CS240392B1 - Způsob přípravy vysoce polymerní chromosamální dsoxyrlbonukleové kyseliny značené uniformně radioizotopem 14C - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy vysoce polymerní deoxyribonukleové kyseliny uniformně značené radioizotopem 14C, založený na kultivaci sinic rodu Synechococcus v atmosféře 14COs a následné izolaci deoxyribonukleové kyseliny z radioaktivní biomasy. Podstata vynálezu spočívá v tom, že zdrojem deoxyribonukleové kyseliny je biomasa' získaná řízeným kultivačním procesem při specifické růstové rychlosti μ' 0,20 až 0,25 li"* 1, při celkovém využití 14COj z prostředí vyšším než 75 % a s minimálním obsahem DNA 1 % v sušině, přičemž se izolací získá deoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmotností 10s až 107 atomových hmotnostních jednotek.

Description

(54) Způsob přípravy vysoce polymerní chromosamální dsoxyrlbonukleové kyseliny značené uniformně radioizotopem ¹⁴C

2

Způsob přípravy vysoce polymerní deoxyribonukleové kyseliny uniformně značené radioizotopem ¹⁴C, založený na kultivaci sinic rodu Synechococcus v atmosféře ¹⁴COs a následné izolaci deoxyribonukleové kyseliny z radioaktivní biomasy. Podstata vynálezu spočívá v tom, že zdrojem deoxyribonukleové kyseliny je biomasa' získaná řízeným kultivačním procesem při specifické růstové rychlosti μ' 0,20 až 0,25 li^{* 1}, při celkovém využití ¹⁴COj z prostředí vyšším než 75 % a s minimálním obsahem DNA 1 % v sušině, přičemž se izolací získá deoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmotností 10^s až 10⁷ atomových hmotnostních jednotek.

Vynález se týká způsobu přípravy vysoce' polymerní chromosomální deoxyribonukleové kyseliny uniformně značené radioizotopem ¹⁴C, založený na kultivací sinic rodu Synechococcus, s výhodou Synechococcus elongatus (NAG./NAG. var. thermalis kmen Kovrov 1972/8), v atmosféře ¹⁴COž a následné izolaci deoxyribonukleové kyseliny z radioaktivní biomasy.

Sinice patří mezi prokaryontní mikroorganismy s fotoautotrofní výživou a jsou jsou schopny využívat CO2 (popřípadě uhličitany) jako jediný zdroj uhlíku. Kromě toho se vyznačují vysokou odolností vůči radioaktivnímu záření [Carr, N. G., Whitton,

B. A., The biology of blue-green algae (1973), Kraus, Μ. P., Radiation Botány, 9, 481 (1969)]. Jejich hlavní předností z hlediska využití při výrobě organických látek značených radioizotopem ¹⁴C je tedy schopnost růstu v prostředí ¹⁴CO2 po několik generací velkou růstovou rychlostí a produkovat biomasu s vysokým obsahem radioizotopu.

Jak již bylo řečeno, sinice rodu Synechococcus patří k prokaryontům, podobají se tedy v mnohém bakteriím: stavbou buněčné stěny, vysokou specifickou růstovou rychlostí, vys-Okým obsahem nukleových kyselin v sušině. Chemické složení biomasy však silně závisí na kultivačních podmínkách a růstové rychlosti kultury [Stanier, R. Y., Van Niel, C. B., Arch. Mikrobiol., 42, 17 (1962)]. Specifickou vlastností sinic je fotoautotrofní způsob výživy (fotosyntéza) a odolnost některých druhů vůči extrémním kultivačním podmínkám — vysoké teplotě, s kultivačním optimem až 343 K [Castenholtz, R. W., Bacteriol. Rev., 33, 476 (1969)], v širokém rozmezí intenzity světla [Beljanin, V. N., Trenkenšu, A. P., Arch. Hydrobiol. Suppl. 51, Alological Studies 18, 46 (1977)], a radioaktivnímu záření [Kraus, Μ. P., Radiaton. Botany, 9, 481 (1969), Sparow, A. H., Radiation Research, 32, 915 (1967)].

Řízeným režimem kultivace sinic, které jsou schopny růst a rozmnožovat se v atmosféře ¹⁴CÓ2 po několik generací, lze získat biomasu (a tedy i deoxyribonukleovou kyselinu) s různým stupněm inkorporace radioizotopu. Na jedné straně s velice nízkou měrnou radioaktivitou, (odpovídající traceru), ale na druhé straně i vysoce radioaktivní biomasu, v níž lze předpokládat více než 95 % uhlíku nahrazeného radioizotopem. Měrnou radioaktivitu výsledného produktu lze regulovat tím, že za zdroj uhlíkuslouží CO?, a ¹⁴CO2 v určitém poměru. Obsah radioizotopu v biomase lze ale měnit i tak, že kulturu pěstujeme výlučně v prostředí ¹⁴CO2, ale necháme ji růst jen do určité hustoty (jen jednu nebo 2 generace). Popsaným způsobem by bylo možno například sledovat závislost mezi stupněm inkorporace ¹⁴C do deoxyribonukleové kyseliny a letalitou (případně deformací morfologické struktury) buněk.

Otázka schopnosti regenerace organismů a schopnosti odolávat e trém ním podmínkám je v současné době stále v popředí zájmu. Možnost studia DNA izolované z těchto zvláštních mikroorganismů je proto zvlášť lákavá.

V souvislosti s rozvojem molekulární biologie a molekulární genetiky jsou stále žádanější preparáty nukleových kyselin se zachovanou biologickou účinností, makromolekuly a neporušenou chemickou, ale i fyzikální strukturou (Watsen, J. D., Molekulární biologie genu, .Akademia Praha 1982). Z tohoto důvodu také silně stouply nároky na separační a izolační metody v biochemii. Bylo prokázáno, že vhodný postup pro izolaci DNA lze navrhnout pouze na základě dobré znalosti použitého zdroje nukleových kyselin (mikroorganismu) — znalosti struktury a chemického složení buněk, fyziologie. Pro navržení izolačního postupu v preparativním měřítku je také nutné zaručit standardní biologický materiál s konstantním obsahem nukleových kyselin. Chemické složení biomasy sinic a jejich růstová rychlost závisí nejen na specifických vlastnostech vybraného kmene, ale také na složení živného roztoku, kultivační teplotě a také na intenzitě a spektrálním složení světla [Carr, N. G., Whitten, B. A., The biology of blue-green algae (1973), Beljamin, V. N., Trenkenšu, A. P., Arch. Hydrobiol./Suppl. 51, Algological Studies 18, 46 (1977)]. Proto standardní biologický materiál lze získat jen vhodným výběrem a přísným dodržováním kultivačních podmínek.

Základní principy izolace vysoce polymerní DNA z mikroorganismů formulovali již v roce 1961 Marmur a r. 1964 Kirby J Marmur, J., J. Mol. Biol., 3, 203 (1961), Kirby, K. S., Biochem. J., 93, 5c (1964)]. Studium vlastností deoxyribonukleové kyseliny ze sinic a tedy i její izolací se později zabývala ,celá řada autorů: Edelman, M, Swinto, D., Schiff, J. A., Eppstein, Η. T., Zeldin, B., Bacteriol. Rev., 31, 315 (1967), Graig,

I. W., Leach, C. K., Carr, N. G., Arch. Mikrobiol., 85, 218 (1969), Stanier, R. Y., Kunisava ,R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G., Bacteriol. Rev., 35, 171 (1971). Jednalo se však převážně o pokusy v analytickém měřítku na neradioaktivním materiálu a na jejich základě lze určit jen obecně jednotlivé operace izolačního postupu.

Dosavadní informace o přípravě DNA ze sinic lze shrnout takto:

A. postup lze rozdělit na operace:

1. příprava vhodného zdroje DNA

2. chemická lyže nebo mechanická desintegrace buněk

3. inaktivace deoxyribonukleáz

4. extrakce nukleových kyselin

5. deproteinace

6. separace DNA a RNA

7. purifikace a specifikace DNA.

Β. Pro jednotlivé operace jsou různými autory navrženy různé metody a činidla bez udání konkrétních podmínek, kterých však nelze použít obecně. Vždy je nutno volit určitou metodu až podle zvoleného druhu mikroorganismu.

C. Pokud je uveden podrobný postup, týká se jen určitého speciálního druhu a kmene mikroorganismů.

D. Izolace DNA ze sinic byla popsána pouze obecně z neradioaktivního materiálu a jen u. některých vybraných kmenů.

Příprava vysocepolymerní DNA značené radioizotopem ¹⁴C ze sinice rodu Synechococcuš má některé specifické zvláštnosti, které nebyly dosud řešeny. V návrhu technologického postupu je nutno ja mít na zřeteli.

Výše uvedený stav je řešen komplexním způsobem přípravy vysoce polymerní chromosomální deoxyribonukleové kyseliny uniformně značené radioizotopem ¹⁴C, založeným na kultivaci sinic rodu Synechococcus v atmosféře ¹⁴COž a následné izolaci deoxyribonukleové kyseliny z radioaktivní biomasy, jehož podstatou je, že zdrojem deoxyribonukleové kyseliny je biomasa získaná řízeným kultivačním procesem při specifické růstové rychlosti μ = 0,20 až 0,25 h^-1, při celkovém využití ¹⁴CO2 z prostředí vyšším než 75 % a s minimálním obsahem DNA 1 % v sušině, přičemž se izolací získá deoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmotností 10⁶ až 10⁷ atomových hmotnostních jednotek.

Výhody navrhovaného postupu lze shrnout následovně:

1. Byl vybrán vhodný mikroorganismus rostoucí v prostředí s vysokou radioaktivitou a schopný inkorporovat radioizotop ¹⁴C s vysokou účinností. Výhodou vybraného kmene Synechococcus elongatus var. thermalis kmen Kovrov je také růstové optimum při 56 ^CC. Při této teplotě je silně potlačen rozvoj případných infikujících mikroorganismů; vyšší kultivační teplota je výhodná i z hlediska energetického, protože při použití intenzivního „teplého“ světelného zdroje, kdy dochází k přehřívání suspenze, není u termofilního kmene nutné intenzívní chlazení.

2. Byl navržen vhodný kultivační režim, zajišťující standardní biologický materiál, jako zdroj DNA s reprodukovatelným obsahem nukleových kyselin.

3. Byla navržena vhodná metoda lyže a podmínky, které vedou k dokonalému uvolnění DNA z buněk.

4. Zredukováním manipulace se vzorkem (míchání, třepání) na nejmenší míru, jejíž důsledkem by byla mechanická degradace DNA, byl získán preparát s molekulovou hmotností 10⁸ až 10⁷ atomových hmotnostních jednotek.

Příklad

1. Kultivace sinic

V následující tabulce je uveden procentuální obsah nukleových kyselin v sinicl Synechococcus elongatus (NAG./NAG. var. thermalis kmen Kovrov 1972/8) v závislosti na specifické růstové rychlosti. Kultura byla pěstována v živném roztoku, jehož složení je následující:

1 litr živného roztoku obsahuje:
KNOj	1	g
NaNCb	1	g
K2HPO4	1	g
NaHCCb	0,84	g
MgSOi	0,25	g
Fe+3 (chelatonátj	18,4	mg
Ca+2 (CaChj	15,6	mg

Mikroelementy:

Cu⁺² 0,635 mg

Mo⁺⁶ 0,960 mg

Zn⁺³ 0,650 mg

Co+² 0,590 mg

Mn*² 0,600 mg

EDTA (sodná sůl) mg

Sinice rodu Synechococcus elongatus (NAG./NAG. var. thermalis Kovrov 1972/8} se kultivuje v prostředí ¹⁴CD2. Kultivační aparaturu tvoří skleněný válec s temperovaným pláštěm, kterým protéká chladicí voda. Válec může obsahovat cca 700 ml suspenze sinic v živném roztoku. Tloušťka vnitřní části kultivačního válce je 45 mm. Kultivační válec je osvětlován dvěma •žárovkami Teslafot 500 W, instalovanými do osvětlovacího tělesa tvaru U, s regulovatelným příkonem. Kultivační válec je spojen s další nádobou, v níž se připravuje živný roztok pro ředění kultury sinice po sklizni. Ke kultivačnímu válci je připojen vyvíječ ^1JCO2 (případně CO:). Celé zařízení je evakuováno, aby se zamezilo úniku plynů do ovzduší.

Kultivační režim:

složení živného roztoku je uvedeno v tabulce 2, kultivační teplota 56 ^CC, vnější ozářenost kultury 250 W . m^-2 FAR, plynná směs obsahuje 2 až 3 % obj. ¹⁴CO2, průměrná optická hustota kultury p 0,5 cm ₌. n CCJ ^ύ . 750 lira ^U’^0J’ střední specifická růstová rychlost kultury μ = 0,209 h^-1, střední doba zdvojení 3,3 hod., obsah DNA v sušině 1,11 °/o, RNA 7,69 °/o.

2. Izolace deoxyribonukleové kyseliny

Kultura sinic se ihned po sklizni odstředí a promyje roztokem. 0,1 M EDTA + 0,15 NaCl 10,2 M tris, pH = 8. Získaná biomasa se rozmíchá v 10 x zředěném konzervačním pufru v poměru 1:1a přidá se lysozym v koncentraci 5 mg na 10 g směsi a roztok 25 % laurylsulfátu sodného, aby výsledná koncentrace byla 1,25 %. Reakční směs se nechá inkubovat v termostatu při 37 °C tři hodiny. Potom se přidá roztok enzymu pronasy (Streptomyces griseus) v množství 0,5 mg na 10 g směsi. Směs se ponechá v chladnici 20 hodin. Lyže je ukončena, když se silně zvýší viskozita kapaliny a mikroskopickou kontrolou zjistíme jen několik procent neporušených buněk. Viskózní kapalina se smíchá se stejným objemem chloroformu (obsahující isoamylalkohol v poměru 24 :1) a jemně se míchá na třepačce v ploché nádobě. Po 30 minutách se kapalina zcentrifiguje při 5 000 x g 5 minut. Vytvoří se tři vrstvy. Horní vodná fáze se odsaje a

E_o/OD

Neradioaktivní kultura srazí vychlazeným ethanolem (výsledná koncentrace 80 1% objemu] v prostředí NaCl při pH = 88. Vláknitá sraženina nukleových kyselin se převede pomocí skleněné tyčinky do roztoku 0,15 M NaCl + 0,015 M citranu sodného, pH = 7 (dále jen 1 SSC). Deproteinace (míchání s chloroformem, případně s fenolem) se opakuje až do vymizení střední vrstvy, obsahující bílkoviny.

Separace DNA a RNA se provádí gelovou chromatografií na sloupci modifikované agarosy. Jako elučního roztoku se používá 0,1 M NaCl + tris 0,02 M pH = 8. Ekvilihrace se provádí 2,5 M NaCl -t- tris 0,02 M pH = = 8.

Relativní ozářenost kultury (E_o/OD) představuje poměr vnější ozářenosti kultury (Ej, měřené ve W.m^-2 fotosynteticky účinného záření (FAR, 400—700 nm], ke střední optické hustotě kultury (extlnkce při 750 nm měřená v 0,5 cm vrstvě suspenze). Jako světelný zdroj pro kultivační zařízení byly použity žárovky Teslafot 500 W.

TABULKA

DNA % v s.

RNA % v s.

0,125	157	0,95	5,01
0,241	475	1,41	8,35
0,285	606	1,48	9,86
0,321	1013	1,76	10,94

Kultura pěstovaná v prostředí ¹⁴CO₂

0,101	184	0,64	5,38
0,209 .	455	1,11	7,69

(μ/h^-1 ... střední specifická růstová rychlost kultury

E_o (W.m²] FAR ... vnější ozářenost kultury fotosynteticky účinným zářením (400—700 nm)

OD ... optická hustota kultury, měřená jako extinkce při 750 nm v 0,5 cm vrstvě suspenze

Z tabulky vyplývá, že se stoupající růstovou rychlostí stoupá i obsah nukleových kyselin v biomase. Růstových rychlostí vyšších než 0,3 h^-1 lze však na používaném kultivačním zařízení dosáhnout jen ve velmi zředěné kultuře sinic a celková produkce biomasy je potom nízká. Z tohoto důvodu byla pro produkční kultivaci sinic r. Synechococcus jako zdroje DNA, doporučena

Claims (1)

1. PREDMET

   Způsob přípravy vysoce polymerní chromosomální deoxyribonukleové kyseliny uniformně značené radioizotopem ¹⁴C, založený na kultivaci sinic rodu Synechococcus v atmosféře ¹⁴CO₂ a následné izolaci deoxyribonukleové kyseliny z radioaktivní biomasy, vyznačený tím, že zdrojem deoxyribonukleové kyseliny je biomasa získaná řízeným kulrůstová rychlost μ = 0,20 až 0,25 h^-1 (doba zdvojení potom odpovídá 2,5 až 3,0 h), které bylo dosaženo při relativní ozářenosti kultury 400—500 W . m^-2 FAR a optické kultury 0,5—0,6. Za těchto podmínek obsahovala biomasa 1—1,5 % DNA a 7,5—8,5 >% RNA v sušině.

   VYNALEZU tivačním procesem při specifické růstové rychlosti μ = 0,20 až 0,25 h¹, při celkovém využití ¹⁴CO₂ z prostředí vyšším než 75 procent a s minimálním obsahem DNA 1 % v sušině, přičemž se izolací získá deoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmotností 10⁶ až ΙΟ² atomových hmotnostních jednotek.