CS241022B2 - Molekulárně selektivní senzor a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Vynález se týká molekulárně selektivního senzoru, vhodného pro selektivní stanovení koncentrace sloučenin (například glukózy) rozpuštěných ve vzorcích kapalin (například krvi), jakož i způsobu jeho výroby. Podstata vynálezu spočívá zejména v tom, že Otvor tělesa senzoru, který se nachází na straně indikační elektrody, je uzavřen alespoň jednou kontinuální nebo perforovanou membránou přirozeného původu, obsahující v povrchové vrstvě alespoň jeden druh enzymu vázaného chemicky v zakotvené formě, přičemž uvedená membrána je ve styku s blánou propustnou pro plyny nebo pro plyny a rozpuštěné látky, a mezi tělesem senzoru a indikační elektrodou je vytvořena izolační vrstva, zatímco ve stěně krycího tělesa je vestavěn filtr propustný , pro roztok elektrolytu. Podstata způsobu výroby senzoru spočívá v tom, že se v horní vrstvě membrány přirozeného původu zakotví pomocí chemické vazby alespoň jedén druh enzymu, načež se membrána obsahující zakotvený enzym spolu s blánou propustnou pro plyny nebo plyny a rozpuš; těné látky upevní na otvor dutého tělesa, do něhož se umístí jednak roztok elektrolytu, a jednak alespoň jedna indikační elektroda a alespoň jedna referenční elektroda.

Description

Vynález se týká molekulárně selektivního elektroanalytického senzoru, vhodného pro selektivní stanovení koncentrace sloučenin (například glukózy) rozpuštěných ve vzorcích kapalin (například krvi), jakož i způsobu jeho výroby.

Jsou známy molekulární selektivní elektroanalytické senzory, vhodné pro stanovení sloučenin rozpuštěných ve vzorcích kapalin.

Elektrochemické vlastnosti a možnosti použití molekulárně selektivních senzorů jsou známé z literatury. Jak známo, mají molekulárně selektivní senzory, které je možno -považovat za elektrické měrné články, některé společné vlastnosti, jako například to, že nosič senzoru, který obsahuje iontově selektivní nebo kovovou indikační elektrodu a referenční elektrodu, je umístěn v trubkovém tělese, naplněném roztokem elektrolytu, jehož jeden konec je uzavřen blánou, propustnou pro plyny a rozpuštěné látky (například dialyzační blánou), přičemž tato blána je opatřena vrstvou gelu, selektivního pro danou látku (například vrstvou akrylamidového gelu), obsahující specificky účinný katalyzátor, tj. chemicky nebo fyziologicky vázaný enzym, a je ve styku s, nebo navrstvena na blánu propustnou pro plyny nebo plyny a rozpuštěné látky (například celofánovou blánou) a s vrstvou roztoku, obsahujícího selektivní enzym v suspendované formě, jakož i s blánou propustnou pro plyny a rozpuštěné látky (například celofánovou blánou). Mechanismus působení známých molekulárně selektivních senzorů je následující. Molekuly stanovené složky (molekuly tzv. substrátu, například molekuly glukózy) a v daném případě molekuly reagentu (molekuly kyslíku) difundují do vrstvy, obsahující selektivní enzym (například glukózooxidázu), sloužící jako specificky účinný katalyzátor,, do tzv. reaktivní vrstvy, kde dojde k chemické reakci. Výstupní signál indikační elektrody je jednoznačnou funkcí koncentrace nebo reaktivity reagentu účastnícího se enzyma•tické reakce, nebo jedné ze zúčastněných nebo vznikajících komponent. Lokální hodnota reaktivity nebo koncentrace závisí v případě, že všechny faktory jsou považovány za konstanty, na rychlosti reakce, která je jednoznačnou funkcí koncentrace substrátu. Proto je možno ve stacionárním stavu stanovit přímo koncentraci vzorku měřením síly proudu nebo ems (elektromotorické síly).

Výroba známých molekulárně selektivních senzorů je složitý, časově náročný a mimořádné znalosti vyžadující úkol, jehož výsledek je reprodukovatelný pouze náhodně.

Velká nevýhoda těchto senzorů spočívá v jejich krátké životnosti (například několik dnů; 1 až 2 týdny), která souvisí s nepříznivými vlastnostmi reaktivní vrstvy. Další nevýhoda, která se projeví při použití, spočívá v tom, že senzory, resp. gelové vrstvy obsahující enzym, musí být mimo použití skladovány při nízké teplotě (například mezi 1 až 2°C), aby si zachovaly enzymatickou aktivitu.

Známé elektrody jsou poškoditelné, mají nízkou mechanickou pevnost a dlouhou dobu odezvy (například mezi 2 až 8 minutami).

Další nevýhoda, vyskytující se při použití takovýchto senzorů spočívá v tom, že v ampérometrické indikační elektrodě (například platinové) rozpuštěný plyn (například kyslík) nebo vrstva kysličníku vznikajícího na povrchu, nebo znečištění kovu v důsledku jejího používání, vzniklé na povrchu indikační elektrody (například znečištění stříbrem), nebo další izolační vrstvy, mají nepříznivý vliv na poměr signálu a šumu, protože aktivní povrch indikační elektrody a tím i signál jí vysílaný se zmenší.

Uvedené nevýhody postačují k tomu, že se senzory zajišťující jednoduchou selektivní měřicí techniku v praxi neujaly a nejsou dostupné na trhu.

Úkolem tohoto vynálezu je vyřešit konstrukci takového molekulárně selektivního senzoru, který by byl vyrobitelný bez speciálních nároků na odborné znalosti, v krátké době a reprodukovatelně při mnohem delší životnosti (například půl roku až 1 rok) než doposud známé typy, a který by vykazoval větší mechanickou pevnost a kratší dobu odezvy (například 20 až 30 vteřin).

Podstata molekulárně selektivního senzoru podle vynálezu spočívá zejména v tom, že otvor tělesa senzoru, který se nachází na straně indikační elektrody, je uzavřen alespoň jednou kontinuální nebo perforovanou membránou přirozeného původu, obsahující v povrchové vrstvě alespoň jeden druh enzymu vázaného chemicky v zakotvené formě, přičemž uvedená membrána je ve styku s blánou propustnou pro plyny nebo pro plyny a rozpuštěné látky, a mezi tělesem senzoru a indikační elektrodou je vytvořena izolační vrstva, zatímco¹ ve stěně krycího tělesa je vestavěn filtr propustný pro roztok elektrolytu.

Podstata způsobu výroby molekulárně selektivního senzoru podle tohoto vynálezu pak spočívá v tom, že se v horní vrstvě membrány přirozeného původu zakotví pomocí chemické vazby alespoň jeden druh enzýmu, načež se membrána obsahující žákotvený enzym spolu s blánou propustnou pro plyny nebo plyny a rozpuštěné látky upevní na otvor dutého tělesa, do něhož se umístí jednak roztok elektrolytu, a jednak alespoň jedna indikační elektroda a alespoň jedna referenční elektroda.

Výhoda molekulárně selektivního senzoru podle vynálezu spočívá v tom, že mechanická pevnost albuminózních přirozených membrán (jako například vzduchový měchýř ryb, kožní partie savců a plazů, nebo rohovka a střevní stěny některých druhů zvířat] Je přes svoji tenkost 10 až 15 μτη výhodnou z hlediska doby odezvy, a taktéž jsou výhodné z hlediska své struktury. Kromě toho Je koncentrace aktivních aminoskupin na membránách tvořených aminokyselinami z hlediska chemické vazby enzymů s albuminózní strukturou taktéž optimální a konstantní. Tak je možno vyrobit senzory pracující v širokém rozmezí koncentrací s krátkou dobou odezvy. Podle postupu zakotvení je možno uchovávat aktivované přirozené membrány v suchém stavu, případně při teplotě místnosti velmi dlouho (půl roku až jeden rok), aniž by se aktivita enzymu znatelně změnila, neboř tento je obklopen přirozeným prostředím.

Prostupnost přirozené membrány oproti iontům, molekulám vody a plynů je z hlediska měřicí techniky ideální. Další výhodnou vlastností přirozených membrán je ta skutečnost, že jsou vůči iontům nebo molekulám plynů, které se mohou vyskytnout buď jako reagent nebo jako produkt reakce, prostupné, a vůči sloučeninám o vyšší molekulární hmotnosti, které by případně mohly výsledek měření ovlivnit (například substrát samotný nebo jiné látky obsažené ve vzorku), neprostupné, čímž je možno tzv. hysterezní efekt, který často vzniká při střídání vzorků o různé koncentraci, odstranit buď částečně nebo i zcela.

Senzor podle vynálezu též může být uspořádán tak, že ke zhotovení reaktivní vrstvy se použije jednak membrána se dvěma reaktivními vrstvami nebo větší počet na sebe navrstvených membrán s jednou nebo dvěma reaktivními vrstvami. Při tomto uspořádání je na každém povrchu membrány vázán v zakotvené formě jiný enzym. V případě beta-glukozidové elektrody obsahuje povrch membrány na straně roztoku vzorku beta-glukozidázu, na straně indikační elektrody glukózooxidázu. Enzym vázaný na první membráně, tj. betaglukozidáza — umožňuje hydrolyzační reakci mezi stanovovanou složkou, beta-glukozidem (například amygdalinem nebo salicinemj a vodou, čímž vznikne mezi jiným též glukóza. Enzym vázaný na druhé membráně — glukózooxidáza — katalyzuje reakci mezi glukózou a kyslíkem. Na indikační elektrodě, nacházející se za membránou, je možno· měřit signál, úměrný koncentraci kyslíku. Signál úměrný snižováni koncentrace kyslíku je jednoznačnou funkcí koncentrace zjišťované na vzorku. V tomto provedení je možno dosáhnout na jedné straně zjednodušení z hlediska měřicí techniky a zvýšení selektivnosti, na druhé straně je možno· stanovit i takové sloučeniny, které při jednostupňové reakci neposkytnou žádnou měřitelnou komponentu nebo nezpůsobí žádnou změnu v koncentraci nebo reaktivitě měřitelných komponent.

Senzor podle tohoto vynálezu je možno vytvořit i tak, že na oddělených částech povrchu membrány přirozené, struktury, sloužící jako reaktivní zóna, nebo na daných částech povrchu jsou vázány různé druhy enzymů ve statisticky homogenním rozležení, a k jedné části povrchu přísluší jedna nebo více indikačních elektrod. Při tomto· uspořádání mohou být zhotoveny multifunkční molekulárně, selektivní senzory bez zvětšení jejich rozměrů, čímž se stane proveditelným paralelní stanovení více komponent ve stejném roztoku vzorku, nebo paralelní stanovení koncentrace rušivých komponent, jejichž vliv lze manuálně nebo automaticky vyloučit.

U jiných provedení molekulárně selektivních senzorů, zhotovených podle tohoto vynálezu, například průmyslových senzorů, je membrána přirozené struktury za účelem větší míry ochrany a dalšího zvýšení mechanické pevnosti reaktivní zóny ve spojení s inertní sítí polymeru nebo tkaniny. Ú dalších provedení je v zájmu velmi krátké odezvy provedena reaktivní zóna, obsahující enzym v zakotvené formě v horní vrstvě jedné strany membrány přirozené struktury, a v horní vrstvě druhé strany membrány přirozené struktury js podle impregnačního postupu pomocí zesítění provedena vrstva propustná pro plyny, nebo vrstva s vlastnostmi iontoměniče.

Molekulárně selektivní senzory jsou zhotovovány podle vynálezu takovým způsobem, že povrch membrány přirozené struktury je zpracován roztokem, obsahujícím enzym a bifunkčuí činidlo, obsahující skupiny vhodné pro chemickou vazbu, například glutaraldehydy, při teplotě okolí. Po skončení vazební reakce je membrána uložena do vodní lázně s destilovanou vodou, kde jsou odděleny komponenty, které si zachovaly rozpustnost ve vodě. Po ukončení oplachování jsou membrány připraveny pro měření. Poté je v daném případě připravována kovová indikační elektroda. Za účelem čištění povrchu indikační elektrody je tato ponořena na několik minut do kyseliny dusičné, poté opláchnuta a pak uložena do lázně obsahující redukční prostředek (například kyselinu askorbovou), kde jsou odstraněny kysličníky a kyslík, fyzikálně rozpuštěný v kovové elektrodě. Hotová membrána je spolu s blánou propustnou pro plyny a nebo plyny a rozpuštěné látky přiložena na těleso senzoru, a poté je ponořena do roztoku elektrolytu nacházejícím se v tělese senzoru, jak indikační, tak i referenční elektroda takovým způsobem, aby se povrch indikační elektrody nacházel v bezprostřední blízkosti membrány. Elektrody se upevní a tím se senzor nachází ve stavu schopném provádět měření.

Přikladl

Na obr. 1 je znázorněn ve formě příkladu provedení senzor, selektivní na glukózu podle tohoto vynálezu, v částečném průřezu. V dutině tělesa 1 senzoru se nachází ústojný roztok s obsahem chloridových aniontů 2, do něhož je ponořena v krytu 3 upevněná platinová indikační elektroda 4 a stříbrná-stříbrochlorldová referenční elektroda 5.

Okraj tělesa 1 senzoru je uzavřen polypropylenovou blánou 6 propustnou pro plyn, která se dotýká indikační elektrody 4. Blána 6 je v dotyku s běžně dostupnou membránou vepřového střeva 7, na němž je zakotvena glukózooxidáza (E.C.1.1.3.4.) pomocí glutaraldehydu. Blána 6 a přirozená membrána 7 jsou připevněny k tělesu 1 pomocí gumového kroužku 8. Druhý konec tělesa 1 senzoru je uzavřen uzávěrem 9 z umělé hmoty. Indikační elektroda 4 a referenční elektroda 5 jsou spojeny pomocí kabelu 10 s polarizujícím zdrojem napětí a vstupy ampérmetru.

Výroba elektrody selektivní na glukózu probíhá takto. Určitá část běžně dostupného nasoleného vepřového střeva je namočena po dobu 10 až 15 minut do destilace vody. Nabobtnalá membrána se upevní spolu s blánou o tloušťce 15 ,«in (například polypropylenovou blánou), propustnou pro plyn, v napnutém stavu na okraj tělesa senzoru. Membrána se suší po dobu 20 minut. Poté je v 0,5 ml .ústojného roztoku o hodnotě pH 7,4 suspendováno 60 mg glukózooxidázy (E.C.1.1.3.4.) a přidáno 25 mikrolitrů 25% roztoku glutaraldehydu. Z této homogenní suspenze se 20 mlkrolitrů rozptýlí na povrchu membrány ve stejnoměrné vrstvě. Pak se membrána nechá sušit po dobu 20 minut, a poté se odstraní opráním destilovanou vodou nezakotvený enzym ,a zbytek glutaraldehydu. Tímto způsobem připravená membrána, obsahující glukózooxidázu v zakotvené formě, je ve stavu schopném pro uchování nebo pro provedení měření.

Po zhotovení aktivizované membrány se připraví platinová indikační elektroda, vložená do . nosiče známým způsobem. Povrch indikační elektrody se namočí na dobu 2 až 3 minut do roztoku kyseliny dusičné o koncentraci 6 molů/diji³, nakapaného na skleněnou desku. Kyselina dusičná se omyje destilovanou vodou. Po omytí se povrch indikační elektrody namočí do čerstvě připraveného 2% roztoku kyseliny askorbové po dobu 20 až 30 minut. Po namočení se kyselina askorbová odstraní z povrchu indikační elektrody omytím destilovanou vodou. Poté je indikační elektroda připravena k měření. (Smočení v kyselině dusičné a askorbové je nutno během měření opakovat každé 2 až 3 týdny.)

Po přípravných operacích je sestaven podle obr. 1 senzor selektivní na glukózu a poté napojen na polarizující zdroj napětí a jednotku na měření síly proudu.

Stanovení koncentrace glukózy ve vzorku je možno provést sestrojením kalibrační křivky nebo adiční technikou. V dalším je uvedena výhodná varianta adiční techniky, tzv. metoda vícenásobného přidávání vzorku.

Bylo zjištěno, že mezi snímáním naměřené síly proudu (Aj) a koncentrací glukózy roztoku (c) existuje tato souvislost:

Δ, = _k-₍ij kde

V je maximální rychlost reakce,

K je Michaelisova konstanta reakce en-.

zym-substrát a k značí poměrový faktor.

Z hodnoty naměřené síly proudu ve dvou roztocích, obsahujících glukózu o známé koncentraci, je možno stanovit hodnoty V a K, závisející na daných okolnostech a na senzoru, na základě čehož je též možno stanovit koncentraci n-tého roztoku vzorku z ubývající síly proudu, jak uvedeno níže

C, =. i„k

JC,-, + K)²

K + V (2).

Na základě rovnice (2) je koncentrace vzorku kde a, je objem n-tého vzorku a

V_A je objem vzorku a standardu dohromady.

V případě krve a moče se provádí měření metodou vícenásobného přidávání vzorku způsobem, uvedeným níže.

Do vytemperovaného článku o teplotě 37⁰ Celsia se naměří 6,6 ml ústojného roztoku o hodnotě pH 7,4. Do roztoku se ponoří senzor. Z naměřené hodnoty síly proudu se urči po přidání 60 až 200 mikrolitrů roztoků obsahujících glukózu o koncentraci 2 x 10~² molu/dm³ hodnoty V a K numericky nebo automaticky. Poté se naměří do ústojného roztoku známé objemy vzorků a určí se úbytek síly proudu. (V závislosti na předpokládaném obsahu glukózy zkoumaného vzorku krve se mění objem vzorku. V případě vzorků o koncentraci mezi 60 až 200 mg/100 mí by objem vzorku měl obnášet 100 mikrolitrů, v případě zředěnějšího vzorku 200 mikrolitrů, a u koncentrovaného vzorku 50 mikrolitrů. V případě vzorku moče o koncentraci 0 až 1 000 mg/100 ml je naměřený objem 25 mikrolitrů; u koncentrovanějších vzorků se provede desetinásobné zředění a ze zředěného vzorku se odměří 25 až 50 mikrolitrů.) Z naměřené hodnoty úbytku síly proudu se vypočte hledaná koncentrace — pomocí rovnice 2 — numericky nebo pomocí počítače.

.Hodnoty naměřené senzorem selektivním na glukózu jsou uvedeny pro některé vzorky v tab. I,

Z tabulky I je patrno, že rozptyl hodnot měřených senzorem selektivním na glukózu je podstatně menší než rozptyl u známých metod, kde často přesáhne hodnotu 10 %.

TABULKA I

Koncentrace	Počet
standardního	paralelních
roztoku mg/100 ml	měření
180	11
120	11
90	11

Střední hodnota Rozptyl naměřených údajů v °/o mg/100 ml

180 ' 5

121 3

3

Podle tohoto příkladu je možno též vyrobit jiné molekulárně selektivní senzory. V tabulce II jsou uvedeny některé další příklady. V prvním sloupci je uveden enzym zakotvený na přirozené membráně a spojený s blánou propustnou pro plyny. Ve třetím sloupci je uveden druh indikační elektrody.

Stanovená komponenta Kyselina močová .

Cholesterin

L-aminokyselina

D-aminokyselina

D-galaktóza

Sulfit

Oxalát (šťavelan)

Xantin o-difenol p-difenol-peroxid vodíku

Laktáty

Pyruváty

Alkohol

L-Fenylalanin

2-oxokyselina

Oxalacetát

Acetoacetát

L-.válin

L-glutamát

L-ornitin

L-lysin

Penicilín

TABULKA II Zakotvený enzym

Urikáza

E.C.1.7.3.3.

Cholesterinoxidáza E.C.l.1.3.6.

Oxidáza L-aminokyseliny E.C.1.4.3.2.

Oxidáza D-aminokyseliny E.C.1.4.3.3. Galaktozooxidáza E.C.1.1.3.5.

Sulfitooxiidáza

E.C.1.8.3.1.

Oxalátoxidáza

E.C.1.2.3.4.

Xantinoxidáza

E.C.1.2.3.2.

o-difenoloxidáza

E.C.1.10.3.1.

Kataláza

E.C.1.11.1.6.

Laktázooxidáza

E.C.1.1.3.2.

Pyruvátooxidáza

E.C.1.2.3.3.

Alkoholoxidáza

E.C.1.1.3.1.3.

L-fenylalanináza

E.C.1.14.3.1.

Pyruvátdesoxidáza

E.C.4.1.1.1.

Oxalacetátdekarboxyláza

E.C.4.1.1.3.

Acetoacetátdekarboxyláza

E.C.4.1.1.4.

Valindekarboxyláza

E.C.4.1.1.14.

Glutamátdekarboxyláza

E.C.4.1.1.15.

Ornitindekarboxyláza

E.C.4.1.1.17.

Lysindekarboxyláza

E.C.4.1.1.18.

— Laktamáza I. E.C.3.5.2.6.

Indikační elektroda Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Platina

Elektroda selektivní na .vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty Elektroda 'selektivní na vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty Elektroda selektivní na vodíkové kationty

Příklad 2

Obr. 2 znázorňuje příkladné provedení senzoru selektivního na močovinu v částečném průřezu podle tohoto vynálezu. V tělese 1 senzoru se nachází roztok elektrolytu 2 obsahující chloridové anionty, do něhož jsou ponořeny indikační elektroda 4, selektivní na amoniové kationty, a stříbrná-stříbrochloridová referenční elektroda 5. Indikační elektroda 4 je upevněna na konci tělesa 1 senzoru uzávěrem, nepropustným pro· roztok elektrolytu, s kotoučovou těsnicí vrstvou 11. Indikační elektroda 4 je v dotyku s membránou 7 přirozené struktury, tvořenou částí stěny vzduchového měchýře ryby, která obsahuje ureázu (E.C.3.5.1.5. J, zakotvenou glutaraldehydem. Membrána přirozeného původu 7 je připevněna ke krytu 1 gumovým prstencem 8. Ve stěně 2 krytu 1 je uložena filtrační vrstva 12 (například keramická tyčinka), propustná pro roztok elektrolytu. Druhý konec krytu 1 je uzavřen uzavírací klapkou 9 z umělé hmoty. Indikační elektroda 4 a referenční elektroda 5 jsou spojeny kabelem 10 se vstupy elektronického měřiče napětí (voltmetru).

Uspořádání reaktivní vrstvy senzoru, selektivního na močovinu, na membráně přirozeného původu je provedeno stejně jak uvedeno v příkladu 1. Jediný rozdíl spočívá v tom, že v tomto případě je na povrchu membrány zakotvena ureáza (E.C.3.5.1:5.). Sestavení senzoru je provedeno^ tak, jak znázorněno na obr. 2. Koncentraci zkoumaného vzorku je možno stanovit známým způsobem, buď pomocí kalibrační křivky ems-koncentrace nebo pomocí adiční techniky.

Jiné molekulárně selektivní senzory mohou též být provedeny podle příkladu 2. V tabulce III je uvedeno několik dalších příkladů. V prvním sloupci tabulky je uveden druh molekuly, na nějž senzor selektivně reaguje, ve druhém sloupci je uváděn zakotvený enzym, a ve třetím sloupci selektivní indikační elektroda, kterou je nutno pro tento účel použít.

TABULKA III

Stanovená komponenta

Zakotvený enzym

Indikační elektroda

L-dioxyfenylalanin

L-fenylalanin

D-aminokyselina

D-serin

L-homoserin

L-treomin

L-histidin

Nitrit

L-aminooxidáza

E.C.1.4.3.2.

L-aminooxidáza

E.C.1.4.3.2.

Oxidáza L-aininokyseliny E.C.1.4.3.2. D-s'erindehydratáza E.C.4.2.1.14.

Homoserindehydratáza

E.C.4.2.1.15.

Treomindehydratáza

E.C.4.2.1.16.

Histidáza

E.C.4.3.1.3.

Nitritreduktáza

E.C.1.6.6.4.

Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty Elektroda selektivní na amoniové kationty

Příklad 3

Uspořádání senzoru selektivního na arginin podle tohoto vynálezu je podle příkladného provedení v podstatě stejné jako uspořádání senzoru selektivního na močovinu, popsaného v příkladu 2. Uspořádání senzoru, uváděné v příkladu 3 se liší v tom, že na konci krycího tělesa 1 se nachází dvě na sebe navrstvené membrány 7 přirozeného původu, které jsou tam upevněny gumovým prstencem 8. Na membráně, položené na straně indikační elektrody, je nanesena ureáza, vázaná v zakotvené formě, zatímco na druhé, perforované membráně je vázána v zakotvené formě argináza. Senzor selektivní na arginin je tedy vybaven dvěma reaktivními vrstvami.

Výroba senzoru selektivního na arginin se provádí podle tohoto vynálezu následovně. Nejdříve se vyrobí senzor selektivní na močovinu tak, jak popsáno v příkladu. 2. Poté se na přirozenou membránu, obsahující ureázu, položí další perforovaná membrána z ovčího střeva, na jejímž povrchu se vytvoří reaktivní vrstva obsahující argininázu (E.C.3.5.3.1.). Výroba reaktivní vrstvy se děje tak, jak popsáno v příkladu 1 s tím rozdílem, že v ústojném roztoku sé navíc. suspenduje 10 mg albuminu.

Senzor selektivní na arginin může být vyroben též tak, že pro uspořádání senzoru je třeba jen jedné membrány 7 přirozeného původu, na jejímž povrchu jsou zakotveny dva druhy enzymů, argináza a ureáza v statisticky homogenním rozložení. Při tomto provedení jsou další uspořádání a výroba senzoru stejné jako v předchozím případě.

Funkce senzoru spočívá na dvoustupňové reakci:

L-Arginin + H2O Močovina + H2O

Argináza E.C.3.5.3.1. Ureáza E.C.3.5.1.5.

··> Koncentraci argininď zkoumaného vzorku je možno stanovit známým způsobem, a to ''pomocí kalibrační křivky nebo použitím adiční techniky.

O dalších molekulárně selektivních senzorech, které je možno vyrobit podobným způsobem jak uvědeno v příkladu 3, tj. se dvěma reaktivními vrstvami nebo s jednou reaktivní vrstvou, obsahující dva druhy enzymů rozložené statisticky homogenně, podává tabulka IV.

L-Ornitin + močovina Kysl. uhličitý + amoniak CO2 NHs

V prvním sloupci je uvedena molekula, stanovitelná senzorem, ve druhém sloupci je uveden enzymatický katalyzátor, zakotvený na vnější membráně přirozeného původu. Ve třetím sloupci jsou uvedeny enzymatické katalyzátory umístěné blíže indikační elektrody, tj. na vnitřní membráně. Ve čtvrtém sloupci jsou uvedeny dosahy indikačních elektrod.

. TABULKA IV £5_tanpýpvaiiá . Druh enzymu , zakotveného na povrchu membrány komponenta. \ první druhý Indikační elektroda.

Iňbsin -Uridinnukleozidáza Xantinooxidáza Platina

Adenosin	E.C.3.2.2.2. Adenosinnukleozidáza E.C.3.2.2.a.
Guanosin	Guanosinfosforyláza E.C.2.4.2.15.
Guanin ' Krestinin	' Guanáza E.C.3.5.4.3. Krestinináza E.C.3.5.3.3.
beta-D-glukosldy, disacharidy, amygdalin, salicin alfa-D-glukosidy (např. maltóza) D-glukčzol“ -fosfáty D-glukózo-6-fosfáty Barbituráty '	beta-glukosidáza E.C.3.2.1.21. alfa-glukosidáza E.C.3.2.1.20. Glukózo-l-fosfatáza E.C.3.1.3.10. / E.C.3.1.3.9. Glukózo-6-fosfatáza Barbituráza E.C.3.5.2.1.

Příklad 4 v příkladě 4 sé popisuje příkladné provedenía výroba bifunkčních molekulárně selektivních senzorů vyráběných podle tohoto .Vynálezu.

- V krycím· tělese 1 se nachází tlumicí rozťůk 2, obsahující chloridové anionty, do ilějž jsoú ponořeny dvě platinové indikační elektrody, které jsou . jednotlivě vestavěny Vždy v jednom nosiči 3. S povrchy indikačních elektrod 4 je ve styku polypropylenová-blána 6 propustná pro plyny, upevněná /tta bťvóřu krycího tělesa 1. Povrch blány 6 je pokryt kouskem kůže, membránou přihozeného původu. Na části povrchu membrány 7 přirozeného¹ původu, která je ve styku s jednou z indikačních elektrod 4,

E.C.1.2.3.2.
Adenindeamináza	Elektroda selektivní
E.C.3.5.4.2.	na amoniové nebo vodíkové kationty
Guanáza	Elektroda selektivní
E.C.3.5.4.3.	na amoniové nebo vodíkové kationty _
Xantinooxidáza E.C.1.2.3.2.	Platina
Ureáza	Elektroda selektivní
E.C.3.5.1.5.	na amoniové nebo vodíkové kationty
Glukózooxidáza E.C.l.1.3.4.	Platina
Glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.	Platina
Glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.	Platina ;
Glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.	Platina
Ureáza	Elektroda selektivní
E.C.3.5.1.5.	na amoniové nebo vodíkové kationty

nebo na stejné části povrchu membrány na protilehlé straně je vázána zakotvením oxidázy D-aminokysellny a na druhé části povrchu membrány, která je ve styku š druhou indikační elektrodou, nebo na stejné části povrchu membrány na protilehlé straně je vázána zakotvením oxidáza L-aminokyseliný. '

Další podrobnosti uspořádání bifunkčního molekulárně selektivního senzoru jsou stejné jako uspořádání senzoru uvedené v příkladu 1.

Výroba reaktivních vrstpv, obsahujících oxídázu aminokyseliny se provádí následovně. Na polypropylenovou blánu, propustnou pro plyny, se napne mokrá kožní membrána. Poté se nechá 30 minut sušit při tep241022

Iotě okolí. Pak se na část jejího povrchu rozdělí 10 mikrolitrů fosfátového ústojného roztoku o pH hodnotě 8,3, ve kterém každý 0,1 ml obsahuje v suspendované formě 5 mg oxidázy D-aminokyseliny (E.C.1.4.3:3 Sygma, krystalické), a poté se ještě přidá 10 mikrolitrů 25% roztoku glutaraldehydu. Potom se .na jinou část povrchu membrány rozdělí 10 mikrolitrů fosfátového ústojného roztoku o hodnotě pH 6,5, z něhož každý 0,1 ml obsahuje v suspendované formě 10 mg oxidázy L-áminiokyseliny (E.C.1.4.3.2. Sygma IV], a později se ještě přidá 10 mikrolitrů 25% roztoku glutaraldehydu.

Další kroky postupu výroby jsou stejné jak popsáno v příkladu 1. Pomocí bifunkčního molekulárně selektivního senzoru je možné paralelní selektivní stanovení D a L Izomerů aminokyselin. Měření se provádí tak, že selektivní senzor je kalibrován nejprve roztokem L-formy a teprve potom roztokem D-formy stanovované aminokyseliny (například fenylalaninu). Při provádění kalibrace je senzor vpraven do míchaného fosfátového ústojného roztoku (pH 8) ve standardním roztoku míchaném konstantní rychlostí o stejné hodnotě pH, a měří se změna intenzity proudu (Aj) vzniklá účinkem —0,6 V polarizačního napětí. Jestliže interpretujeme hodnoty Aj jako funkci koncentrace standardních roztoků, je možno zhotovit kalibrační křivky a s jejich pomocí po měření A_s stanovit poměr optických izomerů různých aminokyselin.

Použití komplexního senzoru zhotoveného podle uvedeného příkladu je mimořádně výhodné při zkoumání účinnosti resolvačních procesů.

K stanovení poměru izomerů je možno též dobře použít adiční techniky popsané v příkladu 1. Podle příkladu 4 je možno zhotovit další, výhodně použitelné bifunkční molekulárně selektivní senzory podle tohoto vynálezu. O tom podává přehled tabulka V.

Ve druhém sloupci tabulky jsou uvedeny názvy enzymů zakotvených na jedné části povrchu, a ve čtvrtém sloupci názvy enzymů zakotvených na druhé části povrchu.

TABULKA V

Stanovovaná komponenta	Enzym zakotvený na jedné straně membrány
Glukóza	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.
Glukóza	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.
Močovina	ureáza E.C.3.5.1.5.
Glukóza	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.
Glukóza	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.
Močovina	ureáza E.C.3.5.1.5.
Glukóza	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.

Stanovovaná Enzym zakotvený na komponenta druhé části membrány

Příklad 5

V příkladě 5 je popsáno příkladné uspořádání a výroba multifunkčního molekulárně selektivního senzoru podle tohoto vynálezu, vhodného pro paralelní stanovení různých aminokyselin.

Uspořádání multifunkčního senzoru je podobné bifunkčnímu senzoru popsanému v příkladě 1. Rozdíl spočívá v tom, že neob. sáhuje blánu 6 propustnou pro plyny, a kromě toho v tom, že v roztoku elektrolytu 2, umístěném v krycím tělese 1, jsou ponořeny tři skleněné elektrody selektivní na vodíkové kationty, které jsou ve styku s membránou 7 přirozeného původu, na níž jsou ná třech dobře oddělených částech povrchu provedeny tři různé reaktivní vrstvy, v nichž

alkohol	alkoholooxidáza E.C.1.1.3.1.9.
manóza	hexózooxidáza E.C.1.1.3.5.
kreatinin	kreatinináza E.C.3.5.3.3.
kyselina močová	urikáza E.C.1.7.3.3.
L-fenylalanin	L-fenylalanináza E.C.1.14.3.1.
Arginin	Arginindekárboxyláza E.Č.4.1.1.19.
Amygdalin	Glukózooxidáza E.C.3.2.1.21.
	glukózooxidáza E.C.1.1.3.4.
jsou vázány v	zakotvené formě tři selektiv·

ní aminodekarboxylázy (L-lysindekarboxyláza, L-tyrozindekarboxyláza, L-fenylaÍanindekarboxyláza). Reaktivní vrstvy se zhotovují v souladu s popisem v příkladu 1.

Pomocí molekulárně selektivního senzoru, zhotoveného v příkladném provedení je možno selektivně stanovit obsali L-tyrozinu, L-lysinu a fenylalaninu ve vzorcích, obsahujících aminokyseliny. Stanovení je možno provést pomocí tří kalibračních křivek potenciálu a koncentrace, odpovídajících třem uvedeným aminokyselinám.

Je možno zhotovit i další podobné varianty podle příkladně popsaného multifunkčního molekulárně selektivního senzoru. Jednotlivé části reaktivní vrstvy obsahují v za241022 kotvené formě tyto enzymy: L-arginindekarboxylázu, L-glutamindekarboxylázu, dekarboxylázu kyseliny L-glutaminové, L-histidindekarboxylázu, ureázu.

Claims (5)

1. předmEt

   1. Molekulárně selektivní senzor pro stanovení koncentrace molekul nebo iontu v roztocích, sestávající z krycího tělesa naplněného roztokem elektrolytu, nesoucího potenciometrickou, voltampérickou indikační elektrodu a referenční elektrodu, ponořené do roztoku elektrolytu, blány propustné pro plyn nebo pro· plyn a rozpuštěné látky, uzavírající otvor umístěný na straně indikační elektrody, přičemž blána je ve styku s vrstvou ..gelu, obsahující chemicky vázaný enzym selektivní pro stanovovanou látku, a elektrody jsou spojeny se zdrojem napětí a měřidlem síly proudu, nebo jednotkou pro měření napětí, vyznačující se tím, že otvor tělesa (1) senzoru nacházející se na straně indikační elektrody (4), je uzavřen alespoň jednou kontinuální nebo perforovanou membránou (7) přirozeného původu, obsahující v povrchové vrstvě alespoň jeden druh enzymu vázaného chemicky v zakotvené formě, přičemž uvedená membrána (7) je ve styku s blánou (6) propustnou pro plyny nebo pro plyny a rozpuštěné látky, a mezi tělesem (1) senzory a indikační elektrodou (4) je vytvořena izolační vrstva (11), zatímco ve stěně krycího tělesa (1) je vestavěn filtr propustný pro roztok elektrolytu.

   VYNALEZU
2. 2. Molekulárně selektivní senzor podle bodu 1 vyznačující se tím, že membrána (7) přirozeného původu je ve styku s ochrannou sítí nebo tkaninou, zhotovenou z inertní látky.
3. 3. Molekulárně selektivní senzor podle bodů 1 a 2 vyznačující se tím, že obsahuje větší počet indikačních elektrod (4).
4. 4. Molekulárně selektivní senzor podle bodů 1 až 3 vyznačující se tím, že v horní vrstvě membrány (7), která neobsahuje žádný enzym v zakotvené formě, je vytvořena vrstva propustná pro plyny nebo pro plyny a rozpuštěné látky.
5. 5. Způsob výroby molekulárně selektivního senzoru podle bodů 1 až 4 vyznačující se tím, že se v horní vrstvě membrány přirozeného původu zakotví pomocí chemické vazby alespoň jeden druh enzymu, načež se membrána obsahující zakotvený enzym spolu s blánou propustnou pro plyny nebo plyny a rozpuštěné látky upevní na otvor dutého tělesa, do něhož se umístí jednak roztok elektrolytu, a jednak alespoň jedna indikační elektroda a alespoň jedna referenční elektroda.