CS245195B1 - Spdsob přípravy enzýmov extracelulárnych celuláz - Google Patents

Abstract

Sposob přípravy enzýmov extracelulárnych celuláz. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že sterilné tekuté kultivačně medium obsahujúce 0,8 až 1,2 % hmot. mletého alebo střihaného celofánu o velkosti častíc I až 10 mm sa zaočkuje spórovou suspenziou Trichoderma reesei a kultivuje sa pri teplote 29 až 33 °C za premiešavania po dobu 8 až 12 dní, po ktorých sa oddělí kvapalný podiel. S výhodou sa zaočkuje spórovou suspenziou kmeňa huby Trichoderma reesei CCM F-766. Spósob přípravy enzýmov extracelulárnych cer luáz má použitie v potravinárskom, krmovinárskom, farmaceutickom a chemickom priemysle.

Description

245195 2

Vynález sa týká spósobu přípravy enzýmov extracelulárnych celuláz. Základným problémom širokého využitla celúlolytických enzýmov v potravinárskom, krmo-vinárskom, farmaceutickom a ohemickom priemysle je ich poměrně vysoká cena £c. R. Wilke, R. D. Yang, A. F. Sciamanna, R. P. Freitas: Bioteohnol. Bioeng. 23, 163 /1981/J.

Jednou z ciest zníženia výrobnýoh nákladov celulolytických enzýmov je hladanie laonýchzdrojov uhlíka na kultiváoiu produkčných mikroorganizmov. Celulázy sú induktivně ectracelu-lárne enzýmy, ktoré produkuji! mikroorganizmy za přítomnosti celulózy v rastovom médiu.

Na produkciu mikrobiálnych celuláz sa vyskúšali najrozličnejšie zdroje uhlíka obsahujúcecelulózu. Patria medzi ne prírodné, upravované a chemicky čisté celulózy a hemicelulózy,lignocelulózy, rózne polnohospodárske zvyšky, priemyselné a městské odpady, ktoré móžu byťrozpustného alebo nerozpustného charakteru £D. D. Y. Ryu, M. Mandels: Enzyme Microb. Technol. 2, 91 /1980/J.

Najlepšími zdrojmi uhlíka na produkciu celuláz u kmeňa Trichoderma reesei QM6a a jehomutantov sú substráty, ktoré predstavujú prírodnú mikrokryštalickú celulózu f*M. Mandels, J. Weber: Adv. Chem. Ser. 95, 391 /1969/J.

Surový celulázový preparát je možné v ďalšom kroku previesť do pevnej fomy precipitáciouacetónom tak, že sa riedi acetónom v objemovom pomere 3:1 £c. R. Wilke Int. Congr. Engin.

Food, Boston, 10 /1976/J, alebo precipituje síranom amonným medzi 20 a 40 % hmot- saturácie£*M. Nummi, M. L. Niku-Paavola, T. M. Enari, V. Raunio: FEBS Lett. 113, 164./1980/J. Výrobnácena čistej mikrokryštalickej celulózy představuje cenovú bariéru v procese výroby celulo-lytických enzýmov.

Uvedenú nevýhodu v podstatnej miere odstraňuje spósob přípravy enzýmov extracelulárnychceluláz podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že sterilné tekuté kultivačné médium 2 obsahujúce 0,8 až 1,2 i hmot. mletého alebo střihaného celofánu o velkosti častíc 1 až 10 mmsa zaočkuje spórovou suspenziou huby Trichoderma reesei a kultivuje sa pri teplote 29 až33 °C za premiešavania po dobu 8 až 12 dní, po ktorých sa odstráni kvapalný podiel. Dalej jepodstatou vynálezu, že sa zaočkuje spórovou suspenziou kmeňa huby Trichoderma reesei CCMF-766. Výhodou navrhovaného spósobu produkcie enzýmov extracelulárnych celuláz je, že umožňujevyužitie odpadného celofánu, ktorý ako poměrně čistá celulóza je jediným zdrojom uhlíka asúčasne induktorom syntézy enzýmov.

Avšak pre tento spósob ekonomického zhodnotenia odpadného celofánu je možné použiť lenchemicky čistý celofánový odpad, aby nedochádzalo k inhibícli rastu produkčných mikroorganizmovv dósledku přítomnosti toxických látok.

Takýmto spósobom sa znižuje cena celuláz o hodnotu, ktorú je potřebné vynaložit na inýuhlíkový substrát. Ďalšou výhodou je, že sa takto využívá odpad, ktorý sa ekonomicky zhodnocujea súčasne sa odstraňuje nelakovaný celovánový podiel, ktorý ináč znečisťuje životné prostrediev okolí závodov. Tento substrát doteraz nebol využívaný k produkcii celuláz.

Kmeň Trichoderma reesei CCM F-766 bol získaný mutagenézou v lineárnom akcelerátore z kmeňaTrichoderma reesei QM 9123, ktorý pochádza z póvodneho kmeňa Trichoderma reesei QM6a označo-vaného do roku 1977 ako Trichoderma viride £ M. Mandels, J. Weber, R. Parízek: Appl. Microbiol.21, 152 /1971/].

Kmeň Trichoderma reesei CCM F-766 je uložený v československéj zbierke mikroorganizmovUniverzity J. E. Purkyne v Brně, třída Obránců míru 10 pod uvedeným číslom. Na pevnom glukó-zovom médiu rastie vo formě riedkeho až hustejšieho vatovitého mycéliárneho porastu. Mycélium 3 245195 neskór na okrajoch a potom na celej ploché sporuluje. Fialidy sa tvorla buď prlamo na hlav- nom vlákně alebo na postranných vetvách jednotlivo alebo v riedkych praslenoch. sú flaškovi- tého tvaru kratšie alebo dlhšie, široké 2,5 až 3 um. Konídie sú gulovité alebo široko oválné s jemne drsným povrchom. Ich dlžka je 3,6 až 4,8 um a šířka 3,5 až 4 um.

Kmeň Trichoderma reesei CCM F-766 je z hladiska produkcie celuláz vysokoprodukčný, keďžena celulózových substrátoch produkuje přibližné 3 až 4krát vyššie výtažky enzýmov ako póvodnýkmeň Trichoderma reesei QM6a.

Kmeň produkuje na mikrokryštalickej celulóze alebo v přítomnosti oligosacharidov ako súnapr. soforóza, laktóza a celobióza inducibilný kompletný celulázový enzýmový systém, t.j.endo-l,4-beta-D-glukanázu /EC 3.2.1.4/ a exo-1,4-beta-D-glukanázu /EC 3.2.1.91/ a ďalejbeta-D-glukozidázu /EC 3.2.1.21/. Syntéza celulázového komplexu je reprimovaná vysokou kon-centráciou lahko utilizovatelných uhlíkových substrátov ako napr. glukóza. Příklad 1

Spórovou suspenziou huby Trichoderma reesei CCM F-766 sa zaočkuje sterilně tekuté kul-tivačně médium obsahujúce 0,2 % hmot. dihydrofosforečnanu draselného, 1,4 % hmot. síranuamonného, 0,03 % hmot. močoviny, 0,03 % hmot. chloridu vápenatého, 0,03 i hmot. síranuhorečnatého, 0,005 % hmot. síranu železnatého, 0,00016 % hmot. síranu mangánatého, 0,00014 % hmot, síranu zinočnatého, 0,0002 % hmot. chloridu kobaltnatého, 0,1 % hmot. my-kologického peptónu /Oxoid/ a 0,2 % hmot. detergentu obsahujúceho ako účinnu látku poly-oxyetylén sorbitan monooleát /Tweene 80/.

Ako jediný zdroj uhlíka kultivačně médium obsahuje 1,2 % hmot. mletého, chemicky čis-2 tého celofánu o ploché častíc přibližné 1 až 5 mm , ktoré sa získajú tak, že celofánovéfólie sa melú na mlýne /Weverk/. Kultivácia produkčného mikroorganizmu prebieha po dobu8 dní pri teplote 29 °C na rotačnej trepačke /2,5 Hz/.

Po odstránení narastenej biomasy a zvyškov celofánu, ktoré predstavujú 5 až 10 % hmot.počiatočného množstva celofánu, sa získá tekutina obsahujúca v 1 ml 0,5 až 0,6 jednotiekcelulázy. Za jednotku aktivity je považované také množstvo enzýmu, ktoré v 0,05 mol.l-1acetátovom tlmivom roztoku o pH 5,4 pri teplote 50 °C uvolní v 0,5 ml inkubačnej zmesiobsahujúcej filtračný papeir dlžky 2 cm a šířky 1 cm /Whatman 1/ redukujúce sacharidyrovné 1 umólu ekvivalentov glukózy £ M. Mandels, J. Weber: Adv. Chem. Ser. 95, 391 /1969/}. Získaná aktivita celulolytických enzýmov dosahuje přibližné 50 i hladiny celuláz stano-vených v médiu s 1 % hmot. mikrokryštalicou celulózou. Napriek týmto rozdielom vo výtažkuaktivity celuláz enzýmové systémy huby Trichoderma reesei QM 9414 produkované na ‘celofánea raikrokryštalickej celulóze vykazujú podobné enzýmové zloženie.

Metodou izoelektrickej fokusácie na horizontálnych polyakrylamidových géloch s následnoudetekciou enzýmov pomocou replik sa v odsolených prepatátoch enzýmov nezistujú podstatnérozdiely v zastdpení mnohotných foriem endo-1,4-beta-D-glukanáz a endo-l,4-beta-D-xylanáz. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použije ako zdroj uhlíka 0,8 i2 hmot, střihaný celofán o ploché častíc 5 až 10 mm . Kultivácia produkčného mikroorganizmuprebieha po dobu 12 dní pri teplote 31 °C na rotačnej trepačke /2,5 Hz/. Po odstránení na-rastenej biomasy a zvyškov celofánu, ktoré představuji! 15 až 25 % hmot. počiatočného množstvacelofánu, sa získá tekutina obsahujúca v 1 ml 0,2 až 0,4 jednotiek celulázy.

Claims (2)

1. 245195 Příklad 3 Postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že kultivácia produkčného mikroorganizmuprebieha po dobu 12 dní pri teplote 33 °C na rotačnej trepačke /2,5 Hz/. Po odstránení naras-tenej biomasy a zvyškov celofánu, ktoré predstavujú 30 až 60 % hmot. počiatočného množstvacelofánu, sa získá tekutina obsahujdca v 1 ml 0,05 až 0,075 jednotiek celulázy. Surový tekutý enzýmový preparát připravený podlá příkladu 1 a 2 je medziproduktom pripríprave surověj prečistenej práškovéj celulázy, pričom sa postupuje známými spósobmi£m. Ferenčík, B. Skárka: Biochemické laboratorně metody, Bratislava, Alfa, 566 /198l/J. Přikládá Surový tekutý enzýmový preparát sa zahušťuje na rotačnej vákuovej odparke alebo ultra-filtráciou pri teplote 20 až 22 °c a tlaku 4 až 5 kPa na 1/10 póvodného objemu. Z takto za-huštěného preparátu sa separujú nízkomolekulové balastné látky v celofánových dialyzačnýchtrubiciach v destilovanéj vodě pri teplote 4 °C a v ďalšom sa roztok celulázy lyofilizuje.Enzýmový preparát sa uchovává v práškovej formě v exikátore pri teplote 4 °C. Vynález móže nájsť široké použitie na produkciu extracelulárnych celuláz, ktorými sadajd využiti mechanicky predupravené substráty obsahujúce celulózu /rastlinné prírodné celu-lózy, hemicelulózy a lignocelulózy, polnohospodárske zvyšky a priemyselné a městské odpady/na produkciu sacharidov, ktoré móžu slúžiť na přípravu mikrobiálnych bielkovín pre potravi-nářsky a krmovinársky priemysel alebo pre produkciu paliv ako aj iných látok vhodných prefarmaceutický a chemický priemysel. PREDMET VYŇAL EZU

   1. Spósob přípravy enzýmov extracelulárnych celuláz v sterilnom tekutom kultivačnom médiuvyznačujdci sa tým, že sterilně tekuté kultivačně médium obsahujúce 0,8 až 1,2 hmot. mletéhoalebo střihaného celofánu o velkosti častíc 1 až 10 mm sa zaočkuje sporovou suspenziou huby Trichoderma reesei a kultivuje sa pri teplote 29 až 33 °C za premiešavania po dobu8 až 12 dní, po ktorých sa oddělí kvapalný podiel.
2. 2. Spósob přípravy enzýmov extracelulárnych celuláz podlá bodu 1, vyznačujdci sa tým,že sa zaočkuje sporovou suspenziou kmeňa huby Trichoderma reesei CCM F-766. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs