CS247097B2

CS247097B2 - A method of immobilizing the aminoacylase enzyme

Info

Publication number: CS247097B2
Application number: CS851312A
Authority: CS
Inventors: Laszlo Boros; Ivan Daroczi; Iren Huber; Jozsefne Ivony; Janosne Kiss; Bela Szajani
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1982-04-06
Filing date: 1985-02-22
Publication date: 1986-11-13
Also published as: CS246055B2

Abstract

Způsob imobilizování enzymu aminoacylasy aktivací parciálně zhydrolyzovaného kopolyméru, připraveného popřípadě alkalickou hydrolýzou kopolyméru akrylamidu s N,N‘-methylen-bis(akrylamidem) a nanesením aminoacylasy, při kterém se parciálně zhydrolyzovaný kopolymer akrylamidu s NX-methylen-bistakrylamidem), připravený alkalickou nebo kyselou hydrolýzou, uvede do reakce s karbodiimidem rozpustným ve vodě nebo rozpustným v organickém rozpouštědle při teplotě pod 0 °C, získaný aktivovaný nosič se smíchá s roztokem aminoacylasy o hodnotě pH 6,5 až 8,5 a vzniklý produkt se promyje a popřípadě se vysuší. Imobllizovaná aminoacylasa se používá k štěpení DL-aminokyselin.A method of immobilizing an aminoacylase enzyme by activating a partially hydrolyzed copolymer, optionally prepared by alkaline hydrolysis of a copolymer of acrylamide with N,N'-methylene-bis(acrylamide) and applying an aminoacylase, in which the partially hydrolyzed copolymer of acrylamide with NX-methylene-bisacrylamide), prepared by alkaline or acidic hydrolysis, is reacted with a carbodiimide soluble in water or soluble in an organic solvent at a temperature below 0 °C, the activated carrier obtained is mixed with an aminoacylase solution with a pH of 6.5 to 8.5 and the resulting product is washed and optionally dried. The immobilized aminoacylase is used to cleave DL-amino acids.

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace enzymu aminoacylasa.The invention relates to a method of immobilizing the enzyme aminoacylase.

Pro imobilizování aminoacylasy isolované z enzymů obsažených ve vepřových ledvinách, nebo aminoacylasy mikrobiálního původu, bylo až dosud popsáno mnoho způsobů. Podle způsobů popsaných v časopisechTo date, many methods have been described for immobilizing aminoacylase isolated from enzymes contained in pig kidneys or aminoacylase of microbial origin. According to the methods described in the magazines

J. Am. Chem. Soc. 81, 4 024 (1959) a Coll. Czech. Chem. Commun. 36, 2 398 (1971) se aminoacylasa naváže na DEAE celulózu iontovými vazbami. Aminoacylasu lze však rovněž imobilizovat kovalentními vazbami.J. Am. Chem. Soc. 81, 4024 (1959) and Coll. Czech. Chem. Commun. 36, 2,398 (1971) binds aminoacylase to DEAE cellulose by ionic bonds. Aminoacylase, however, can also be immobilized by covalent bonds.

Podle jedné ze známých metod se jako nosiče používá kopolymeru akrylamidu s methakrylátem zesítěného N,N-methylen-bis(akrylamidem); nosič se zpracuje hydrazinem, vzniklý produkt se aktivuje dusitanem sodným v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové a na vzniklý azid karboxylové kyseliny se pak naváže enzym (viz časopis Macromolecules 4, 350, 1971).According to one known method, N, N-methylene-bis (acrylamide) crosslinked acrylamide-methacrylate copolymer is used as the carrier; the carrier is treated with hydrazine, the resulting product is activated with sodium nitrite in the presence of hydrochloric acid, and the resulting carboxylic acid azide is then coupled with an enzyme (see Macromolecules 4, 350, 1971).

Podle jiného známého způsobu se nosič typu Enzacrylu AA (polyakrylamidový derivát obsahující aromatické aminoskupiny) aktivuje dusitanem sodným v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové a vzniklý diazoderivát se kopuluje s enzymem (viz časopis Coll. Czech. Chem. Commun, 38, 943, 1973).In another known method, an Enzacryl AA (polyacrylamide derivative containing aromatic amino group) type is activated with sodium nitrite in the presence of hydrochloric acid and the resulting diazoderivative coupled to an enzyme (see Coll. Czech. Chem. Commun, 38, 943, 1973).

Všechny známé způsoby pro mobilizování enzymu mají společnou nevýhodu v tom, že poskytují preparáty s mobilizovaným enzymem s nízkou specifickou aktivitou.All known methods for mobilizing the enzyme have the common disadvantage of providing preparations with mobilized enzyme with low specific activity.

Z francouzské vytištěné přihlášky vynálezu číslo· 2 198 954 je známo mobilizovat enzymy včetně enzymu aminoacylasy mícháním a spojováním enzymu, nebílkovinového pojidla, sesíťujícího prostředku a vody a/nebo organických rozpouštědel v jakémkoliv sledu a promytím získaného produktu vodou. Jakožto pojidel se může použít polyethyleniminů nebo polyaminů a jako sesíťujících prostředků karbodiimidů; jakožto výhodný sled se uvádí nejdříve smíšení enzymu ve vodě a/nebo v organickém rozpouštědle s pojidlem a teprve tato směs se pak mísí se sesíťu jícím činidlem.It is known from French Patent Application No. 2 198 954 to mobilize enzymes including the aminoacylase enzyme by mixing and combining the enzyme, a non-protein binder, a crosslinker and water and / or organic solvents in any sequence and washing the product obtained with water. As binders, polyethyleneimines or polyamines and carbodiimide crosslinking agents can be used; As a preferred sequence, the enzyme is first mixed in water and / or in an organic solvent with a binder before being mixed with the cross-linking agent.

Z amerického patentového spisu číslo 3 794 563 je známé použití polymerů akrylamidu sesítěného například N-methylen-bis-akrylamidem pro imobilizování enzymů. Ve sloupci 1, řádek 69 a ve sloupci 2, řádek 2 tohoto spisu se uvádí, že kovalentní vazba enzymu na polymer má ten nedostatek, že se musí reaktivní podmínky potřebné pro kovalentní vázání pečlivě kontrolovat, aby se předešlo destrukci molekuly enzymu a že je zpravidla obtížné odstranit vyčerpaný enzym z polymeru, jestliže má být do polymeru včleněn čerstvý enzym.U.S. Pat. No. 3,794,563 discloses the use of acrylamide polymers crosslinked with, for example, N-methylene-bis-acrylamide for the immobilization of enzymes. Column 1, line 69 and column 2, line 2 of this specification disclose that the covalent binding of the enzyme to the polymer has the drawback that the reactive conditions required for covalent binding must be carefully controlled to prevent destruction of the enzyme molecule and that difficult to remove spent enzyme from the polymer if fresh enzyme is to be incorporated into the polymer.

Z amerického· patentového spisu číslo 3 933 589 je znám způsob imobilizování enzymu na nosiči, přičemž se enzym, nosič a chemické imobilizační činidlo udržují ve vzájemném styku při teplotě a po dobu dostatečnou k chemické imobilizaci enzymu, přičemž se jako chemického imobilizačního prostředku používá předem připraveného reakčního roztoku alkandiaminu a alkandihalogenidu.U.S. Pat. No. 3,933,589 discloses a method of immobilizing an enzyme on a support, wherein the enzyme, the support and the chemical immobilizing agent are kept in contact with each other at a temperature and for a time sufficient to chemically immobilize the enzyme using a preformed chemical immobilizing agent. of a reaction solution of an alkanediamine and an alkanedihalide.

Z britského patentového spisu č. 1 289 549 je znám způsob přípravy ve vodě nerozpustného enzymového přípravku, při kterém se nechává reagovat enzym rozpuštěný nebo suspendovaný ve vodném roztoku s uhličitanem celulózy nebo s derivátem diazotovaného diaminobenzenu uhličitanu celulózy, přičemž se jako nedostatek tohoto způsobu imobilizace na str. 1, řádek 50 až 53 britského patentového spisu č. 1 257 263 uvádí nízký výtěžek fixovaných bílkovin, nezajištěné vázání bílkovin a jejich denaturace při vázání.British Patent Specification No. 1 289 549 discloses a process for the preparation of a water-insoluble enzyme preparation by reacting an enzyme dissolved or suspended in an aqueous solution with cellulose carbonate or a diazotized diaminobenzene cellulose carbonate derivative, which, as a drawback, is immobilized to 1, lines 50-53 of British Patent Specification No. 1,257,263 discloses low yields of fixed proteins, unsecured protein binding and denaturation upon binding.

V britském patentovém spise č. 1 257 263 se popisuje způsob přípravy produktů obsahujících aktivní bílkovinové látky, při kterém se uvádí substrát, při jehož definování se neuvádí aminoacylasa, do styku s roztokem alespoň jedné aktivní bílkovinové látky v přítomnosti můstkového členu, přičemž alespoň jedna bílkovinová látka je schopna reagovat s můstkovým členem, za vytváření kovalentně vázaných můstků mezi molekulami aktivní bílkovinové látky nebo aktivních bílkovinových látek za vytvoření nebo bez vytvoření takových můstků mezi substrátem a aktivní bílkovinovou látkou nebo aktivními bílkovinovými látkami, načež se substrát spolu s alespoň jednou aktivní bílkovinovou látkou izoluje.British Patent Specification No. 1,257,263 discloses a process for preparing active protein-containing products comprising contacting a substrate which is not defined as aminoacylase with a solution of at least one active protein in the presence of a bridging member, wherein at least one protein is present. the substance is capable of reacting with a bridging member to form covalently bonded bridges between the active protein substance or active protein molecules with or without forming such bridges between the substrate and the active protein substance or active protein, whereupon the substrate together with at least one active protein substance isolates.

Jakkoliv se podle britského patentového spisu č. 1 257 263 připomíná použití karbodiimidů jako můstkových látek, můstková látka se vždy nechává reagovat s enzymem bez předchozího vázání na substrát, jak je zřejmé například ze strany 7, řádek 10 až 21 (v bodu 1 definice předmětu vynálezu) britského patentového spisu č. 1 257 263.Although British Patent No. 1,257,263 mentions the use of carbodiimides as bridging agents, the bridging agent is always reacted with the enzyme without prior binding to the substrate, as is evident from page 7, lines 10 to 21 (at item 1 of the article definition). Invention) of British Patent Specification No. 1,257,263.

V časopise Journal of Applied Biochemistry 1980, 2 (1), str. 72 až 80 se popisuje imobilizování aminoacylasy nosičovým prostředím typu aktivovaného polyakrylamidu, přičemž nosič obsahuje karboxylové funkční skupiny. Není však uvedena ani zmínka o zpracování nosiče parciální hydrolýzou amidových skupin polyakrylamidu ani o aktivaci nosiče karbodimidy. Z tohoto hlediska se uvádí, že polyakrylamidové deriváty obsahující karboxylové skupiny se mohou rovněž připravit kopolymerací akrylamid//N,N‘-methyIen-bis-(akrylamid)u a akrylové kyseliny. Je tedy známo několik způsobů aktivace odlišných od aktivace karbodiimidů, například ve formě azidů kyseliny přes hydrazidy kyseliny.Journal of Applied Biochemistry 1980, 2 (1), pp. 72-80 describes the immobilization of aminoacylase with an activated polyacrylamide type support medium, wherein the support comprises carboxyl functional groups. However, neither the treatment of the support by partial hydrolysis of the amide groups of the polyacrylamide nor the activation of the support by carbodimides is mentioned. In this regard, it is stated that polyacrylamide derivatives containing carboxyl groups can also be prepared by copolymerization of acrylamide / N, N‘-methylene-bis- (acrylamide) u and acrylic acid. Thus, several activation methods other than the activation of carbodiimides are known, for example in the form of acid azides via acid hydrazides.

Úkolem vynálezu je za vyloučení nedostatků známého· stavu techniky vyvinout způsob imobilizování aminoacylasového enzymu za vzniku imobilizovaného enzýmového prostředku majícího mnohem vyšší specifickou účinnost než známé přípravky.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention, while avoiding the drawbacks of the prior art, to provide a method for immobilizing an aminoacylase enzyme to produce an immobilized enzyme composition having a much higher specific activity than known formulations.

Nyní se s překvapením zjistilo, že preparát s imobilizovaným enzymem o specifické aktivitě vyšší nejméně o dva řády, než je aktivita známých prostředků, lze získat tím způsobem, že se aminoacylasa imobilizuje na nosiči připraveném částečnou hydrolýzou Akrylexu typu P, kopolymeru akrylamidu a N,N‘-methylenbis(akrylamidemj.It has now surprisingly been found that a preparation with an immobilized enzyme having a specific activity higher by at least two orders of magnitude than that of the known means can be obtained by immobilizing the aminoacylase on a support prepared by partial hydrolysis of Acrylex type P, copolymer of acrylamide and N, N n-methylenbis (acrylamide).

Akrylex typu P, kuličkový kopolymer akrylamidu s N,N‘-methylen-bis(akrylamidem) (Akrilex P-30, P-100 a P-200) je výrobkem maďarské společnosti Reanal Finomvegyszergyár. Hydrolyzuje-li se tento kopolymer kyselinou (jako kyselinou chlorovodíkovou nebo jinou silnou kyselinou) nebo alkálií (jako hydroxidem sodným, uhličitanem sodným nebo jinou silnou bází), převede se asi 50 % amidických skupin (—CONH2) na karboxylové skupiny, zatím co zbývající amidické skupiny se nehydrolyzují ani za ostrých reakčních podmínek.Acrylex P-type, a copolymer of acrylamide with N, N‘-methylene-bis (acrylamide) (Akrilex P-30, P-100 and P-200) is a product of the Hungarian company Reanal Finomvegyszergyár. If this copolymer is hydrolyzed with an acid (such as hydrochloric acid or another strong acid) or an alkali (such as sodium hydroxide, sodium carbonate or another strong base), about 50% of the amide groups (—CONH2) are converted to carboxyl groups while the remaining amide groups the groups do not hydrolyze even under harsh reaction conditions.

V důsledku toho jsou ve zhydrolyzovaném kopolymeru umístěny mezi vzniklými karboxylovými skupinami nezhydrolyzované amidické skupiny, které fixují karboxylové skupiny ve vhodných prostorových polohách. Když se o sobě známou karbodiimidovou aktivační metodou naváže aminoacylasa na karboxylové skupiny, funkce jednotlivých imobilizovaných molekul enzymu navzájem neinterferují vzhledem k příznivým sterickým polohám karboxylových skupin; proto takto připravený preparát obsahující imobilizovaný enzym vykazuje velmi vysokou specifickou aktivitu.As a result, in the hydrolyzed copolymer, unhydrolyzed amide groups are placed between the formed carboxyl groups, which fix the carboxyl groups at appropriate spatial positions. When aminoacylase is linked to carboxyl groups by a known carbodiimide activation method, the functions of the individual immobilized enzyme molecules do not interfere with each other due to the favorable steric positions of the carboxyl groups; therefore, the preparation prepared containing the immobilized enzyme exhibits a very high specific activity.

Vynález se tedy týká způsobu imobilizace enzymu aktivováním parciálně zhydrolyzovaného kopolymeru, připraveného podrobováním akrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamidjového kopolymeru, popřípadě alkalické hydrolýze a následným nanesením aminoacylasy, který je charakterizován tím, že se částečně zhydrolyzovaný akrylamid/N,N‘-methylen-bis (akrylamid)ový kopolymer, připravený kyselou nebo alkalickou hydrolýzou, uvede do reakce o sobě známým způsobem s karbodiimidem rozpustným ve vodě nebo rozpustným v organickém rozpouštědle při teplotě pod 0 °C, získaný aktivovaný nosič se smíchá s roztokem aminoacylasy o hodnotě pH 6,5 až 8,5 a vzniklý produkt se promyje a pak se popřípadě vysuší.The invention therefore relates to a process for immobilizing an enzyme by activating a partially hydrolyzed copolymer prepared by subjecting an acrylamide / N, N'-methylene-bis- (acrylamide copolymer) optionally to alkaline hydrolysis and subsequent deposition of an aminoacylase, characterized in that the partially hydrolyzed acrylamide / N, The N'-methylene-bis (acrylamide) copolymer, prepared by acidic or alkaline hydrolysis, is reacted in a manner known per se with water-soluble or organic-soluble carbodiimide at a temperature below 0 ° C, the activated carrier obtained is mixed with an aminoacylase solution pH 6.5 to 8.5 and the product is washed and then optionally dried.

Při způsobu podle vynálezu se tedy používá parciálně zhydrolyzovaného akrylamid/N,N‘-methylen-bis (akrylamid) ového kopolymeru typu Akrylex P, jakožto nosiče, zatímco podle francouzské vytištěné přihlášky vynálezu č. 2 198 954 se takového nosiče nemůže použít, nýbrž se může používat toliko polyethyleniminů nebo polyaminů; hlavním rozdílem mezi způsobem podle vynálezu a způsobem podle vytištěné francouzské přihlášky vynálezu č. 2 198 954 je však skutečnost, že podle vynálezu se karboxylové skupiny akrylamid (akrylová kyselina) N,N‘-methylen-bis- (akrylamid jo vého kopolymeru, vytvořené parciální hydrolýzou akrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamid) ového kopolymeru, jakožto nosiče aktivují karbodiimidovou sloučeninou a takto připravený derivát typu O-acylisomočoviny se nechává reagovat s primárními amlnoskupinami enzymu, zatímco při způsobu podle vytištěné francouzské přihlášky vynálezu č. 2 198 954 míšením polymerů obsahujících iminoskupiny nebo aminoskupiny, karbodiimidové sloučeniny a enzymu za odpovídajících podmínek karboxylové skupiny aspargylových a/nebo glutamylových postranních řetězců enzymu poskytují s karbodiimidovou sloučeninou derivát typu O-acylisomočoviny, který reaguje s iminoskupinami nebo s aminoskupinami nosiče, přičemž nevýhodou tohoto způsobu je nemožnost vyloučení tvoření vazeb mezi molekulami aktivovaného enzymu nebo mezi molekulami enzymu, což zhoršuje stupeň účinnosti imobilizační reakce, zatímco reakce při způsobu podle vynálezu je přísně kontrolována.Thus, in the process of the present invention, a partially hydrolysed acrylamide / N, N'-methylene-bis (acrylamide) acrylic P-type copolymer is used as a carrier, whereas according to French Patent Application No. 2 198 954 such a carrier cannot be used, can only use polyethyleneimines or polyamines; however, the main difference between the process of the invention and the process of French Patent Application No. 2 198 954 is that, according to the invention, the carboxyl groups acrylamide (acrylic acid) of N, N'-methylene-bis- (acrylamide) copolymer formed partially by hydrolyzing the acrylamide / N, N'-methylene-bis- (acrylamide) copolymer as the carrier activates the carbodiimide compound and the thus prepared O-acylisourea type derivative is reacted with the primary amino groups of the enzyme, while in the process of French Patent Application No. 2 198,954 by mixing polymers containing imino or amino groups, carbodiimide compound and enzyme under the corresponding carboxyl group of the aspargyl and / or glutamyl side chains of the enzyme provide with the carbodiimide compound an O-acylisourea type derivative that reacts with the imino or carrier amino groups The disadvantage of this method is that it is impossible to avoid bonding between the activated enzyme molecules or between the enzyme molecules, which worsens the degree of efficiency of the immobilization reaction, while the reaction in the method of the invention is strictly controlled.

Způsob podle vynálezu se značně liší také od způsobu podle amerického patentového spisu č. 3 794 563, jelikož se podle amerického patentového spisu neprovádí žádné sesíťování karbodiimidových sloučenin a kromě toho se jako enzym neuvádí aminoacylasa.The process according to the invention also differs considerably from the process described in U.S. Pat. No. 3,794,563 since no cross-linking of the carbodiimide compounds is carried out in the U.S. patent and, moreover, no aminoacylase is mentioned as an enzyme.

Způsob podle vynálezu se také značně liší od způsobu podle amerického patentového spisu č. 3 933 589, jelikož nosiče používané podle vynálezu jsou zcela odlišné od nosičů používaných podle amerického patentového spisu č. 3 933 589, což také platí pro karbodiimidovou sloučeninu používanou při způsobu podle vynálezu na rozdíl od reakčního roztoku alkandihalogenidu a alkandlaminu, používaného při způsobu podle amerického patentového spisu, který se nijak netýká karbodiimidové sloučeniny jako způsob podle vynálezu.The process of the invention also differs considerably from the process of U.S. Pat. No. 3,933,589, as the carriers used in the present invention are quite different from those of the U.S. Pat. No. 3,933,589, which also applies to the carbodiimide compound used in the process of U.S. Pat. The present invention, in contrast to the reaction solution of an alkane dihalide and an alkane amine used in the process of the US patent, does not refer to the carbodiimide compound in any way as the process of the invention.

Mezi způsobem podle vynálezu a mezi způsobem imobilizace podle britského patentového spisu č. 1 289 549 je zásadní rozdíl v tom, že se podle britského patentového spisu používá uhličitanu celulózy nebo jeho diazotovaného diamínobenzenového derivátu zatímco podle vynálezu parciálně zhydrolyzovaného akrylamid/Njňf-methylen-bis- (akrylamid) ového kopolymeru.Between the method of the invention and the method of immobilization of British Patent Specification No. 1,289,549, there is a fundamental difference in that the British patent uses cellulose carbonate or its diazotized diamine-benzene derivative, while partially hydrolylated acrylamide / N, N-methylene-bis- (acrylamide) copolymer.

Přičemž nevýhody produktů podle britského patentového spisu č. 1 289 549 byly již připomenuty, zvláště nízký výtěžek fixovaných bílkovin, nezajištění vázání bílkovin a jejich odbourávání při vázání, zatímco k těmto nedostatkům při způsobu podle vynálezu nedochází. Při způsobu imobilizování podle vynálezu se dosahuje vyšších výtěžků (76 °/o) imobilizovaného enzymu aminoacylasy a vzniklá kovalentní vazba je pevná (může se štěpit pouze varem v silně alkalickém nebo v silně kyselém prostředí).While the disadvantages of the products of British Patent Specification No. 1 289 549 have already been mentioned, particularly the low yield of fixed proteins, the lack of protein binding and their degradation during binding, while these drawbacks do not occur in the process of the invention. In the immobilization process of the invention, higher yields (76%) of the immobilized aminoacylase enzyme are obtained and the covalent bond formed is solid (can only be resolved by boiling in a strongly alkaline or strongly acidic medium).

Na rozdíl od způsobu podle britského patentového spisu č. 1 257 263, při kterém se můstkové činidlo nechává vždy reagovat s enzymem bez jeho předchozího vázání na substrát, při způsobu podle vynálezu se karbodiimidová sloučenina nejdříve váže naIn contrast to the method of British Patent Specification No. 1,257,263, in which the bridging agent is always reacted with the enzyme without prior binding to the substrate, the method of the invention first binds the carbodiimide compound to

247037 akrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamid)ový kopolymer a jedině takto získaný materiál se zpracovává roztokem aminoacylasy.247037 acrylamide / N, N‘-methylene-bis- (acrylamide) copolymer and only the material so obtained is treated with an aminoacylase solution.

Z britského patentového spisu č. 1 257 263 tedy není známa ani největší část skutečností o způsobu imobilizace podle vynálezu uváděných v předvýznakové části definice předmětu vynálezu ani skutečnosti uváděné ve význakové části. Způsob podle vynálezu ve srovnání se způsobem podle britského patentového spisu č. 1 257 263 zahrnuje také rozdíly již uvedené při srovnávání s jinými způsoby imobilizování.Thus, from British Patent Specification No. 1,257,263, neither the majority of the facts of the method of immobilization according to the invention set forth in the preamble of the definition of the subject matter nor the facts set forth in the feature part are known. The method of the invention, compared to the method of British Patent Specification No. 1,257,263, also includes the differences already mentioned when compared to other methods of immobilization.

Parciálně zhydrolyzovaný akrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamid) ový kopolymer, používaný při způsobu imobilizování podle vynálezu, má mnohem výhodnější vlastnosti než jiné nosiče, jako nosiče získané kopolymerací akrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamid )u a akrylové kyseliny. Kromě toho je aktivita aminoacylasy, imobilizované způsobem podle vynálezu, o dva řády vyšší než aminoacylasy aktivované například ve formě azidu kyseliny přes hydrazld kyseliny.The partially hydrolyzed acrylamide / N, N'-methylene-bis- (acrylamide) copolymer used in the immobilization process of the present invention has much more advantageous properties than other carriers, such as those obtained by acrylamide / N, N'-methylene-bis- ( acrylamide and acrylic acid. In addition, the aminoacylase activity immobilized by the process of the invention is two orders of magnitude higher than the aminoacylase activated, for example, in the form of an acid azide via the hydrazide acid.

Jakkoliv podle dosud známých způsobů aktivace se dosáhlo horších výsledků, je způsob imobilizování aminoacylasy podle vynálezu vázáním aminoacylasy na O-acylisomočovinový meziprodukt, vytvořený aktivací karboxylových skupin nosiče připraveného parciální hydrolýzou polyakrylamidakrylamid/N,N‘-methylen-bis- (akrylamid) ového kopolymerů karbodiimidovou sloučeninou založený na vynálezecké aktivitě i se zřetelem na poznatky podle J. Appl. Biochem., 1980, 2(1), str. 72 až 80.Although worse results have been achieved according to hitherto known methods of activation, the method of immobilizing the aminoacylase of the invention is by coupling the aminoacylase to the O-acylisourea intermediate formed by activation of the carboxyl groups of the carrier prepared by partial hydrolysis of polyacrylamidacrylamide / N, N'-methylene-bis- a compound based on the inventive activity and in light of the teachings of J. Appl. Biochem., 1980, 2 (1), pp. 72-80.

Jako enzymu se při způsobu podle vynálezu může používat aminoacylasy jakéhokoliv původu a izolované jakoukoliv metodou, avšak s výhodou se jako výchozí látky používá enzymu izolovaného z ledvin savců novým způsobem podle evropské patentové přihlášky č. 81900 726.1 (číslo publikace 59 182).Amino acylases of any origin and isolated by any method can be used as the enzyme in the process of the invention, but preferably the enzyme used is a mammalian kidney isolated from the novel process according to European Patent Application No. 81900 726.1 (publication number 59 182).

Jako karbodiimidové sloučeniny lze k aktivování částečně zhydrolyzovaného kopolymerů typu Akrilexu P používat například metho-p-toluensulfonátu l-cyklohexyl-3- (2-morfollnoethyl) karbodiimidu nebo 1-ethyl-3- (3‘-dimethylaminopr opyl) karbodiimidu.As carbodiimide compounds, for example, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate or 1-ethyl-3- (3‘-dimethylaminopropyl) carbodiimide can be used to activate partially hydrolyzed Akrilex P-type copolymers.

S výhodou se k tomuto účelu používá ve vodě rozpustných karbodiimidů. Z karbodiimidů rozpustných pouze v organických rozpouštědlech lze při způsobu podle vynálezu používat pouze takových sloučenin, které jsou dostatečně rozpustné v daných organických rozpouštědlech i při nízkých teplotách, tedy při teplotách pod 0 °C.Water-soluble carbodiimides are preferably used for this purpose. Of the organic solvent-soluble carbodiimides, only those compounds which are sufficiently soluble in the organic solvents at low temperatures, i.e. below 0 ° C, can be used in the process of the invention.

Aminoacylasa se aplikuje na aktivovaný nosič z roztoku o hodnotě pH 6,5 až 8,5, s výhodou z téměř neutrálního roztoku (hodnota pH přibližně 7,0). Výhodně se používá roztoku aminoacylasy v 0,1 molárním pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0.Aminoacylase is applied to the activated carrier from a solution of pH 6.5 to 8.5, preferably from an almost neutral solution (pH about 7.0). Preferably, a solution of aminoacylase in 0.1 molar potassium phosphate buffer at pH 7.0 is used.

Preparát s imobilizovaným enzymem, získaný při shora uvedené kopulační reakci, se o sobě známým způsobem promy.je a popřípadě se vysuší. Enzymový preparát lze rovněž skladovat, účelně ve formě vodné suspenze v přítomnosti vhodného stabilizačního činidla, jako je například azid sodný.The immobilized enzyme preparation obtained in the above coupling reaction is washed in a known manner and optionally dried. The enzyme preparation may also be stored, conveniently in the form of an aqueous suspension in the presence of a suitable stabilizing agent, such as sodium azide.

Specifická aktivita preparátů s imobilizovanou aminoacylasou, připravených způsobem podle vynálezu, je 150 až 200 jednotek na 1 mg suchého gelu, což ve srovnání se specifickou aktivitou 0,55 až 2,24 jednotky na miligram suchého gelu u preparátů připravitelných způsobem popsaným v časopise Macromolecules 4, 350 (1971) znamená zvýšení velikosti aktivity při nejmenším o dva řády.The specific activity of the immobilized aminoacylase preparations prepared according to the process of the invention is 150 to 200 units per 1 mg of dry gel, compared to a specific activity of 0.55 to 2.24 units per milligram of dry gel for preparations obtainable by the method described in Macromolecules 4 , 350 (1971) means increasing the amount of activity by at least two orders of magnitude.

Při zkouškách nových preparátů s imobilizovaným enzymem bylo neočekávaně zjištěno, že po imobilizování enzymu došlo ke zvýšení jeho stability v· alkalické oblasti hodnot pH. Tato vlastnost je velmi výhodná v případě, že se preparátu s imobilizovaným enzymem používá k enzymatickému štěpení DL-aminokyselin. Je známo, že enzymatické štěpení DL-aminokyselin probíhá nejrychleji při hodnotě pH přibližně 7,5 a reakční rychlost klesá s klesající hodnotou pH.Unexpectedly, when testing new preparations with immobilized enzyme, it was found that after immobilizing the enzyme its stability in the alkaline pH range increased. This property is very advantageous when the immobilized enzyme preparation is used for enzymatic cleavage of DL-amino acids. It is known that enzymatic cleavage of DL-amino acids occurs most rapidly at a pH of about 7.5 and the reaction rate decreases with decreasing pH.

Vzhledem k tomu, že se hodnota pH reakční směsi během postupujícího štěpení stále posunuje do kyselé oblasti, reakční rychlost s časem kontinuálně klesá. Když se ke štěpení DL-aminokyselin použije nových enzymatických preparátů podle vynálezu, které vykazují zvýšenou stabilitu v alkalické oblasti hodnot pH, může se štěpení zahájit při vyšších hodnotách pH než obvykle a tím se kompenzuje snížení reakční rychlosti způsobené kontinuálním poklesem hodnoty pH.As the pH of the reaction mixture continues to shift into the acidic region during the progressive cleavage, the reaction rate continuously decreases with time. When the novel enzymatic preparations of the present invention, which exhibit increased stability in the alkaline pH range, are used to cleave the DL-amino acids, cleavage can be initiated at higher pH values than usual, thereby compensating for the decrease in reaction rate caused by a continuous decrease in pH.

Způsob podle vynálezu podrobně objasňuje následující příklad provedení, který však rozsah vynálezu žádným způsobem neomezuje.The process according to the invention is explained in detail by the following example, which is not intended to limit the scope of the invention in any way.

PříkladExample

Suspenze 30 g suchého gelu Akrilexu P-100 v jednom litru 1N vodného roztoku hydroxidu sodného se zahřívá po dobu 3 hodin na 50 °C. Nabobtnalý gel se promývá do neutrální reakce 12 litry destilované vody a pak se pokračuje v promývání 10,5 litru 0,05 N vodné kyseliny chlorovodíkové. Nakonec se gel promyje ještě 30 litry destilované vody a pak se lyofilizuje. Získá se 26 g nosného materiálu o vázací kapacitě 6,14 miliekvivalentu/g.A suspension of 30 g of Akrilex P-100 dry gel in 1 liter of 1N aqueous sodium hydroxide solution was heated at 50 ° C for 3 hours. The swollen gel is washed until neutral with 12 liters of distilled water and then washed with 10.5 liters of 0.05 N aqueous hydrochloric acid. Finally, the gel is washed with a further 30 liters of distilled water and then lyophilized. 26 g of carrier material with a binding capacity of 6.14 milliequivalents / g are obtained.

Možnost a)Option a)

K suspenzi 10 g suchého gelu, připraveného shora popsaným způsobem, v 500 ml pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0 se za stálého míchání a za chlazení ledovou vodou přidá roztok 20 g metho-p-toluensulfonátu l-cyklohexyl-3- (2-morf olinoethyl) karbodiimidu ve 250 ml chladného (-)-4 °C) roztoku stejného pufru. Po 10 mi247037 nutách míchání se přidá roztok 5 g aminoacylasy, připravené z přečištěných vepřových ledvin, ve 250. ml chladného (+4 °C) roztoku pufru a suspenze se míchá po dobu 48 hodin při teplotě -)-4 °C.To a suspension of 10 g of dry gel prepared as described above in 500 ml of potassium phosphate buffer, pH 7.0, under stirring and cooling with ice water, is added a solution of 20 g of 1-cyclohexyl-3- (2-metho-p-toluenesulfonate). (morpholinoethyl) carbodiimide in 250 ml cold (-) - 4 ° C) solution of the same buffer. After 10 minutes of stirring, a solution of 5 g of aminoacylase, prepared from purified pork kidney, in 250 ml of cold (+4 ° C) buffer solution is added and the suspension is stirred for 48 hours at - 4 ° C.

Gel se oddělí a promyje postupně třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0, třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného obsahujícího rovněž 0,5 molu chloridu sodného (hodnota pH = 7,0) a třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného. Pak se gel promývá až je prostý solí čtyřmi dávkami po 2,5 litru destilované vody a lyofilizuje se. Získá se 18 g preparátu s imobilizovaným enzymem aminoacylasou.The gel was separated and washed successively with three portions of 1 liter 0.1 molar potassium phosphate buffer, pH 7.0, three portions of 1 liter 0.1 molar potassium phosphate buffer, also containing 0.5 moles of sodium chloride (pH = 7). , And three portions of 1 liter of 0.1 molar potassium phosphate buffer. The gel is then washed until it is salt-free in four portions of 2.5 liters of distilled water and lyophilized. 18 g of the preparation with immobilized enzyme aminoacylase are obtained.

Aktivita:Activity:

hydrolýza 158 μΐηοΐ N-acetyl-L-methioninu/hodina/mg suché substance.hydrolysis 158 μΐηοΐ N-acetyl-L-methionine / hour / mg dry substance.

Použitá aminoacylasa se připraví tímto způsobem: 8 kg přečištěných vepřových ledvin se rozmělní a pak zhomogenizuje se 16 litry chladné (+4 °C) destilované vody. Zhomogenizovaná směs se míchá po dobu jedné hodiny v ledové lázni a pak se odstředí. Supernatant se zahřeje na teplotu 70 °C, udržuje se na této teplotě po dobu 10 minut, pak se směs ochladí v lázni s ledovou vodou a odstředí se. K supernatantu se přidá 2 554 g síranu amonného, směs se nechá stát přes noc a vzniklá suspenze se odstředí.The aminoacylase used is prepared as follows: 8 kg of purified pork kidney are ground and then homogenized with 16 liters of cold (+4 ° C) distilled water. The homogenized mixture was stirred for 1 hour in an ice bath and then centrifuged. The supernatant was heated to 70 ° C, held at that temperature for 10 minutes, then cooled in an ice water bath and centrifuged. To the supernatant was added 2554 g of ammonium sulfate, the mixture was allowed to stand overnight, and the resulting suspension was centrifuged.

Oddělená sraženina se rozpustí v malém množství chladné (-(-4 °C) destilované vody a roztok se dialyzuje proti destilované vodě až je prostý solí. Zdialyzovaný roztok se zfiltruje a filtrát se lyofilizuje: získá se 7,2 gramu aminoacylasy.The separated precipitate is dissolved in a small amount of cold (- (- 4 ° C) distilled water) and the solution is dialyzed against distilled water until it is free of salt, filtered and the filtrate lyophilized to give 7.2 g of aminoacylase.

Aktivita:Activity:

hydrolýza 2 735 μΐηοΐ N-acetyl-L-methioninu/hod. mg bílkoviny.hydrolysis of 2,735 μΐηοΐ N-acetyl-L-methionine / hour mg protein.

Možnost b)Option b)

Suspenduje se 10 g suchého gelu, připraveného shora popsaným způsobem, v 500 ml 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0 a k suspenzi se za stálého míchání a za chlazení ledovou vodnou lázní přidá roztok 10 g l-ethyl-3-(3‘-dimethylaminopropyljkarbodiimidu ve 250 ml chladného (-j-4 ’°C) roztoku stejného pufru. Po 10 minutách míchání se přidá roztok 5 g aminoacylasy, připravené shora popsaným způsobem, ve 250 ml chladného (+4 °C) roztoku pufru a suspenze se míchá po dobu 48 hodin při teplotě +4 °C. Gel se oddělí a promyje se postupně třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného, třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního fosforečnanu draselného obsahujícího rovněž 0,3 molu chloridu sodného a třemi dávkami po 1 litru 0,1 molárního pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0. Pak se gel promývá až do odstranění solí čtyřmi dávkami po 2,5 litru destilované vody a lyofilizuje se. Získá se 16 g preparátu obsahujícího imobilizovanou amlnoacylasu.10 g of dry gel prepared as described above are suspended in 500 ml of 0.1 molar potassium phosphate buffer pH 7.0 and a solution of 10 g of 1-ethyl-3- is added under stirring and cooling with an ice-water bath. (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide in 250 ml of cold (-4 DEG C.) solution of the same buffer After stirring for 10 minutes, a solution of 5 g of aminoacylase prepared as described above in 250 ml of cold (+4 DEG C.) buffer solution is added. and the suspension is stirred for 48 hours at +4 [deg.] C. The gel is separated and washed successively with three portions of 1 liter of 0.1 molar potassium phosphate buffer, three portions of 1 liter of 0.1 molar potassium phosphate also containing 0, 0. 3 moles of sodium chloride and three portions of 1 liter of 0.1 molar potassium phosphate buffer, pH 7.0, and then the gel is washed until four salts of 2.5 liters of distilled water and lyofi are removed. 16 g of a preparation containing immobilized amlnoacylase are obtained.

Aktivita:Activity:

hydrolýza 202 μηιοί N-acetyl-L-methioninu/hodina/mg suché substance.hydrolysis 202 μηιοί N-acetyl-L-methionine / hour / mg dry substance.

Claims

A method for immobilizing an aminoacylase enzyme by activating a partially hydrolyzed copolymer prepared by acidic or alkaline hydrolysis of a copolymer of acrylamide with N, N'-methylene-bis (acrylamide) and deposition of aminoacylase, characterized in that the partially hydrolyzed copolymer of acrylamide with N, N'-methylene-bis (acrylamide) is reacted with water-soluble or organic solvent-soluble carbodiimide at a temperature below 0 ° C, the activated carrier obtained is mixed with an aminoacylase solution of pH 6.5 to 8.5, and the product is washed and optionally dried .