CS252790B1 - Způsob oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin - Google Patents

Abstract

Řešení se týká oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin z konce peptidového řetězce, obsahujícího volné karboxylové skupiny aminokyselin. Je určeno pro určení sekvence peptidů a bílkovin. Vodný roztok, pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptid nebo bílkovinu, se podrobí působení enzymu karboxypeptidázy, imobilizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu a to v ultrafiltrační cele opatřené membránou propouštějící pouze nízkomolekulární látky, jako aminokyseliny uvolněné karboxypeptidázou z peptidů nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrát 1 ku 200 až 1 ku 2 000.

Description

Vynález se týká způsobu oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin z konce peptidového řetězce, obsahujícího volné karboxylové skupiny aminokyselin, pro určování sekvence peptidů a bílkovin.

V biochemii je velice zapotřebí určovat primární struktury proteinů, to je sledu aminokyselin, jež vzájemně vázány peptidickou vazbou vytvoří peptidy či proteiny. K tomuto postupu je využíváno známých způsobů, přičemž všechny jsou kompromisem mezi přesností stanovení a množstvím materiálu, jenž je nutno použít ke stanovení. Jeden známý způsob využívá specifických proteolytických enzymů, tak zvaných karboxypeptidáz. Tyto enzymy odštěpují jednotlivé aminokyseliny od toho konce peptidů či proteinu, který má volnou karboxylovou skupinu.

U dosud používaných tak zvaných klasických postupů určování koncových aminokyselin se jedná o zjišťování obsahu jednotlivých aminokyselin v roztoku, který obsahuje zkoumaný polypeptid a enzym, to je karboxypeptidázu. Přitom prostředí, v němž je stanovení prováděno, je pufrováno na pH blízké optimu působení příslušné karboxypeptidázy.

V původní reakční směsi, jež obsahuje s počátku pouze polypeptid a karboxypeptidázu, je sledována narůstající koncentra ce aminokyselin, jež jsou přítomnou karboxypeptidázou uvolňovány z peptidů do roztoku.

V daném klasickém postupu je krokem, jenž ovlivňuje přesnost způsobu, právě zpracování odebíraných podílů, určených k aminokyselinové analýze. V uvedeném klasickém postupu je ne252 790 výhodou nutnost srážení kyselinou trichloroctovou, následná kon centrace precipitátu centrifugací, extrakce etherem a odpaření. Teprve po těchto operacích je vzorek připraven pro aminokyselinou analýzu.

Uvedené nedostatky odstraňuje podle vynálezu způsob oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin z konce peptidového řetězce pro určování sekvence peptidů a bílkovin, za použití enzymu karboxypeptidázy, vyznačující se tím, že vodný roztok pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptid nebo bílkovinu, se podrobí působení enzymu karboxypeptidázy, imobilizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu a to v ultrafiltrační cele opatřené membránou propouštějící pouze nízkomolekulární látky, jako aminokyseliny, uvolněné karboxypeptidázou z peptidů nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrát 1 ku 200 až 1 ku 2 000.

Základní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v podstatném zjednodušení postupu, neboí veškerá úprava vzorku před aminokyselinou analýzou spočívá pouze v jeho odpaření. Další výhoda spočívá v tom, že karboxypeptidáza je imobilizovaná na pevném nosiči a proto nedochází k její autolýze, dále je ji možno snadno oddělit ze směsi. Díky pevnosti použitého materiálu nehrozí nebezpečí jeho rozmělnění a karboxypeptidázu lze snadno opakovaně použít. Uvedený postup je proti klasickému způsobu sekvenování výrazně kratší, zhruba o polovinu a celý postup je možno snadno automatizovat.

Způsob podle vynálezu je dále blíže popsán na konkrétních příkladech provedení.

Příklad 1

Pro použití karboxypeptidázy Y k sekvenčním práčem byla karboxypeptidáza imobilizována na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu s imobilizováným Konkavalinem A. Takto imobilizovaná karboxypeptidáza byla přidána ke 3 ml roztoku proteinu /ribonukleáza A/. Koncentrace proteinu byla 10 mg v 3 ml 0,1 M acetátu sodného pH 6,0 s 0,5 % laurylsíranu sodného. Roztok

252 790 proteinu byl umístěn v malé ultrafiltrační cele /objem 10 ml/ s membránou propouštějící látky s molekulovou hmotností pod 2 000. Ve vhodně zvolených časových intervalech byl tlakem dusíku odebírán alikvot /0,2 ml/ a ten po odpaření byl přímo použit pro aminokyselinovou analýzu.

Touto metodou byly získány výsledky o stejné kvalitě jako u klasického postupu.

Příklad 2

Stejný postup s použitím ultrafiltrační cely byl využit pro sekvenční práci s karboxypeptidázou A a karboxypeptidézou

B.

Příklad 5

Za podmínek uvedených v příkladu 1 bylo provedeno štěpení proteinu imobilizovanou karboxypeptidázou. 1 ml roztoku proteinu /0,1 M acetát sodný, pH 6,0 s 0,5 % laurylsíranu sodného obsahující 2 _zug ribonukleázy A/ byl podroben štěpení karboxypeptidézou Y imobilizovanou na polyhydroxyethylmethakrylátovém gelu s imobilizovaným konkanavalinem A. Bylo použito 200 ,ug nosiče s obsahem 0,1/Ug karboxypeptidázy Y. Byla použita ultrafiltrační cela o objemu 2 ml, opatřená membránou propouštějící látky s molekulovou hmotností pod 2 000 a odebírána vzorky o objemu 0,05 ml.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin z konce peptidového řetězce pro určováni sekvence peptidu a bílkovin, za použití enzymu karboxypeptidázy, vyznačující se tím, že vodný roztok pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptid nebo bílkovinu, se podrobí působení enzymu karboxypeptidázy, imobilizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu^ v ultrafiltrační cele opatřené membránou propouštějící pouze nízkomolekulární látky, jako aminokyseliny uvolněné karboxypeptidázou z peptidu nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrát 1 ku 200 až 1 Ku 2 000¾.