CS250534B1

CS250534B1 - A method of separating ganglirside fractions by ion exchange chromatography

Info

Publication number: CS250534B1
Application number: CS696885A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Smid; Vlasta Bradova; Otakar Mikes; Jana Sedlackova
Original assignee: Frantisek Smid; Vlasta Bradova; Otakar Mikes; Jana Sedlackova
Priority date: 1985-09-30
Filing date: 1985-09-30
Publication date: 1987-04-16

Abstract

Způsob separace gangllosidových frakcí ionexovou chromatografii. Rychlá separace gangllosidových frakcí na organických hydrofilních makroporézních měničích aniontů glykol-methakrylátového typu otevírá možnosti účelné přípravy těchto biopreporátů z homogenátů živočišných tkání (zejména z mozku) v laboratorním i větším výrobním měřítku. Vynález popisuje chromsto raii na středně bazických hydrofilních «nexech, které tak citlivé a složité látky, jakými gangliosidy jsou, nepoškozují vedlejšími reakcemi. Mozkové gangliosidy se chromatografují podle obsahu kyseliny sialové v molekule na diethylaminoethylovém rigidním glykolmethakrylátovém makroporézním hybridním anexu lineárním gradientem: methanol — 0,2 M octan amonný, draselný nebo sodný v methanolu za tlaku 0,1 až 2,0 MPa za laboratorní teploty při specifickém průtoku do 10 ml/cm2. min.Method of separation of ganglioside fractions by ion exchange chromatography. Rapid separation of ganglioside fractions on organic hydrophilic macroporous anion exchangers of the glycol-methacrylate type opens up possibilities for the efficient preparation of these biopreparations from homogenates of animal tissues (especially from the brain) on both laboratory and larger production scales. The invention describes chromosta raii on moderately basic hydrophilic anions, which do not damage such sensitive and complex substances as gangliosides by side reactions. Brain gangliosides are chromatographed according to the content of sialic acid in the molecule on a diethylaminoethyl rigid glycol methacrylate macroporous hybrid anion exchanger by a linear gradient: methanol — 0.2 M ammonium, potassium or sodium acetate in methanol at a pressure of 0.1 to 2.0 MPa at laboratory temperature at a specific flow rate of up to 10 ml/cm2. min.

Description

Vynález se týká způsobu separace gangliosidových frakcí ionexovou chromatografií.The invention relates to a method for separating ganglioside fractions by ion exchange chromatography.

Gangliosidy jsou kyselé glykosfingolipidy. Jejich molekula obsahuje vždy hydrofobní část — ceramid tvořený vyšším alifatickým aminoalkoholem — sfingosinem a vyšší mastnou kyselinou a hydrofilní část — oligosacharid obsahující různý počet hexos a aminohexos a jednu nebo několik molekul kyseliny sialové (N-acetylneuraminové, eventuálně N-glykolylneuraminové aj.j.Gangliosides are acidic glycosphingolipids. Their molecule always contains a hydrophobic moiety - ceramide consisting of a higher aliphatic amino alcohol - sphingosine and a higher fatty acid and a hydrophilic moiety - an oligosaccharide containing a different number of hexoses and aminohexoses and one or more molecules of sialic acid (N-acetylneuraminic or N-glycolylneuraminic).

V živočišných tkáních nejsou přítomny ve vysoké koncentraci. V největším množství jsou přítomny v mozkové tkáni, a to zejména v šedé hmotě mozkové. Chemicky čisté gangliosidy se uplatňují jako biopreparáty.They are not present in high concentrations in animal tissues. They are present in the largest amount in the brain tissue, especially in the gray matter of the brain. Chemically pure gangliosides are used as biopreparations.

Starší postupy izolace gangliosidů vytřepáváním neumožňovaly dostatečné čištění a absorpční chromatografie. nevedla — vzhledem k rozmanitosti jednotlivých látek — k izolaci chemických individuí. Použitím novějších adsorbentů pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC) se sice podařilo rozlišení hlavních běžných gangliosidů, ale pro možnost izolace i minoritních komponent je obecně užívána kombinace ionexové a adsorpční chromatografie.Earlier shaking isolation of gangliosides did not allow for sufficient purification and absorption chromatography. it did not - due to the diversity of individual substances - lead to the isolation of chemical individuals. The use of newer high-pressure liquid chromatography (HPLC) adsorbents has distinguished the major conventional gangliosides, but a combination of ion exchange and adsorption chromatography is generally used to isolate even minor components.

Různý obsah kyseliny sialové v mono-, di-, tri-, tetra-, event. pentasialogangliosidech byl základem pro jejich postupnou izolaci z kolony diethylaminoethyl-anexů (DEAE] elucí vzestupnou koncentrací acetátových iontů v methanolu. K tomuto účelu bylo rovněž použito dietylaminoethylderivátu s matricí celulózovou, polysacharidovou a silikagelovou (dále jen DEAE silikagel)·Different sialic acid content in mono-, di-, tri-, tetra-, event. The pentasialogangliosides were the basis for their gradual isolation from the diethylaminoethyl anion exchange column (DEAE), eluting with an increasing concentration of acetate ions in methanol, using a diethylaminoethyl derivative with a cellulose, polysaccharide and silica gel (DEAE silica gel) matrix.

Mono-, di-, a trisiaiogangliosidy byly dále děleny adsorpční chromatografií na totálně porézním silikagelu a podařila se izolace jednotlivých gangliosidů ve velké čistotě.The mono-, di-, and trisiaiogangliosides were further separated by adsorption chromatography on totally porous silica gel, and the isolation of individual gangliosides in high purity was achieved.

Všechny uvedené nosiče byly však použity pro klasickou nízkotlakou chromatografii. Separace na nich trvala řadu hodin až dní.However, all these carriers were used for classical low pressure chromatography. The separation lasted from hours to days.

Předmětem vynálezu je způsob separace gangliosidových frakcí ionexovou chromatografií, jehož podstatou je, že gangliosidy mozkové se chromatografují, podle obsahu kyseliny sialové v molekule na diethylaminoethylovém rigidním glykolmethakrylátovém makroporézním hybridním anexu lineárním gradientem: methanol — 0,2 M octan amonný, draselný nebo sodný v methanolu za tlaku 0,1 až 2,0 MPa za laboratorní teploty při specifickém průtoku do 10 ml/cm². min.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for separating ganglioside fractions by ion exchange chromatography, the principle of which is that brain gangliosides are chromatographed according to the sialic acid content of the molecule on a diethylaminoethyl rigid glycol methacrylate macroporous hybrid anion exchange linear gradient: methanol - 0.2 M ammonium acetate, potassium or sodium in methanol at a pressure of 0.1 to 2.0 MPa at room temperature at a specific flow rate of up to 10 ml / cm ² . min.

Vynález řeší výrobu gangliosidových frakcí, charakterizovaných obsahem jedné nebo několika skupin sialové kyseliny, extrahovaných ze zvířecí mozkové tkáně rychlou ionexovou chromatografií na středně basickém tvrdém hydrofilním makroporézním glykomethakrylátovém měniči aniontů v prostředí methanolu lineární gradientovou elucí vhodným pufrem s využitím kontroly průběhu chromatografie měřením elektrické vodivosti efluentu.The invention provides for the production of ganglioside fractions characterized by the content of one or more sialic acid groups extracted from animal brain tissue by rapid ion exchange chromatography on medium basic hard hydrophilic macroporous glycomethacrylate anion exchanger in methanol medium by linear gradient elution with suitable buffer using chromatographic control by electrical conductivity measurement.

Ve srovnání s předchozími známými postupy postup podle vynálezu dovoluje provést sorpci a separaci ganliosidů během 30 minut a otevírá perspektivy pro ještě rychlejší dělení. Využívá diethylaminoethylovaného derivátu jsmnozrnného makroporézního rigidního čistě organického kopolymeru glykolmethakrylátového typu, dále jen Spheron — DEAE nebo DEAE — Separon HEMA [Mikeš O. a kol. J. Chromatogr., 180 (1979) 17, A. O. 187 563 a A. O. 189 539].Compared to previous known processes, the process of the invention allows the ganliosides to be sorbed and separated within 30 minutes and opens up perspectives for even faster separation. It utilizes a diethylaminoethylated derivative of a fine-grained macroporous rigid, purely organic glycol methacrylate-type copolymer, hereinafter referred to as Spheron-DEAE or DEAE-Separon HEMA [Mikeš O. et al. J. Chromatogr., 180 (1979) 17, A.O. 187,563 and A.O. 189,539].

Tento středně basický anex obsahuje hybridní (hydrofobně/hydrofilní) matrici s dostatečně velikými póry, dovolujícími penetraci látek o molekulové hmotnosti až 1 000 000 daltonů, takže gangliosidy mohou dobře pronikat k funkčním skupinám ionexu. Matrice je přitom dostatečně tvrdá, takže dobře snáší tlaky několika desítek až sto atmosfér. Tato matrice není silně hydrofobní, jako je tomu např. u styren-divinylbenzenových anexů, které by interagovaly s hydrofobními gangliosidy, je však daleko pevnější než měkké hydrofilní anexy celulózového, polydextranového nebo agarózového typu, které se dosud k separaci gangliosidů užívaly, avšak které nedovolují rychlý průtok, poněvadž nelze použít velký tlak. Námi použitý glykolmethakrylátový anex má podstatně větší kapacitu než DEAE — silikagel [Kundu S. K. a kol., J. Chromatogr., 170 (1979) 65], který je sice také tvrdý, avšak otázka dostatečné kapacity je velmi významná pro výrobní účely. Anexy s polysacharidovou matricí (Momoi T. a spol., Biochim. Biophys. Acta, 441 (1976} 488, Ledeen R. W. a Yu R. K., Methods Enzymol., 83 [1982] 139, Iwamori M. a Nagai Y., Biochim. Biophys. Acta, 528 (1978) 252] nebo s polysacharidovým povlakem [Fredman P. a spol., Biochim. Biophys. Acta, 618 (1980) 42] mají sice vyšší vazebné kapacity než DEAE — Silikagel, avšak anexy glykolmethakrylátového typu podle vynálezu jsou na rozdíl od nich naprosto neštěpitelné žádnými enzymy v přírodě se vyskytujícími a proto dobře odolávají mikrobiální infekci, což je rovněž z provozního hlediska důležité. Pro tyto ionexy je také typická velká chemická odolnost.This intermediate basic anion exchanger contains a hybrid (hydrophobic / hydrophilic) matrix with sufficiently large pores to allow penetration of substances having a molecular weight of up to 1,000,000 daltons so that gangliosides can penetrate well to the ion exchange functional groups. The matrix is hard enough to withstand pressures of several tens to one hundred atmospheres. This matrix is not strongly hydrophobic, as is the case with styrene-divinylbenzene anion exchangers which would interact with hydrophobic gangliosides, but is much stronger than the soft hydrophilic anion exchangers of the cellulose, polydextran or agarose type which have not been used to separate gangliosides yet fast flow, as high pressure cannot be used. The glycol methacrylate anion we use has a significantly greater capacity than DEAE-silica gel [Kundu S.K. et al., J. Chromatogr., 170 (1979) 65], which is also tough, but the question of sufficient capacity is very important for manufacturing purposes. Anion exchangers with a polysaccharide matrix (Momoi T. et al., Biochim. Biophys. Acta, 441 (1976) 488, Ledeen RW and Yu RK, Methods Enzymol., 83 [1982] 139, Iwamori M. and Nagai Y., Biochim. Biophys Acta, 528 (1978) 252] or with a polysaccharide coating [Fredman P. et al., Biochim. Biophys Acta, 618 (1980) 42] have higher binding capacities than DEAE-Silica gel, but glycol methacrylate type anion exchangers according to the invention In contrast, they are completely non-cleavable by no naturally occurring enzymes and therefore resist microbial infection, which is also important from an operational point of view, and they are also characterized by high chemical resistance.

Glykolmethakrylátové matrice dovolují např. rychlou důkladnou regeneraci 2M HC1 a 2M NaOH i při opakovaném používání.Glycol methacrylate matrices allow, for example, rapid thorough regeneration of 2M HCl and 2M NaOH, even with repeated use.

Další výhodou je, že se ionex snadno regeneruje a ekvilibruje přímo na koloně, takže není nutné jeho vyjímání z kolony a opětné plnění před další chromatografii. V podstatě se pouze přepínají roztoky přiváděné na kolonu: 1) vzorek, 2] methanol k ekvllibraci, 3] eluční roztoky připravované v gradientovém mísiči, 4] 2M octan amonný k běžné regeneraci a 5] methanol k ekvilibraci.Another advantage is that the ion exchanger is easily regenerated and equilibrated directly on the column, so that it is not necessary to remove it from the column and refill it before further chromatography. Essentially, only the feeds to the column are switched: 1) sample, 2] methanol to equilibrate, 3] elution solutions prepared in a gradient mixer, 4] 2M ammonium acetate for normal recovery, and 5] methanol to equilibrate.

250531250531

Takové přepínání lze snadno zmechanizovat či programované automatizovat, což je další předpoklad k účelné moderní výrobě. Použití lineárních gradientů místo vtomto oboru běžně užívaných konkávních velmi usnadňuje nejen instrumentaci celého zařízení, ale i vyhodnocování separací. Dosud nepoužívané zavedení kontroly cbro matografie gangliosidů měřením elektrické vodivosti přiváděných methanolických roztoků a vyteklých frakcí, které je velmi snadné, umožňuje výbornou kontrolu celého kolonového procesu bez nutnosti speciálního detektoru. To vše jsou přednosti námi popisovaného způsobu frakcionace gangliosidového extraktu, které jsou významné z hlediska výroby těchto látek.Such switching can be easily mechanized or programmed automated, which is another prerequisite for efficient modern production. The use of linear gradients instead of the concave ones commonly used in this field greatly facilitates not only the instrumentation of the entire device, but also the evaluation of separations. The previously unused introduction of the cbro math ganglioside control by measuring the electrical conductivity of the feed methanolic solutions and the effluent fractions, which is very easy, allows excellent control of the entire column process without the need for a special detector. These are all the advantages of the ganglioside extract fractionation process described by us, which are important for the production of these substances.

Velmi významné je snížení doby separace o 1 až 2 řády ve srovnání s dříve publikovanými metodami, což je z hlediska provozní ekonomiky velmi důležité.It is very important to reduce the separation time by 1 to 2 orders of magnitude compared to previously published methods, which is very important from the operational economy point of view.

Způsobem podle vynálezu lze dosáhnout frakcionace gangliosidů pouze ionexovou chromatografii podle počtu kyseliny skálové v molekule na mono-, di-, tri-, tetra-, pentasialogangliosidy.By the method of the invention, the fractionation of gangliosides can only be achieved by ion exchange chromatography according to the number of rock acid per molecule per mono-, di-, tri-, tetra-, pentasialogangliosides.

je známo, že pro potřeby vysokotlaké chromatografie gangliosidů je použit silně basický organický ionex Mono Q (Pharmacia, Uppsala] s pomocí stupňovitého gradientu octanu draselného v rozsahu koncentrací 0—0,225M v methanolu a za průtoku 2 ml/min. [Mansson J. E., Rosengren B. a Svennerholm L., J. Chromatogr., 322 (1985) 465—472.].it is known that a strongly basic organic ion exchanger Mono Q (Pharmacia, Uppsala) is used for high pressure ganglioside chromatography using a stepwise gradient of potassium acetate over a concentration range of 0-0.225M in methanol and at a flow rate of 2 ml / min. [Mansson JE, Rosengren B. and Svennerholm L., J. Chromatogr., 322 (1985) 465-472.].

Popsaný způsob splňuje požadavky na rychlost dělení s použitím středních tlaků i na zatížení. Nevýhodou však je, že dosažené dělení gangliosidů se neřídilo vždy množstvím vázané sialové kyseliny, nýbrž značná část gangliosidů GQlb byla eluována spolu s monosialogangliosidy a větší množství trisialogangliosidu GTlb a malé množství disialogangliosidů bylo evidováno s tetrasialogyngliosidy.The method described meets the requirements for cutting speed using medium pressures as well as loading. However, the disadvantage is that the achieved ganglioside separation did not always follow the amount of bound sialic acid, but a significant proportion of GQ1b gangliosides were eluted together with monosialogangliosides and more trisialoganglioside GT1b and small amounts of disialogangliosides were reported with tetrasialogyngliosides.

Silně basická kvarterní amoniová skupina anexu Mono Q katalyzuje laktonizecl GQlb na koloně a vyvolává poruchy chromatografické separace na základě sialové kyseliny. Námi použitý DEAE-Spheron DEAE-Separon HEMA je slabě až středně basický anex, a proto jeho funkční skupina nekatalyzuje destrukční reakce a při chromatografii nevznikají artefakty.The strongly basic quaternary ammonium anion exchanger Mono Q catalyzes the lactonization of GQ1b on the column and causes disturbances in chromatographic separation based on sialic acid. DEAE-Spheron DEAE-Separon HEMA is a mild to moderately basic anion exchanger and therefore its functional group does not catalyze destructive reactions and artefacts are not produced during chromatography.

Dále jsou uvedeny příklady provedení způsobu separace gangliosidových frakcí ionexovou chromatografii podle vynálezu.The following are exemplary embodiments of a method for separating ganglioside fractions by ion exchange chromatography according to the invention.

Příklad 1Example 1

Byly připraveny gangliosidy k separaci, označeno dále jako vzorek I. [Suzuki, ]. Neurochem., 12 (1965) 629—638.]Gangliosides were prepared for separation, hereinafter referred to as Sample I. [Suzuki,]. Neurochem., 12 (1965) 629-638.]

Anex Spheron DEAE 1 000, zrnění 25—40 μπι kapacita 1,6 mequiv/g byl vpraven ve formě suspenze v methanolu do kolony o průměru 0,9 cm až vytvořil sloupec vysoký cm. Pak byl v koloně promýván 2M roztokem octanu amonného v methanolu (60 mililitrů] a ten byl pak vymýván čistým me· thanolem (200 ml). Poté bylo 47,3 mg gangliosidů (vzorek lj rozmícháno v 1 ml směsi methanol — voda 1 : 1 na suspenzi, která byla vpravena na vrchol anexové kolony. Kolona byla promývána 5 ml methanolu a pak stoupající koncentrací octanu amonného. Byly použity dva lineární gradienty, první od 0 do 0,15 M octanu amonného v methanolu (celkem 83 mlj, druhý strmější od 0,15 do 1 M octanu amonného v methanolu (celkem 70 rol). Kolona byla pak regenerována promytíra 00 ml 1M octanu amonného v methanolu a ekvilibrováua 200 mililitry methanolu.Anion Spheron DEAE 1000, grain size 25-40 μπι capacity 1.6 mequiv / g was introduced as a suspension in methanol into a column with a diameter of 0.9 cm to form a column high cm. The column was washed with a 2M solution of ammonium acetate in methanol (60 ml) and eluted with pure methanol (200 ml), after which 47.3 mg of gangliosides (sample 1j was stirred in 1 ml of methanol-water 1: 1). The column was washed with 5 ml of methanol and then with an increasing concentration of ammonium acetate, using two linear gradients, the first from 0 to 0.15 M ammonium acetate in methanol (total 83 ml, the steeper from 0 to 0.15 M). 0.15 to 1 M ammonium acetate in methanol (70 roles in total) The column was then regenerated with a wash of 00 ml of 1M ammonium acetate in methanol and equilibrated with 200 ml of methanol.

Použitý hydrostatický přetlak odpovídal rozdílu hladiny reservoáru a výtoku 1,8 m. Frakce 1 ml byly brány v intervalech 5 minut a byly vyhodnocovány tenkovrstvou chromatografii. Podle výsledků analýz monosialogangliosidy byly obsaženy ve frakcích 33 -42; disialo- ve frakcích 44—55; trisiaJo- ve frakcích 58—64 a tetra- ve frakcích 65—70.The hydrostatic overpressure used corresponded to a reservoir / effluent difference of 1.8 m. Fractions of 1 ml were taken at 5-minute intervals and were evaluated by thin-layer chromatography. According to the analysis results, monosialogangliosides were contained in fractions 33-42; disialo- in fractions 44-55; trisium in fractions 58-64 and tetra- in fractions 65-70.

Podle odhadu z kolorimetrického vyhodnocení bylo sice ve spojených frakcích získáno 67 % vázané kyseliny sialové ve srovnání s naneseným vzorkem, avšak pouze oddělení monosialogangliosidů bylo úplné, mezi di-, tri-, tetraderiváty docházelo k částečnému překrývání v úpatí píků.It was estimated by colorimetric evaluation that 67% bound sialic acid was recovered in the pooled fractions compared to the loaded sample, but only the monosialoganglioside separation was complete, with di-tri- tetraderivatives partially overlapping at the foot of the peaks.

Příklad 2Example 2

Gangliosidy (vzorek íj byly připraveny podle příkladu 1.Gangliosides (sample I) were prepared according to Example 1.

Použitý anex byl Spheron DEAE 1 000, zrnění 17 «m, kapacita 1,6 mequiv/1 g. Anex v (litr cyklu byl vpraven do kolony ve formě kaše v methanolu a upěchován pulsní metodou [Mikeš O., v Comprehensive Biochemisíry, Vol. 8, Separation Methods, Z. Deil (Editor): Elsevier, Amsterodam 1984, s. 242], Pak byly na vrchol kolony naneseny podvrstvením gangliosidy (vzorek I) v množství 15 mg, suspendované ve směsi 40 cl vody a 300 ,ul methanolu. Po krátké isokratické elucí methanolem (20 ml) byla na kolonu přivedena soustava čtyř lineárních gradientů (všechny roztoky jsou methanolické ]:The anion exchanger used was Spheron DEAE 1000, 17 µm grain, 1.6 mequiv / 1 g capacity. The anion exchanger (a 1 liter cycle was loaded into the column as a slurry in methanol and packed by pulse method [Mikeš O., in Comprehensive Biochemistry, Vol. 8, Separation Methods, Z. Deil (Editor): Elsevier, Amsterdam 1984, p. 242], were then applied to the top of the column by ganglioside (Sample I) underlaying in an amount of 15 mg suspended in a mixture of 40 cl of water and 300 µl. After a short isocratic elution with methanol (20 mL), a set of four linear gradients was fed to the column (all solutions are methanolic):

I) 30 ml MeOH 3- 30 ml 0,1 M octem amonný,(I) 30 ml MeOH 3- 30 ml 0,1 M ammonium vinegar,

II) 10 ml 0,lM + 10 ml 0,5M,II) 10 ml 0.1M + 10 ml 0.5M,

III) 10 ml 0,5M + 10 ml 1M,III) 10 ml 0.5M + 10 ml 1M,

IV) 10 mí 1M + 10 ml 2M octanu amonného.IV) 10 µl of 1M + 10 mL of 2M ammonium acetate.

Eluční roztoky byly na kolonu čerpány proporcionálním programovým mikročerpadlem 68 005 (Vývojové dílny ČSAV) s reverzně pracujícími písty, nastavenými na hodnotu 50%, čímž bylo docíleno minimální pulsace. Pracovní teplota byla 27 °C.The elution solutions were pumped onto the column by a proportional programmable micro pump 68 005 (Development Workshops of the Czechoslovak Academy of Sciences) with reversible pistons set to 50%, thereby achieving a minimum pulsation. The working temperature was 27 ° C.

Frakce o velikosti 1,6 ml byly brány v intervalech 3 minuty. Gangliosidové frakce byly velmi dohře odděleny podle výsledků tenkovrstvé chromatografie (metoda je uvedena v textu k obrázku č. 1). Monosialogangliosidy se nalézaly ve frakcích 33—38, Di- ve frakcích 44—49, Tri: 54—58 a Tetra: 59—63. Ve srovnání s kolorimetrickou hodnotou sialové kyseliny ve směsi gangliosidů nanášených na kolonu, byly ve frakcích spojených podle výše uvedeného klíče získány tyto výtěžky kyseliny sialové vázané glykolipidy: Mono-: 164,8 ,«g; Di-: 167,1 ,ug; Tri-: 99,7 ^g; Tetra-: 16,5 ^g; Celkem: 448 Rg vázané sialové kyseliny, což odpovídá 68,9 % původní hodnoty vázané kyseliny sialové v původním vzorku. Zbylých 32,1 % se nachází v úpatí píku nespojených frakcí a ve ztrátách na koloně i v celkovém procesu, prováděném v tak malém měřítku.Fractions of 1.6 ml were taken at 3 minute intervals. The ganglioside fractions were very hot separated according to the results of the thin-layer chromatography (the method is given in the text of Figure 1). Monosialogangliosides were found in fractions 33-38, Di- in fractions 44-49, Tri: 54-58 and Tetra: 59-63. Compared to the colorimetric value of the sialic acid in the column-loaded ganglioside mixture, the following yields of glycolipid-bound sialic acid were obtained in the fractions collected according to the above key: Mono-: 164.8 g; Di-: 167.1, ug; Tri-: 99.7 µg; Tetra: 16.5 µg; Total: 448 Rg of bound sialic acid corresponding to 68.9% of the original value of bound sialic acid in the original sample. The remaining 32.1% are found at the foot of the unrelated fraction peak and in column losses and in the overall process, carried out on such a small scale.

Příklad 3Example 3

Extrakce gangliosidů byla prováděna jiným způsobem, podle postupu Svennerholma a spol., [Biochim. Biophys. Acta, 617 (1984) 97—103.]. Tento postup umožňuje získat směs gangliosidů obsahující výtěžek tetrasialogangliosidů a i pentasialogangliosidy. Takto připravené gangliosidy jsou dále označovány jako vzorek II.Ganglioside extraction was performed in a different manner, following the procedure of Svennerholm et al., [Biochim. Biophys. Acta, 617 (1984) 97-103.]. This procedure makes it possible to obtain a ganglioside mixture containing both tetrasialoganglioside and pentasialoganglioside yields. The gangliosides thus prepared are hereinafter referred to as Sample II.

Anex a kolona byly stejné jako v příkladu 2, ale anex nebyl z kolony vyjímán, nýbrž regenerován a ekvilibrován po předchozím pokusu přímo na koloně promýváním 2M octanem sodným (20 ml) v methanolu a pak čistým methanolem (350 ml). Vzorek II (25 mg) byl rozmíchán ve směsi 300 μ\ vody + 400 μΐ methanolu a suspenze nanesena podvrstvením do methanolu nad vrcholem ionexu. Zprvu následovala isokratická eluce 20 ml methanolu, pak lineární gradient 35 ml methanolu + 35 ml 0,lM octanu amonného v methanolu, dále lineární gradient 20 ml 0,lM octanu + 20 mililitrů 0,2M octanu v methanolu a nakonec krátký gradient 10 ml 0,2M + 10 ml 0,5M octanu amonného v methanolu. Průtoková rychlost kolonou byla 2,06 ml/min.The anion exchanger and column were the same as in Example 2, but the anion exchanger was not removed from the column but regenerated and equilibrated after previous experiment directly on the column by washing with 2M sodium acetate (20 mL) in methanol and then pure methanol (350 mL). Sample II (25 mg) was mixed in a mixture of 300 µl of water + 400 µΐ of methanol and the suspension was coated by methanol coating over the ionex top. At first there was an isocratic elution with 20 ml of methanol, then a linear gradient of 35 ml of methanol + 35 ml of 0.1M ammonium acetate in methanol, followed by a linear gradient of 20 ml of 0.1M acetate + 20 ml of 0.2M acetate in methanol and finally a short gradient of 10 ml 0 , 2M + 10 mL 0.5M ammonium acetate in methanol. The column flow rate was 2.06 ml / min.

Eluce posledního píku (tetrasialogangliosidů) byla uskutečněna po 52 minutách. Nakonec byla kolona regenerována promytím 20 ml 2M octanu amoného v methanolu a pro další pokus připravena promytím methanolem do vyplavení octanu amonného.The elution of the last peak (tetrasialogangliosides) was performed after 52 minutes. Finally, the column was regenerated by washing with 20 ml of 2M ammonium acetate in methanol and prepared for further experiment by washing with methanol until the ammonium acetate was washed out.

Příklad 4Example 4

Anex, kolona, zařízení a pracovní technika byla shodná s příkladem 2 a 3. Zatížení ionexu a rychlost byly podstatně zvýšeny, gradientovy systém byl zjednodušen.The anion exchanger, column, equipment and working technique were identical to examples 2 and 3. The ion exchange load and velocity were substantially increased, the gradient system was simplified.

mg vzorku II gangliosidů připraveného postupem uvedeným v příkladu 3 bylo suspendováno ve směsi 400 μ\ vody + 400 ,ul methanolu. Chromatografie byla zahájena krátkou isokratickou elucí 20 ml methanolu, pak následoval dlouhý lineární gradient 70 ml methanolu + 70 ml 0,2M octanu amonného v methanolu a krátký strmý lineární gradient 10 ml 0,2M + 10 ml 0,5M octanu amonného v methanolu.mg of the ganglioside sample II prepared as described in Example 3 was suspended in a mixture of 400 µl of water + 400 µl of methanol. Chromatography was started by a short isocratic elution with 20 mL of methanol, followed by a long linear gradient of 70 mL of methanol + 70 mL of 0.2 M ammonium acetate in methanol and a short steep linear gradient of 10 mL of 0.2M + 10 mL of 0.5 M ammonium acetate in methanol.

Mono- až pentasialogangliosidy byly eluovány v prvním gradientu. Druhý gradient sloužil jako pojistka na odhalení dalších případně přítomných anionických látek. Kolona byla poté promyta 20 ml 0,2M octanu za účelem regenerace. Pak byla připravena k další chromatografií 88 minutovým promýváním čistým methanolem (300—350 mililitrů) až bylo docíleno snížení vodivosti pod 10 gS. Potom mohl být nasazen další vzorek.The mono- to pentasialogangliosides were eluted in the first gradient. The second gradient served as a safeguard for detecting other possibly present anionic substances. The column was then washed with 20 mL 0.2M acetate for regeneration. It was then prepared for further chromatography by washing with pure methanol (300-350 milliliters) for 88 minutes until a conductivity of less than 10 gS was achieved. Then another sample could be placed.

Frakce o velikosti 2 ml byly odebírány v intervalech 35 sekund a byly vyhodnocovány chromatografií na tenké vrstvě. Bylo dosaženo rozdělení mono- až pentasialogangliosldů. Výtěžky mono- až tetrasialogangliosidů odpovídají hodnotám uvedeným v příkladu 2. Pentasialogangliosidy byly přítomny v malém množství. Proto bylo nutno silně zakoncentrovat příslušnou frakci a nanést ji na desku tenkovrstvé chromatografie, aby mohly být kvalitativně prokázány.Fractions of 2 ml were collected at 35 second intervals and evaluated by thin layer chromatography. The distribution of mono- to pentasialogangliosides was achieved. The yields of mono- to tetrasialogangliosides correspond to those given in Example 2. Pentasialogangliosides were present in small amounts. Therefore, it was necessary to strongly concentrate the appropriate fraction and apply it to the thin-layer chromatography plate in order to prove it qualitatively.

Gangliosidy nacházejí využití jako biopreparáty k diagnostickým a vědecko-výzkumným účelům jako léčiva nervových onemocnění a jako antigeny k přípravě cílených protilátek.Gangliosides find use as biopreparations for diagnostic and scientific research purposes as drugs for nerve diseases and as antigens for the production of targeted antibodies.

Claims

Method for separating ganglioside fractions by ion exchange chromatography, characterized in that the brain gangliosides are chromatographed according to the sialic acid content of the molecule on a diethylaminoethyl rigid glycol methacrylate macroporous hybrid. INVENTION by a linear gradient of methanol: 0.2M ammonium acetate, potassium or sodium in methanol under pressure 2.0 MPa at room temperature at a specific flow rate of up to 10 ml / cm ³ . min.