CS246727B1

CS246727B1 - Method of izotachophoretic analysis and column for its performance

Info

Publication number: CS246727B1
Application number: CS578284A
Authority: CS
Inventors: Vladislav Dolnik; Mirko Deml; Petr Bocek
Original assignee: Vladislav Dolnik; Mirko Deml; Petr Bocek
Priority date: 1984-07-27
Filing date: 1984-07-27
Publication date: 1986-11-13

Abstract

Podstatou způsobu je, že analyzovaný vzorek je nejprve rozseparován v gelu a poté analyzován ve volném roztoku. Kolona pro tuto analýzu je opatřena nejméně jedním separačním plochým kanálem přecházejícím přes první redukční kanál do vyrovnávacího kanálu a přes druhý redukční kanál do detekčního kanálu.The essence of the method is that the sample to be analyzed it is first separated in the gel and then analyzed in free solution. The column for this analysis is least equipped one separation flat channel passing through the first reduction channel to of the equalization channel and the second reduction channel to the detection channel.

Description

Vynález se týká způsobu izotachoforetické analýzy a kolony k provádění tohoto způsobu, zejména k separaci velkých objemů vzorků.The invention relates to an isotachophoretic analysis method and to a column for carrying out the method, in particular for separating large volumes of samples.

Izotachoforetická separace vzorků se obvykle provádí buď v kapiláře ve volných roztocích elektrolytu, nebo ve stabilizujícím prostředí, například v gelu. Zvětšování objemu analyzovaného vzorku zvyšuje nároky na separační náboj k rozseparování vzorku před jeho průchodem detekční celou. To ve svých důsledcích vede u klasického uspořádání s jednou kapilárou k prodloužení separační kapiláry a tím ke zvětšení doby analýzy a zvýšení napětí elektrického zdroje konstatního proudu. Čas analýzy lze zkrátit účinným chlazením. Zvyšují se tím však nároky na zvýšení napětí pro prodlouženou kolonu. Požadavky na použité vysoké napětí lze snížit použitím hydrodynamického protiproudu, prodloužený čas analýzy však nelze již dále krátit. Jiný způsob používá zvýšení zádrže kolony koncentračním skokem elektrolytů s pomocnou elektrodou, kde v separační části kolony je užíván elektrolyt o vyšší koncentraci. Tímto způsobem se snižuje požadované napětí zdroje i čas analýzy. Nevýhodou tohoto způsobu je omezená možnost zvyšování koncentrace elektrolytů. Dalším způsobem je technika spojených kolon, kdy se zvýšení zádrže separační části kolony dosahuje zvětšením jejího geometrického průřezu. Protože průměr kapiláry je limitován stabilizačním efektem do 1 mm, zařízení s více sériově zapojenými, kanály se neužívá. Vlastní vstup do kapiláry většího průřezu bývá řešen úzkým kanálkem, kolmým na směr elektrického pole v separační kapiláře. Nevýhodou tohoto uspořádání je přehřívání kanálku při vyšších proudech a omezení možností použití kapilár pouze do průměru , asi 0,8 mm. Použitím kapilár o větším průměru se snižuje stabilizační efekt.Isotachophoretic separation of samples is usually carried out either in a capillary in free electrolyte solutions or in a stabilizing environment, such as a gel. Increasing the volume of the sample to be analyzed increases the separation charge requirement to separate the sample before it passes through the detection cell. As a consequence, in a conventional single capillary arrangement, this leads to an extension of the separation capillary, thereby increasing the analysis time and increasing the voltage of the constant current source. The analysis time can be shortened by efficient cooling. However, this increases the demand for increasing the voltage for the elongated column. The requirements for the high voltage used can be reduced by using a hydrodynamic countercurrent, but the extended analysis time cannot be further reduced. Another method employs an increase in column retention by a concentration step of electrolytes with an auxiliary electrode, wherein a higher concentration electrolyte is used in the separation section of the column. This reduces the required source voltage and analysis time. The disadvantage of this method is the limited possibility of increasing the electrolyte concentration. Another method is the coupled column technique, where the retention of the separation portion of the column is achieved by increasing its geometric cross-section. Since the capillary diameter is limited to a stabilization effect of up to 1 mm, a device with multiple series-connected channels is not used. The actual entry into the capillary of a larger cross-section is solved by a narrow channel perpendicular to the direction of the electric field in the separation capillary. A disadvantage of this arrangement is the overheating of the channel at higher currents and the capability of using capillaries only up to a diameter of about 0.8 mm. The use of larger diameter capillaries reduces the stabilizing effect.

Tyto dosavadní nevýhody odstraňuje způsob izotachoforetické analýzy se separací vzorků, jehož podstatou je, že analyzovaný vzorek se nejprve rozseparuje v gelu a poté analyzuje ve volném roztoku.The method of isotachophoretic analysis with sample separation, which is based on the fact that the analyzed sample is first separated in a gel and then analyzed in a free solution, removes these disadvantages.

K tomuto způsobu slouží kolona tvořená nejméně jedním separaěním kanálem, přecházejícím přes první redukční kanál do vyrovnávacího kanálu a přes druhý redukční kanál do detekčního kanálu.For this method, a column formed by at least one separation channel passes through the first reduction channel to the equalization channel and through the second reduction channel to the detection channel.

Hlavní předností způsobu a zařízení podle vynálezu je použití kombinace obou způsobů separace a možnost použití kolon s plochým kanálem o větším průřezu a tím dosažení separace velkých objemů bez zvvšování nároků na čas analýzy nebo zvýšení elektrického napětí pří dokonalém a účinném chlazení separačních kanálů i ostatních částí zařízení.The main advantage of the method and apparatus according to the invention is the use of a combination of both separation methods and the possibility of using flat channel columns with a larger cross-section and thus achieving large volume separation without increasing analysis time requirements or increasing the voltage. .

Konkrétní příklad způsobu byl proveden při analýze směsí sestávající z 10~⁶ mol/1 1 kreatininu v 0,14 mol/1 1 chloridu sodného se separace prováděla v suspenzi gelu v tomto případě granulovaném polyakrylamidu v 0,01 mol/1 1 octanu draselného. Poté se provedla analýza ve volném roztoku 0,01 mol/1 1 octanu draselného.A particular example of the method was carried out when analyzing mixtures consisting of 10 ^-6 mol / l creatinine in 0.14 mol / l sodium chloride, separation was carried out in a gel suspension of this case granulated polyacrylamide in 0.01 mol / l potassium acetate. The analysis was then carried out in a free solution of 0.01 mol / L potassium acetate.

Příklad provedení kolony blíže objasní přiložený výkres zařízení, kde na obr. 1 je znázorněno uspořádání kolony v čelním osovém řezu a na obr. 2 v pohledu shora.An exemplary embodiment of the column is illustrated in more detail in the accompanying drawing of the apparatus, in which Fig. 1 shows the arrangement of the column in a front axial section and Fig. 2 in a top view.

Jak patrno z obr. 1 a 2 je kolona zhotovena z bloku 1 ze syntetické pryskyřice licí technologií, ve kterém je vytvořen separační kanál 2 o rozměrech asi 20 χ 1 x 100 milimetrů. Jeho spodní strana je od chladicího bloku 3 oddělena vrstvou pryskyřice o tloušťce 0,2 mm. Separační kanál 2 se zužuje přes první redukční kanál 4 nálevkového tvaru ve vyrovnávací kanál 5 šířky 1 milimetr, který přechází přes druhý redukční kanál 6 do detekčního kanálu 7 kruhového průřezu a vybaveného analytickým detektorem 8. Na začátek separačního kanálu 2 je připojena dávkovacím kohoutem 9 elektrodová komora 23. V obou redukčních kanálech 4, 6 jsou uspořádány první a druhý vtokový kohout 10, 11 uzavírající přívod k první a druhé elektrodové komoře 14, 15. Elektrodové komory 14, 15 jsou rozděleny semipermeabilní membránou 20 na elektrodový prostor a tlumicí prostor a jsou opatřeny prvním a druhým napouštěcím kohoutem 16, 17. Těsně před vtokovými kohouty 10, 11 jsou umístěny pomocné detektory 18, 19 a na konci detekčního kanálu 7 třetí elektrodová komora 21 s třetím napouštěcím kohoutem 22.As can be seen in Figures 1 and 2, the column is made of a synthetic resin block 1 by casting technology, in which a separation channel 2 is formed having dimensions of about 20 x 1 x 100 millimeters. Its underside is separated from the cooling block 3 by a 0.2 mm thick resin layer. The separation channel 2 tapers through the first funnel-shaped reduction channel 4 into an equalizing channel 5 of 1 millimeter width, which passes through the second reduction channel 6 into a detection channel 7 of circular cross section and equipped with an analytical detector 8. In both reduction channels 4, 6, first and second inlet taps 10, 11 are provided, closing the inlet to the first and second electrode chambers 14, 15. The electrode chambers 14, 15 are divided by a semipermeable membrane 20 into an electrode chamber and a damping chamber. Auxiliary detectors 18, 19 are located just in front of the inlet taps 10, 11 and at the end of the detection channel 7 a third electrode chamber 21 with a third inlet tap 22 is provided.

Způsob analýzy v tomto zařízení probíhá takto: Detekční kanál 7 se naplní volným roztokem vedoucího elektrolytu při naplněném otevřeném napouštěcím kohoutu 22, při otevřeném dávkovacím kohoutu 9 a zavřených vtokových kohoutech 10, 11. Poté se napouštěcí kohout 22 uzavře. Po otevření vtokového kohoutu 11 a napouštěcího kohoutu 17 se naplní vyrovnávací kanál 5 vedoucím elektrolytem s gelem. Vtokový a napouštěcí kohout 11, 17 se uzavřou. Otevřou se vtokový a napouštěcí kohout 10, 16 a separační kanál 2 se naplní gelem s vedoucím elektrolytem, s výhodou o jiném složení. Vtokový a napouštěcí kohout 10, 16 se uzavřou, elektrodová komora 23 se naplní koncovým elektrolytem, elektrodové komory 14, 15, 21 se naplní odpovídajícími vedoucími elektrolyty. Dávkovači kohout 9 se naplní vzorkem a otočí do polohy, v níž spojuje elektrodovou komoru 23 se separačním kanálem 2. Otevře se vtokový kohout 10 a mezi elektrodové komory 14, 23 se přivede elektrické napětí. Po domigrování vzorku k pomocnému detektoru 18 se odpojí elektrické napětí, uzavře se vtokový kohout 10, otevře se vtokový kohout 11 a k elektrodám elektrodových komor 15, 23 se připojí elektrické napětí.The method of analysis in this apparatus is as follows: The detection channel 7 is filled with a free lead electrolyte solution with the filled inlet cock 22 filled, with the inlet cock 9 open and the inlet cocks 10, 11 closed. Then, the inlet cock 22 is closed. After opening the inlet cock 11 and the inlet cock 17, the equalizing channel 5 is filled with the lead gel electrolyte. The inlet and inlet cocks 11, 17 are closed. The inlet and inlet cocks 10, 16 are opened and the separation channel 2 is filled with a gel with lead electrolyte, preferably of a different composition. The inlet and inlet cocks 10, 16 are closed, the electrode chamber 23 is filled with the end electrolyte, and the electrode chambers 14, 15, 21 are filled with corresponding lead electrolytes. The metering cock 9 is filled with sample and rotated to a position where it connects the electrode chamber 23 to the separation channel 2. The inlet cock 10 opens and an electrical voltage is applied between the electrode chambers 14, 23. After the sample has been migrated to the auxiliary detector 18, the electrical voltage is disconnected, the inlet valve 10 is closed, the inlet valve 11 is opened and the voltage is applied to the electrodes of the electrode chambers 15, 23.

Po domigrování první zóny k pomocnému detektoru 19 se odpojí elektrické napě246727 tí, uzavře se vtokový kohout 11, k elektrodám elektrodových komor 21, 23 se připojí elektrické napětí. Migrující zóny vzorku se zaznamenávají analytickým detektoremAfter the first zone has been migrated to the auxiliary detector 19, the electrical voltage is disconnected, the inlet valve 11 is closed, the electrical voltage is applied to the electrodes of the electrode chambers 21, 23. The migrating sample zones are recorded by an analytical detector

8. Po ukončení analýzy se celé zařízení promyje.8. After the analysis is complete, the entire apparatus is washed.

Claims

A method for isotachophoretic analysis with sample separation, characterized in that the analyzed sample is first separated in a gel and then analyzed in free solution.

2. A column for carrying out the method according to claim 1, characterized in that it is provided with at least one separation channel (2) passing through the first reduction channel (4) to the equalization channel (5) and through the second reduction channel (6) to the detection channel.