CS243864B1 - Enzymová elektroda - Google Patents

Abstract

Řešení se týká enzymové elektrody, která sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva. Elektroda je určena k enzymatickokonduktometrickému stanoveni biologicky důležitých látek.

Description

(54) Enzymová elektroda

Řešení se týká enzymové elektrody, která sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva.

Elektroda je určena k enzymatickokonduktometrickému stanoveni biologicky důležitých látek.

Obr. 1.

Vynález se týká enzymové elektrody. Enzymové elektrody jsou specifická analytická čidla pro rychlé stanoveni biologicky důležitých látek v tělesných tekutinách, v potravinách, krmivech a odpadech většinou bez potřeby jejich separace. Dají se použít i v kalných, barevných a fluoreskujících prostředích bez nároků na chemikálie, kromě pufru a příslušného standardu. Obvykle se zhotovují mechanickým připevněním biokatalytické vrstvy s imobilisovaným enzymem, suspenzí buněk, tkáňovým řezem na konvenční elektrochemický senzor.

Z literatury i komerční produkce jsou známy dva druhy enzymových elektrod, které se liší typem základního indikačního senzoru:

- potenciometrické, reagující na přídavek analytu změnou potencionálu, jako iontově selektivní elektroda a

- polarografické, tj. amperometrické, které při vloženém konstantním napětí mezi měrnou a referentní elektrodou dávají po přídavku analytu proudový signál.

Je známé stanovení biologicky důležitých látek, využívající změnu vodivosti v závislosti na enzymatické reakci, například u analyzátoru močoviny v krvi, který pracuje na konduktometrickém principu s rozpustnou ureasou, která po analýze odtéká do odpadu, což je značně neekonomické.

Tuto nevýhodu odstraňuje enzymetická elektroda podle vynálezu, který sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva. Síťky jsou s výhodou vyrobeny z platiny nebo zlaceného fosforového bronzu s počtem 2 až 3.10 ok na cm . Biokatalytická vrstva obsahuje fyzikálně nebo chemicky imobilizovaný enzym, buněčné organely, mikrobiální buňky nebo tkáňový řez. Síla biokatalytické vrstvy je obvykle 0,2 až 0,5 mm. Biokatalytická vrstva může být tvořena zapolymerovaným enzymem v polyakrylamidovém gelu nebo enzymem zesítěným s albuminem nebo želatinou pomocí glutardialdehydu.

Enzymová elektroda je schematicky v řezu znázorněna na obr. 1 a v nárysu na obr. 2. Sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk 2> mezi nimiž je umístěna biokatalytická vrstva g. Bezprostřední dotyk sítěk 2 s biokatalytickou vrstvou g zajištuje pružný držák 2. Sítky 1 jsou připojeny na neznázoměný konduktometr přes jednoduchý neznázoměný kompenzační člen, který umožňuje eliminovat výchozí vodivost pracovního pufru o nízké iontové síle.

Signál se vyvádí na neznázoměný zapisovač při citlivosti 20 mV a s rychlostí posuvu 0,1 mm/s.

Funkce zařízení je dokumentována na stanoveni močoviny v moči (příklad 1). Močovina difundující přes elektrodové sítky do vrstvy,Amobilizovaného enzymu ureasy se zde štěpí na amonné a uhličitanové ionty : močovina + 2 H₂Ó 2 NH^ + CO₃ . Tím se mění i vodivost v meZielektrodovém prostoru. Elektrodová odezva má tvar.vlny a oba parametry zaznamenané křivky, tj. celková změna vodivosti i počáteční změna vodivosti jsou lineární funkci koncentrace močoviny v reakčním médiu. Pokud analyzovaný vzorek sáni již obsahuje ionty, je třeba jeho vodivost odečíst; za tím účelem se analýza opakuje s membránou obsáhující místo enzymu stejné množství inaktivní bílkoviny. Je už jen technickou záležitostí změřit oba signály současně, eventuálně přímo jejich diferenci.

Předností biosenzoru je ekonomika analýz, nebot se mnohonásobně využije zakotveného enzymu, který může být i velmi nákladný.

Druhým příkladem je jednoduché měření aktivity enzymu arginasy, která štěp! svůj substrát arginin na močovinu a ornithin:

arginasa

L-arginin + HjO -i-> močovina + ornithin

V tomto případě po nastartování reakce enzymem plynule vzrůstá vodivost. Vyhodnocuje se počáteční maximální změna vodivosti, která je úměrná aktivitě enzymu.

Další možnosti využití nového biosenzoru jsou nasnadě, např. stanovení různých amidů, esterů, alkoholů, aldehydů, kys. štavelové, argininu apod. při zvolení vhodného složení biokatalytické vrstvy.

Enzymatická elektroda a její použití je blíže osvětleno v následujících příkladech.

Příklad 1

Stanovení močoviny

Elektroda sestává z platinových sítěk s počtem ok 2 500 na cm ,' mezi nimiž je biokatalytická vrstva tvořena membránou, která byla připravena podle Guilbaulta a Montalva (Anal.

Chem. 41, 1 897, 1969) zapolymerováním 10 mg ureasy (Sigma III) do 60 ul polyakrylamidového 2 gelu mezi dvěma sklíčky na ploše 1,4 cm . Membrány o síle 0,25 mm jsou uchovávány v pracovním pufru. Do skleněné reakční nádobky s vodním pláštěm, magnetickým míchadlem a 6,5 ml 30 mM veronalového pufru pH 6,2, se vloží enzymová elektroda s imobilizovanou ureasou. Po vytemperování na 30 °C a vykompenzování výchozí vodivosti se přidá např. 20yUl lOx ředěné moči a zaznamená se změna vodivosti až do dosažení ustálené odezvy za 3 až 4 min. Poté se provede celé měření znovu při výměně enzymové vrstvy za vrstvu neaktivní /ureasa nahrazena stejným množstvím hovězího serumalbuminu/. Rozdíl obou měření odpovídá obsahu močoviny. Standardizace se provede s roztokem 1 g močoviny/1. Kalibrační křivka je lineární v rozmezí 3.8.10^-^ až -4

6.1.10 M a reprodukovatelnost je okolo 6 %.

Příklad 2

Stanovení aktivity arginasy

Analýza se provádí se stejnou enzymovou elektrodou v 6,5 ml 20 mM maleátového pufru pH 9,5 obsahujícího 10 mM síran manganatý s 25 mM hydrochlorid argininu. Po přidání vzorku arginasy elektrodový systém signalizuje vznikající močovinu jako-'plynulý vzrůst vodivosti.

Ze záznamu se odečte počáteční rychlost, která se převede na enzymovou aktivitu v katalech po kalibraci standardem močoviny.

Claims (6)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Enzymová elektroda, vyznačující se tím, že sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk (1), uchycených v pružném držáku (2), mezi nimiž je biokatalytická vrstva (3).
2. 2. Enzymová elektroda podle bodu 1, vyznačující se tím, že sítky jsou z platiny nebo
3. 3 2 zlaceného fosforového bronzu s počtem 2 až 3.10 ok na cm.

   3. Enzymová elektroda podle bodů 1 až 2, vyznačující se tím, žě biokatalytická vrstva obsahuje fyzikálně nebo chemicky imobilizovaný enzym, buněčné organely, mikrobiální buňky nebo tkáňový řez.
4. 4. Enzymová elektroda podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že biokatalytická vrstva je silná 0,2 až 0,5 mm.
5. 5. Enzymová elektroda podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že biokatalytická vrstva je tvořena zapolymerovaným enzymem v polyakrylamidovém gelu.
6. 6. Enzymová elektroda podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že biokatalytická vrstva je tvořena enzymem zesítěným s albuminem nebo želatinou pomocí glutardialdehydu.