CS238268B1 - Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu je způsob klónování 'genů pro prochymosin hovězího původu, získaný zpětnou transkripcí polyA+ -mRNA - frakce se sedimentačním koeficientem 12 až 17S ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třítýdenních telat. Pomocí terminální -fcransferázy se připojí k dvouvláknovým · molekulám komplementární DNA jednovláknité homopolymerní konce o průměrné délce 55 až 200 nukleotidů, které se spojí s lineárním plasmidovým vektorem, který obsahuje po transferázové reakci rovněž homopolymerní jednovláknové, ale komplementární konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů, a přenesou do příjemoových buněk určených pro klónování, zejména buněk E. coli, Bacillus subtilis nebo Streptococcus, načež se provede selekce rekombinantních klonů.

Description

Vynález se týká klonováni genů pro prochymosin hovězího původu fsynonymní ho s pr orenni nem).

Klonováni eu karyontni ch nukleoti dových sekvencí, jakožto nosičů biologické informace, např. v E, coli, představuje metodu používanou ve stále větší míře /R. Wu /ed./: Meth. Enzymol. £§ /1979//, která se uplatňuje v různých postupech a řešeních genové technologie.

Předpokladem pro tvorbu specifických vektorů zajištujících expresi vybraných živočišných bílkovin je molekulární klonováni specifické kódující sekvence. Postup, který popsali a publikovali Nishimori et al. /J. Biochem. 22/ 901 až 904, 1981/, s použitím homopolymérové techniky /tailing/, se vyznačoval malou účinností /vzhledem k počtu rekombinantů v závislosti na použité DNA/ a kromě toho vedl pouze k získáni klonů, které měly maximálně 80 % délky celé kódujici sekvence. Použitím speciálního selekčního postupu pro dlouhé dvouvláknové molekuly cDNA z heterogenní populace je možno vypracovat účinnější postup klonováni kompletní kódující sekvence genu prochymosinu hovězího původu /patentový spis č. 143 794 /NDR//.

V řadě případů se podařila manipulace eukaryontnich nukleotidových sekvenci pod kontrolou prokaryontních regulačních elementů exprese, takže dochází k účinné mikrobiální syntéze eukaryontnich bílkovin:

Lidský insulin, A a B řetězce /Goeddel et al., Proč. natn.

Acad. Sci. USA, Jš, 106,

1979/

238 268 |3-endorphin

Lidský růstový hormon

Lidský elukocytárni interferon

Lidský fibroblastový interferon /Shine et al., Nátuře 2§5_Z 456, 1980/ /Goeddel et al._z Nátuře 2§J_Z 544, 1979/ /Goeddel et al._z Nátuře 2SZz 411_z 1980/ /Goeddel et al._z Nucl. Acids Res. 3_Z 4057, 1980/.

Podstata způsobu klonování funkčního genu pro prochymosin hovězího původu je_z že se pomoci terminálni transferázy připojí k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA jednovláknité homo polymérní konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů a tyto se spoji s lineárním plasmidovým vektorem, který obsahuje po trans ferázové reakci rovněž homopolymerní jednovláknové_z ale komplementární konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů a přenesou do příjemcových buněk určených pro klonováni, zejména buněk E. coli, Bacillus subtilis nebo Streptococcus, načež se provede selekce re kombinantnich klonů.

Podle tohoto vynálezu postup klonování kompletního funkčního genu pro prochymosin hovězího původu vychází z materiálu získaného zpětnou transkripcí polyA⁺-mRNA /frakce informační mRNA 12 «í 17S/ ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třítýdenních telat. Postup spočívá v tom, že se pomocí terminálni trans ferázy k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA takto získané populace DNA, která je heterogenní co do délky a sekvence, připojí jednovláknové konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů. Potom se tento materiál spojí s lineárním plasmidovým vektorem, který po transferázové reakci má homopolymerní, komplementární jednovláknové konce o průměrné délce pouze 10 až 20 nukleotidů, a přenese do příjemcových buněk určených pro klonováni, přednostně buněk E. coli, Bacillus subtilis nebo do streptokoků. Potom jsou selektovány rekotnbinantni klony.

Selekce probíhá buď

- hybridisaci in šitu podle Grunstein a Hogness /Proč. natn. Acad. Sci. USA 22/ 3961, 1975/ pomoci frakcionované polyA*-RNA z telecího žaludku, která obsahuje vysoce obohacenou translačně aktivní mRNA chymosinu, nebo

238 268

- hybridisaci in šitu nebo hybridisaci SNA - DNA pomoci chemicky syntetizovaných oligonukleotidů, které odpovídají části pro kódováni hovězího chymosinu, nebo

- technikami pro hybridisaci RNA - DNA /Alwine et al., Proč. natn. Acad. Sci„ USA Já/ 5350, 1977/.

Tyto techniky jsou vhodné k tomu, aby byly vybrány jednotlivé klony nebo rodiny klonů v jediném selekčním postupu /screening/. V kombinaci se specifickými translačními testy /např. hybridem zastavená translace, Paterson et al., Proč. natn. Acad. Sci. USA Z4, 4370 až 4374, 1977/ umožňuji specifický průkaz klonů chymosinu.

Postup klonování populací s jednovláknovými konci o různé délce aplikovaný na dvou vláknovou komplementární DNA /cDNA/j příp. vektorovou DNA vede k obohaceni dlouhých insertů DNA v re kombinantnich klonech ve srovnání s klonováním, které vychází z populací o podobné délce jednovláknových konců na dvouvláknové cDNA_ypřip. vektorové DNA /Patentový spis NDR č. 143 794/. Rekombinované plasmidy sestávají z pBR322-PstI-dG_n; dvouvláknová cDNA chymosinu /částečná nebo kompletní specifická nukleotidová sekvence^ dC^.pBR 322 značí vektorovou molekulu plasmidu Pstl. je restrikčni místo v této molekule, k němuž je připojena jednovláknová sekvence deoxyguanolových nukleotidů, a dC značí obdobnou sekvenci deoxycytidolových nukleotidů.

Přesto je při klonováni velmi dlouhých molekul mRNA /např. v připadě chymosinu = RNA 12 «ή. 17S; ve srovnáni s globinovou nebo proinsuli novou mRNA = RNA 9S/ možné, že specifické kódováni je topotogicky rozloženo na více než jednom rekombinovaném plasmidu. Pomocí společných restrikčnich míst uvnitř insertů je možné podle stavu techniky jednoduchým způsobem sestavit příslušný rekombinantní plasmid, který nese kompletní kódující sekvenci pro prochymosin /pre-prochymosin/.

Použitý vektorový plasmid pBR322 je vhodný pro klonováni cizích DNA přednostně u E. coli. Specifické plasmidy rekombinantů pBR322 - chymosin - dvouvláknová cDNA mohou být však pozměněny /např. vložením odpovídající replikačné regulační nebo expresně regulační sekvence/, takže rekombinantní plasmidy mohou být použity i k účinnému klonováni u kmenů Bacillus subtili nebo streptokoků.

238 268

Rekombinantni klony získané tímto klónovacím postupem, které obsahují specifické kódování pro hovězí chymosin, mohou být využity v těchto oblastech:

- jako molekulární sonda a/ pro analytický, specifický průkaz nukleové kyseliny chymosinu jako dodatečně značené /nick-translation/ fragmenty DNA /DNA = specifický genový fragment chymosinu telete/.

Tam mohou být vybrány /vyloveny/ specifické sekvence z genomových bank /klonovaná genomová DNA/, z bank dvouvláknové cDNA /klonované směsi dvouvláknové cDNA/. ale rovněž z extraktů tkáni /genomová DNA nebo RNA/ nebo ze směsi cDNA hovězího původu. Vybrané pozitivní klony z příslušných bank lze potom obvyklým způsobem kultivovat.

b/ k preparativnímu obohacení /vylovení'7 nukleotidových sekvenci, které představuji genové fragmenty chymosinu, zvláště z tkáňových extraktů. Zde přichází v úvahu obvyklé metody afinitni chromatografie_z např. s chromatografickým nosičem agarosového typu /Sepharosou/s navázanou DNA /DNA = specifický genový fragment chymosinu po klonování dvouvláknové cDNA/.

- jako specifická očka /priméry/ pro specifickou syntézu chymosinové cDNA na polyA⁺-mRNA, např. ze sliznice žaludku v různých fyziologických obdobích růstu zvířete. Přitom se používají částečné sekvence již klonované specifické chymosinové DNA v jednovláknové formě jako začátek replikace /očko, primér/ pro specifickou zpětnou transkripci.

- jako výchozí materiál ve vektoru exprese, takže se specifické kódováni dostává pod kontrolu účinného prokaryontniho regulačního elementu exprese. Tyto regulační elementy pocházejí buď z ranné oblasti fága T7 nebo T3jnebo např. z operonú pro laktosu, tryptophan, ale i z promotorů lambda nebo z hybridních regulačních elementů. Tímto způsobem je možno dosáhnout účinné transkripce a translace specifické chymosinové sekvence, kterou lze využít v technickém fermentačním postupu pro mikrobiální syntézu chymosinu.

Postup bude podrobněji vysvětlen na následujících příkladech, čímž ovšem není omezeno použiti vynálezu.

- 5 Příklady

Připrava dvouvláknové cDNA 238 268

Frakcionovaná polyA⁺-mRNA /frakce 12-17s; S = Swedbergova jednotka sedimentace/ ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třitýdennich telat je konvertována zpětnou transkriptásou z viru stači myeloblastosy /AMV/ v komplementární DNA /cDNA/ v objemu 1 ml reakční směsi/ která obsahuje 34 ^ug RNA, 10 ^ug oligo/dT/₁₂_₁₈, 50 mM Tria-HCl pH 8/2/ 50 mM KCl, 7,5 mM MgACg, 2 mM dithiotreitol /DTT/, 0,5 mM každého deoxynukleosid trifosfátu ZdNTP// odvozených od guninu /0/, cytosinu /C/_z adeninu /A/ a thyminu /17 /G, C, A, 1/, 600 ^uCi ^H-dCTP a 30 jednotek zpětné transkriptásy AMV /Liebscher/. Během 2 hodin při 37 °C bylo transkribováno 0,91 ^ug cDNA /cca 2,8 % přepis/ resp. 850.000 cpm v cDNA.

Tento materiál slouží ihned /bez předchozí frakcionace/ k syntéze dvouvláknové cDNA pomoci specifické části enzymu DNA-polymerásy I z E. coli /složeni Klenowova fragmentu Boehringer/ v reakční směsi obsahující 1,5 ^ug/ml cDNA_z 30 mM Tris-HCl pH 7/5/ 4 mM MgACg, 0,5 mM |3-mercaptoethanol_z 0_z5 mM každého dNTP /G, C, A, Τ/, 70 mM KCl a 62,5 jednotek enzymu/ml. Po 4 hodinách inkubace při 20 °C je směs zbavena bílkovin/ soli a dvouvláknové cDNA je preparativně ovlivněna nukleá sou S^_z aby byly z materiálu odstraněny jednovláknové úseky DNA. V objemu 300 ^ul reakční směsi obsahující 0,15 ^ug/ml cDNA /radioaktivní označení c DNA slouží jako referenční hodnota// 70 mM acetátu sodného pH 4,5, 250 mM NaCl_z 2 mM ZnSO^ a 100 jednotek /ml nukleásy je po 10 minutách inkubace při °C ještě 60 % značené cDNA_z to znamená, že 60 % cDNA je resistentní vůči nukleáse S^, resp. je přítomna v dvouvláknové formě. /V paralelním analytickém pokusu tato hodnota činila 75 % cDNA chymosinu, neovlivněná polymerásou, vykazovala pouze 16 % resistence vůči nukleáse Sp/

Po ovlivnění nukleásou byla dvouvláknové cDNA dělena a frakcionována v preparativním neutrálním lineárním hustotním gradientu sacharosy /5 až 20 % lineární gradient, 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 °C, 25.000 ot/min., Beckman Rotor SW41, 18 hod/. Frakce 10-14 /dlouhé molekuly/ a 15-20 /střední molekuly/ byly sebrány odděleně a dále použity. Globinová standardní 9S cDNA se nacházela v 23. frakci /vrcholová •frakce/ z celkového počtu 30 frakci. 238 268

Z údajů je vypočtena průměrná délka molekuly dvouvláknové cDNA odpovídající 600 párů baží /10. «<. 14. frakce/.

Vynálezu lze využít v potravinářském průmyslu, např. při výrobě sýrů, v živoěišné výrobě v krmivářství a ve veterinárním lékařství /přenos genu do organismu/.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   238 268

   Způsob klonování genů pro prochymosin hovězího původu získaný zpětnou transkripcí polyA⁺-mRNA - frakce se sedimentačním koeficientem 12 až 17S ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třítýdenních telat, vyznačený tím/ že se pomoci terminálni transferázy připojí k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA jednovláknité homopolymerní konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů a tyto se spojí s lineárním plasmidovým vektorem, který obsahuje po transferázové reakci rovněž homopolymerní jednovláknové, ale komplementární konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů a přenesou do příjemcových buněk určených pro klonování, zejména buněk E. coli_z Bacillus subtilis nebo Streptococcus, načež se provede selekce rekombinantních klonů.