich príkladoch. Potencujúciúčinok aditívu je zřejmý z tabuliek 6 a 7.

Tabulka 4

Potenciácia herbicídneho účinku atrazínufotosyntézy pri odstupňovaných aditívom Sloviol-R vyjádřenákoncentráciách herbicidu inhibíciou

Konc. atrazínu(mg. cm-3) (c. p. m.) rádioaktivitakontrolného segmentu(c.p. m.)

A rádioaktivitaošetřeného segmentu(c. p. m.)

B inhibícia fotosyntézy (%) (1-^ (1 ) . 100 0,001 27 050 18 905 0,002 25 110 14 095 0,004 25 750 9 640 0,020 26 330 62 295 0,040 25 175 1 995 0,400 26 970 190 2,000 26 145 75 30.143,962,6 76.1 92.199,399,7 25B197

Potenciácia herbicídneho účinku bentazonu aditívom Sloviol-R vyjádřená inhibíciou fotosyntézy pri odstupňovaných koncentráciách herbicidu 11 12

Tabulka 5

Koncentrácia bentazonu rádioaktivitakontrolného segmentu rádioaktivitaošetřeného segmentu inhibícia fotosyntézy (mg . cm-3) (c. p. m.) (c. p. m.) (1 Ď -1 . 100 A J 0,001 24 070 18 150 24,6 0,002 25 300 16 002 36,8 0,004 25 120 11 300 55,0 0,020 25 025 7 150 71,4 0,040 26 130 4 700 82,0 0,400 25 055 155 99,4 2,000 26 035 80 99,7 T a b u 1' k a 6 Porovnanie inhibície fotosyntézy atrazínom bez přídavku a s prídavkom aditívu Koncentrácia 0,001 0,002 0,004 0,020 0,040 0.400 2,000 atrazinu (mg. cm'3) inhibícia (%} 20 34 52 69 80 99 99 bez aditívu inhibícia (%) 31 44 63 77 93 99 99 s prídavkom aditívu T a b u 1' k a 7 Porovnanie inhibície fotosyntézy bentazonom bez přídavku a s prídavkom aditívu Koncentrácia 0,001 0,002 0,004 0,020 0,040 0,400 2,000 bentazonu (mg. cm'3) inhibícia (%) 16 27 46 63 76 93 99 bez aditívu inhibícia (%) 25 37 56 72 83 99 99 s prídavkom aditívu Příklad 4 ných roztokov finálneho produktu bentazo- Rádiometrické \ /hotcvunie selektivity a-trazínu a bentazonu na segmentech z hotovfazule, kukuřice a jačmeňa.

Postup: Na segmenty listov fazule akukuřice sa naniesli odstupňované koncen-trácie vodných roztokov finálneho produk-tu atrazinu a na segmenty z listov fazulea jačmeňa, odstupňované koncentrácie vod- nu. Inhibícia fotosyntézy sa vyhodnotila rá-diometricky z hodnot radioaktivit ošetře-ných a kontrolných se/mentov ako v pře-dešlých příkladech. Selektivita skúšanýchherbicídov je zřejmá z výsledkov tabuliek2. 3, 8 a 9 z porovnania inhibície fotosyn-tézy (%) v závislosti od koncentrácie tých-to herbicídov po ošetření segmentov z lis-tov fazule, kukuřice a jačmeňa.

Claims (1)

1. 256197 Radiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (%) v závislosti od koncentrácie atrazínu na segmentoch listov kukuřice. 13 14 Tabulka 8 Koncentráciaatrazínu(mg. cm-3) Radioaktivitakontrolného segmentu(c. p. m.) Rádioaktivitaošetřeného segmentu(c. p. m.) Inhibícia fotosyntézy (%) 2,0 18 665 15 330 17,9 2,5 17 545 11 220 36,1 5,0 18 025 495 97,5 10,0 17 985 195 98,9 Tabulka 9 Rádiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (%) v závislosti od koncentrácie Koncentráciabentazonu(mg. cm"3) bentazonu na segmentoch z listov jačmeňa. Inhibícia fotosyntézy (%) Rádioaktivitakontrolného segmentu(c. p. m.) Rádioaktivitaošetřeného segmentu(c. p.m.) 2,0 18 110 13 705 24,3 2,5 17 995 9 445 47,5 5,0 17 025 305 98,2 10,0 18 445 70 99,6 PREDMET Spósob indikácie a kvantitativného hod-notenia látok inhibujúcich fotosyntézu, vy-značujúci sa tým, že na listové segmentyrastlín sa nanesie roztok testovanej látky,tieto sa spolu so symetrickými neošetrený-mi kontrolnými segmentami podrobia za pó-sobenia rádioaktívneho 14CO2 svetelnej ex- VYNÁLEZU pozícii, po ktorej sa rádiometricky stanovíaktivita ošetřených a neošetrených segmen-tov, pričom pokles aktivity ošetřených seg-mentov v porovnaní s neošetrenými indiku-je přítomnost látok inhibujúcich fotosynté-zu a z poklesu radioaktivity sa kvantitativ-né vyhodnotí inhibícia fotosyntézy v %. 1 list výkresov