CS242808B1 - Způsob stanovení složení a aktivity insulinu - Google Patents

Abstract

Analyzovaný vzorek se za vhodných chromatografických podmínek rozdělí na hovězí a vepřový insulin a jejich monodesamidoderiváty a z příslušných elučních křivek se vypočítá jejich procentuální zastoupení. Porovnáním s vhodným standartem se zjistí biologická aktivita analyzovaného vzorku insulinu. Způsob je rovněž vhodný pro operativní stanovení insulinu během výroby, počínaje prvním zahuštěním alkoholického extraktu.

Description

Vynález se týká způsobu stanovení složení a aktivity insulinu vysokoúčinnou kapalinovou chromátografií.

Jedním z dosud používaných technologických postupů při výrobě insulinu je jeho izolace ze zvířecího pankreasu, nejčastěji hovězího nebo vepřového původu. Podle toho, jaký biologický materiál je brán do výroby, je možno získat buS monokomponentní např. hovězí nebo vepřový insulin, nebo směsný insulin, obsahující oba druhy insulinu. Procentuální zjištění obsahu hovězího nebo vepřového insulinu a odpovídajících monodesamidoderivátů, vznikajících při výrobě jako rozkladné produkty, má velký význam při sledování efektivnosti výroby z různě kvalitního biologického materiálu i při hodnocení kvalitativního složení a účinnosti získaných substancí insulinu a z nich vyráběných lékových forem.

Současný způsob stanovení insulinu, především v substancích a lékových formách, je založen na biologických testech na živých králících nebo myších. Tento způsob hodnocení insulinových přípravků je materiálně a časově náročný (jedno stanovení vyžaduje pokusy na nejméně 40 králících a trvá 7 dní; pro zkoušky na myších je nutno pro jedno stanovení 96 myší), je pracný, málo přesný (získaný výsledek má povolenou odchylku ±10%), neposkytuje žádné informace o kvalitativním složení vzorků a není ho možno použít pro operativní zjišťování kvality právě vyráběného insulinu.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob stanovení složení a aktivity insulinu vysokoúčinnou kapalinovou chromátografií za použití mobilní fáze tvořené směsi rozpouštědel typu acetonitrilu a vodného pufru při teplotě kolony 35° až 45°G a průtoku mobilní fáze 0,3 až 0,5 ml/min, podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že se do mobilní fáze přidá pufr, připravený z modifikátoru typu primárního aminu o 6 až 12 atomech uhlíku v množství 0,15 až 2 ml/1000 ml vody, přičemž vzniklá vodná suspenze se rozpustí

-2242 808 úpravou pH na hodnotu 2,G až 3,0 přídavkem kyseliny fosforečné a stanovení se provede porovnáním změřených ploch elučních křivek rozdělených složek insulinu zkoumaného vzorku a standardu.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se vodný pufr, připravený z 1,6 ml 2-ethylhexylaminu v 1000 ml vody, po úpravě kyselinou fosforečnou na hodnotu pH 2,2, přidá do mobilní fáze v poměru 72,8% obj. : 27,2% obj. acetonitrilu a stanovení se provede ultrafialovou detekcí při višňové délce 280 nm.

Způsobem podle vynálezu je zkoumaný insulinový vzorek chromatograficky rozdělen na jednotlivé složky. Toto rozdělení je možné přítomností 2-ethylhexylaminového pufru o pH 2,2 v mobilní fázi. Plochy elučních křivek rozdělených složek insulinu odpovídají jejich hmotnostnímu zastoupení v analyzovaném vzorku a je možno z nich vypočítat i jejich procentuální obsah. Porovnáním součtu ploch elučních křivek všech oddělených složek zkoumaného insulinu s plochou změřenou u vzorku insulinu o známé biologické aktivitě (např. u národního standardu) je možno stanovit biologickou aktivitu měřeného insulinového preparátu.

Největší výhoda způsobu podle vynálezu je v tom, že stanovení složení a aktivity insulinu není závislé na biologickém faktoru. Tím přináší způsob podle vynálezu velkou časovou úsporu a umožňuje operativní stanovení insulinu do 1 hodiny, nemluvě o ušetřených nákladech při jinak nutném chovu králíků a myší pro biologické testy. Neméně důležitá je skutečnost, že způsobem podle vynálezu se jednoduchou metodou dosáhne přesných výsledků (průměrná odchylka stanovení byla Í3%)/a tím se umožní přesná a rychlá mezioperační kontrola aktivity substance před výrobou insulinových injekčních forem, poskytující tak možnost přesného nastavení obsahu insulinu na požadovaných 40 m.j. v 1 ml injekčního roztoku. Možnost zjišťovat složení insulinových substancí včetně rozkladných produktů, má rovněž velký význam při nákupu či prodeji insulinu. Způsob podle vynálezu byl též s úspěchem použit pro kontrolu zahuštěného extraktu z biologického materiálu a dalších technologických stupňů při výrobě insulinu; tak lze sledovat ztráty vznikající během výroby a optimalizovat technologické postupy dosud používané při výrobě insulinu.

i Způsob podle vynálezu je názorněji vysvětlen na přiložených výkresech. Na obr.l je znázorněna separace

- 3 242 808 standardního roztoku insulinu připraveného podle bodu za podmínek uvedených v bodě E/ v závislosti na časové ose t (v minutách). Na obr.2 je uveden příklad chromatografické separace vzorku injekčního roztoku insulinu připraveného postupem uvedeným v příkladu 2 v závislosti na časové ose t (v'minutách) a na obr.3 je příklad separace vzorku alkoholického extraktu z výroby insulinu připraveného postupem uvedeným v příkladu 3 opět v závislosti na časové ose t (v minutách).

Na těchto obrázcích znamenají vrcholy elučních křivek toto:

- hovězí insulin

- desamidohovězí insulin

- vepřový insulin

- desamidovepřový insulin

- konzervační činidlo

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nijak neomezují.

Příklad 1

A/ Příprava 2-ethylhexylaminového pufru

Do 1000 ml kádinky odměříme asi 950 ml destilované vody, z dě lené pipety přidávkujeme 1,6 ml 2-ethylhexylaminu a za míchání a kontroly pH přidáváme zředěný roztok kyseliny fosforečné až do výsledné hodnoty pH 2,2. Destilovanou vodou pak doplníme roztok na 10Ó0 ml objemu.

B/ Příprava standardního roztoku insulinu (například z národního standardu)

Na mikrováhách navážíme do malé uzavíratelné lékovky několik mg standardu insulinu a z přesné mikrobyrety přidáme takový objem 20% roztoku okyseleného acetonitrilu, aby konečná koncetrace byla 1 mg standardu v 1 ml roztoku. Po dokonalém rozpuštění dávkujeme 25/ul roztoku na chromatografickou kolonu.

C/ Příprava vzorku zkoumaného insulinu (substance)

Vzorek připravíme podle předchozího postupu B a na chromatografickou kolonu dávkujeme též 25/Ul roztoku.

D/ Příprava 20% roztoku acetonitrilu

Do 20 ml acetonitrilu ve 100 ml odměrné baňce doplníme ke

242 808 ~ 4 značce 0,1% roztok kyseliny fosforečné v destilované vodě.

E/ Chromatografie

Kapalinový chromatograf s kolonou o rozměrech 25 x 0,3 cm nebo 30 x 0,4 cm plněnou silikagelem o velikosti částic 5 nebo 10/um modifikovaným oktadecylovými zbytky a teplotou kolony 40°C. Jako mobilní fáze byl použit roztok 27,2% obj. acetonitrilu a 72,8% obj. vodného 2-ethylhexylaminového pufru. UV fotometrická detekce byla provedena při vlnové délce 280 nm a citlivosti 0,01 absorbanční jednotky. Vyhodnocení chromatografického záznamu bylo provedeno integrátorem i ruční triangulací. Na kolonu bylo dávkováno 25/Ul roztoku insulinu (viz obr.l).

Výpočet aktivity vzorku substance (m.j./mg):

aktivita vzorku = -9^iÍYÍl§-SÍSQŠ!ardu_x_suma_Bloch_-vzorku_-_ suma ploch standardu

Příklad 2

Příprava vzorku zkoumaného insulinu (injekce)

Celý obsah ampule kvantitativně přeneseme do uzavíratelné skleněné nádobky, přidáme 10,0 ml okyseleného roztoku 20% acetonitrilu (připraveného podle Příkladu 1) a dobře protřepeme. Na kolonu dávkujeme 25/ul, podmínky chromatografie jako v příkladu 1, graf viz obr.2.

Výpočet aktivity injekčního roztoku (m.j./ml):

aktivita standardu x suma ploch vzorku aktivita inj. roztoku ---------------------------------------x 2 suma ploch standardu

Příklad 3

Příprava vzorku alkoholického extraktu z výroby insulinu

Vzorek zahuštěného alkoholického extraktu pankreasu zfiltrujeme přes skleněnou fritu G2 a 25yul filtrátu dávkujeme na kolonu. Aktivitu vzorku v m.j./ml tohoto roztoku změříme metodou vnějSího standardu. Podmínky chromatografie jako v příkladu 1, graf viz obr.3.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   242 808

   1. Způsob stanovení složení a aktivity insulinu kapalinovou chromatografií za použití mobilní fáze tvořené směsí rozpouštědel typu acetonitrilu a vodného pufru při teplotě kolony 35° až 45°G a průtoku mobilní fáze 0,3 až 0,5 ml/min, vyznačující se tím, že se do mobilní fáze přidá vodný pufr, připravený z modifikátoru typu primárního aminu o 6 až 12 atomech uhlíku, v množství 0,15 až 2 ml/1000 ml vody, přičemž vzniklá vodná suspenze se rozpustí úpravou pH na hodnotu 2,0 »ž 3,0 přídavkem kyseliny fosforečné a stanovení se provede porovnáním. změřených ploch elučních křivek rozdělených složek insulinu zkoumaného vzorku a standardu.
2. 2. Způsob podle hodu 1, vyznačující se tím, že se vodný pufr, připravený z 1,6 ml 2-ethylhexylaminu v 1000 ml vody, po úpravě kyselinou fosforečnou na hodnotu pH 2,2, přidá do mobilní fáze v poměru 72,8% obj. : 27,2% obj. acetonitrilu a sta novení se provede ultrafialovou fotometrickou detekcí při vlnové délce 280 nm.