CS238268B1 - Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu - Google Patents
Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu Download PDFInfo
- Publication number
- CS238268B1 CS238268B1 CS722283A CS722283A CS238268B1 CS 238268 B1 CS238268 B1 CS 238268B1 CS 722283 A CS722283 A CS 722283A CS 722283 A CS722283 A CS 722283A CS 238268 B1 CS238268 B1 CS 238268B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- stranded
- cloning
- nucleotides
- dna
- cdna
- Prior art date
Links
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 8
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 claims abstract description 6
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 claims description 3
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 2
- 210000003165 abomasum Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 abstract description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 28
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 25
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 14
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 10
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- -1 chymosin nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Předmětem vynálezu je způsob klónování
'genů pro prochymosin hovězího původu,
získaný zpětnou transkripcí polyA+ -mRNA -
frakce se sedimentačním koeficientem 12
až 17S ze sliznice čtvrtého žaludku dvou
až třítýdenních telat. Pomocí terminální
-fcransferázy se připojí k dvouvláknovým · molekulám komplementární DNA jednovláknité
homopolymerní konce o průměrné délce
55 až 200 nukleotidů, které se spojí s lineárním
plasmidovým vektorem, který obsahuje
po transferázové reakci rovněž homopolymerní
jednovláknové, ale komplementární
konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů,
a přenesou do příjemoových buněk
určených pro klónování, zejména buněk E.
coli, Bacillus subtilis nebo Streptococcus,
načež se provede selekce rekombinantních
klonů.
Description
Vynález se týká klonováni genů pro prochymosin hovězího původu fsynonymní ho s pr orenni nem).
Klonováni eu karyontni ch nukleoti dových sekvencí, jakožto nosičů biologické informace, např. v E, coli, představuje metodu používanou ve stále větší míře /R. Wu /ed./: Meth. Enzymol. £§ /1979//, která se uplatňuje v různých postupech a řešeních genové technologie.
Předpokladem pro tvorbu specifických vektorů zajištujících expresi vybraných živočišných bílkovin je molekulární klonováni specifické kódující sekvence. Postup, který popsali a publikovali Nishimori et al. /J. Biochem. 22/ 901 až 904, 1981/, s použitím homopolymérové techniky /tailing/, se vyznačoval malou účinností /vzhledem k počtu rekombinantů v závislosti na použité DNA/ a kromě toho vedl pouze k získáni klonů, které měly maximálně 80 % délky celé kódujici sekvence. Použitím speciálního selekčního postupu pro dlouhé dvouvláknové molekuly cDNA z heterogenní populace je možno vypracovat účinnější postup klonováni kompletní kódující sekvence genu prochymosinu hovězího původu /patentový spis č. 143 794 /NDR//.
V řadě případů se podařila manipulace eukaryontnich nukleotidových sekvenci pod kontrolou prokaryontních regulačních elementů exprese, takže dochází k účinné mikrobiální syntéze eukaryontnich bílkovin:
Lidský insulin, A a B řetězce /Goeddel et al., Proč. natn.
Acad. Sci. USA, Jš, 106,
1979/
238 268 |3-endorphin
Lidský růstový hormon
Lidský elukocytárni interferon
Lidský fibroblastový interferon /Shine et al., Nátuře 2§5Z 456, 1980/ /Goeddel et al.z Nátuře 2§JZ 544, 1979/ /Goeddel et al.z Nátuře 2SZz 411z 1980/ /Goeddel et al.z Nucl. Acids Res. 3Z 4057, 1980/.
Podstata způsobu klonování funkčního genu pro prochymosin hovězího původu jez že se pomoci terminálni transferázy připojí k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA jednovláknité homo polymérní konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů a tyto se spoji s lineárním plasmidovým vektorem, který obsahuje po trans ferázové reakci rovněž homopolymerní jednovláknovéz ale komplementární konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů a přenesou do příjemcových buněk určených pro klonováni, zejména buněk E. coli, Bacillus subtilis nebo Streptococcus, načež se provede selekce re kombinantnich klonů.
Podle tohoto vynálezu postup klonování kompletního funkčního genu pro prochymosin hovězího původu vychází z materiálu získaného zpětnou transkripcí polyA+-mRNA /frakce informační mRNA 12 «í 17S/ ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třítýdenních telat. Postup spočívá v tom, že se pomocí terminálni trans ferázy k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA takto získané populace DNA, která je heterogenní co do délky a sekvence, připojí jednovláknové konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů. Potom se tento materiál spojí s lineárním plasmidovým vektorem, který po transferázové reakci má homopolymerní, komplementární jednovláknové konce o průměrné délce pouze 10 až 20 nukleotidů, a přenese do příjemcových buněk určených pro klonováni, přednostně buněk E. coli, Bacillus subtilis nebo do streptokoků. Potom jsou selektovány rekotnbinantni klony.
Selekce probíhá buď
- hybridisaci in šitu podle Grunstein a Hogness /Proč. natn. Acad. Sci. USA 22/ 3961, 1975/ pomoci frakcionované polyA*-RNA z telecího žaludku, která obsahuje vysoce obohacenou translačně aktivní mRNA chymosinu, nebo
238 268
- hybridisaci in šitu nebo hybridisaci SNA - DNA pomoci chemicky syntetizovaných oligonukleotidů, které odpovídají části pro kódováni hovězího chymosinu, nebo
- technikami pro hybridisaci RNA - DNA /Alwine et al., Proč. natn. Acad. Sci„ USA Já/ 5350, 1977/.
Tyto techniky jsou vhodné k tomu, aby byly vybrány jednotlivé klony nebo rodiny klonů v jediném selekčním postupu /screening/. V kombinaci se specifickými translačními testy /např. hybridem zastavená translace, Paterson et al., Proč. natn. Acad. Sci. USA Z4, 4370 až 4374, 1977/ umožňuji specifický průkaz klonů chymosinu.
Postup klonování populací s jednovláknovými konci o různé délce aplikovaný na dvou vláknovou komplementární DNA /cDNA/j příp. vektorovou DNA vede k obohaceni dlouhých insertů DNA v re kombinantnich klonech ve srovnání s klonováním, které vychází z populací o podobné délce jednovláknových konců na dvouvláknové cDNAypřip. vektorové DNA /Patentový spis NDR č. 143 794/. Rekombinované plasmidy sestávají z pBR322-PstI-dGn; dvouvláknová cDNA chymosinu /částečná nebo kompletní specifická nukleotidová sekvence^ dC^.pBR 322 značí vektorovou molekulu plasmidu Pstl. je restrikčni místo v této molekule, k němuž je připojena jednovláknová sekvence deoxyguanolových nukleotidů, a dC značí obdobnou sekvenci deoxycytidolových nukleotidů.
Přesto je při klonováni velmi dlouhých molekul mRNA /např. v připadě chymosinu = RNA 12 «ή. 17S; ve srovnáni s globinovou nebo proinsuli novou mRNA = RNA 9S/ možné, že specifické kódováni je topotogicky rozloženo na více než jednom rekombinovaném plasmidu. Pomocí společných restrikčnich míst uvnitř insertů je možné podle stavu techniky jednoduchým způsobem sestavit příslušný rekombinantní plasmid, který nese kompletní kódující sekvenci pro prochymosin /pre-prochymosin/.
Použitý vektorový plasmid pBR322 je vhodný pro klonováni cizích DNA přednostně u E. coli. Specifické plasmidy rekombinantů pBR322 - chymosin - dvouvláknová cDNA mohou být však pozměněny /např. vložením odpovídající replikačné regulační nebo expresně regulační sekvence/, takže rekombinantní plasmidy mohou být použity i k účinnému klonováni u kmenů Bacillus subtili nebo streptokoků.
238 268
Rekombinantni klony získané tímto klónovacím postupem, které obsahují specifické kódování pro hovězí chymosin, mohou být využity v těchto oblastech:
- jako molekulární sonda a/ pro analytický, specifický průkaz nukleové kyseliny chymosinu jako dodatečně značené /nick-translation/ fragmenty DNA /DNA = specifický genový fragment chymosinu telete/.
Tam mohou být vybrány /vyloveny/ specifické sekvence z genomových bank /klonovaná genomová DNA/, z bank dvouvláknové cDNA /klonované směsi dvouvláknové cDNA/. ale rovněž z extraktů tkáni /genomová DNA nebo RNA/ nebo ze směsi cDNA hovězího původu. Vybrané pozitivní klony z příslušných bank lze potom obvyklým způsobem kultivovat.
b/ k preparativnímu obohacení /vylovení'7 nukleotidových sekvenci, které představuji genové fragmenty chymosinu, zvláště z tkáňových extraktů. Zde přichází v úvahu obvyklé metody afinitni chromatografiez např. s chromatografickým nosičem agarosového typu /Sepharosou/s navázanou DNA /DNA = specifický genový fragment chymosinu po klonování dvouvláknové cDNA/.
- jako specifická očka /priméry/ pro specifickou syntézu chymosinové cDNA na polyA+-mRNA, např. ze sliznice žaludku v různých fyziologických obdobích růstu zvířete. Přitom se používají částečné sekvence již klonované specifické chymosinové DNA v jednovláknové formě jako začátek replikace /očko, primér/ pro specifickou zpětnou transkripci.
- jako výchozí materiál ve vektoru exprese, takže se specifické kódováni dostává pod kontrolu účinného prokaryontniho regulačního elementu exprese. Tyto regulační elementy pocházejí buď z ranné oblasti fága T7 nebo T3jnebo např. z operonú pro laktosu, tryptophan, ale i z promotorů lambda nebo z hybridních regulačních elementů. Tímto způsobem je možno dosáhnout účinné transkripce a translace specifické chymosinové sekvence, kterou lze využít v technickém fermentačním postupu pro mikrobiální syntézu chymosinu.
Postup bude podrobněji vysvětlen na následujících příkladech, čímž ovšem není omezeno použiti vynálezu.
- 5 Příklady
Připrava dvouvláknové cDNA 238 268
Frakcionovaná polyA+-mRNA /frakce 12-17s; S = Swedbergova jednotka sedimentace/ ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třitýdennich telat je konvertována zpětnou transkriptásou z viru stači myeloblastosy /AMV/ v komplementární DNA /cDNA/ v objemu 1 ml reakční směsi/ která obsahuje 34 ^ug RNA, 10 ^ug oligo/dT/12_18, 50 mM Tria-HCl pH 8/2/ 50 mM KCl, 7,5 mM MgACg, 2 mM dithiotreitol /DTT/, 0,5 mM každého deoxynukleosid trifosfátu ZdNTP// odvozených od guninu /0/, cytosinu /C/z adeninu /A/ a thyminu /17 /G, C, A, 1/, 600 ^uCi ^H-dCTP a 30 jednotek zpětné transkriptásy AMV /Liebscher/. Během 2 hodin při 37 °C bylo transkribováno 0,91 ^ug cDNA /cca 2,8 % přepis/ resp. 850.000 cpm v cDNA.
Tento materiál slouží ihned /bez předchozí frakcionace/ k syntéze dvouvláknové cDNA pomoci specifické části enzymu DNA-polymerásy I z E. coli /složeni Klenowova fragmentu Boehringer/ v reakční směsi obsahující 1,5 ^ug/ml cDNAz 30 mM Tris-HCl pH 7/5/ 4 mM MgACg, 0,5 mM |3-mercaptoethanolz 0z5 mM každého dNTP /G, C, A, Τ/, 70 mM KCl a 62,5 jednotek enzymu/ml. Po 4 hodinách inkubace při 20 °C je směs zbavena bílkovin/ soli a dvouvláknové cDNA je preparativně ovlivněna nukleá sou S^z aby byly z materiálu odstraněny jednovláknové úseky DNA. V objemu 300 ^ul reakční směsi obsahující 0,15 ^ug/ml cDNA /radioaktivní označení c DNA slouží jako referenční hodnota// 70 mM acetátu sodného pH 4,5, 250 mM NaClz 2 mM ZnSO^ a 100 jednotek /ml nukleásy je po 10 minutách inkubace při °C ještě 60 % značené cDNAz to znamená, že 60 % cDNA je resistentní vůči nukleáse S^, resp. je přítomna v dvouvláknové formě. /V paralelním analytickém pokusu tato hodnota činila 75 % cDNA chymosinu, neovlivněná polymerásou, vykazovala pouze 16 % resistence vůči nukleáse Sp/
Po ovlivnění nukleásou byla dvouvláknové cDNA dělena a frakcionována v preparativním neutrálním lineárním hustotním gradientu sacharosy /5 až 20 % lineární gradient, 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 °C, 25.000 ot/min., Beckman Rotor SW41, 18 hod/. Frakce 10-14 /dlouhé molekuly/ a 15-20 /střední molekuly/ byly sebrány odděleně a dále použity. Globinová standardní 9S cDNA se nacházela v 23. frakci /vrcholová •frakce/ z celkového počtu 30 frakci. 238 268
Z údajů je vypočtena průměrná délka molekuly dvouvláknové cDNA odpovídající 600 párů baží /10. «<. 14. frakce/.
Vynálezu lze využít v potravinářském průmyslu, např. při výrobě sýrů, v živoěišné výrobě v krmivářství a ve veterinárním lékařství /přenos genu do organismu/.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU238 268Způsob klonování genů pro prochymosin hovězího původu získaný zpětnou transkripcí polyA+-mRNA - frakce se sedimentačním koeficientem 12 až 17S ze sliznice čtvrtého žaludku dvou až třítýdenních telat, vyznačený tím/ že se pomoci terminálni transferázy připojí k dvouvláknovým molekulám komplementární DNA jednovláknité homopolymerní konce o průměrné délce 35 až 200 nukleotidů a tyto se spojí s lineárním plasmidovým vektorem, který obsahuje po transferázové reakci rovněž homopolymerní jednovláknové, ale komplementární konce o průměrné délce 10 až 20 nukleotidů a přenesou do příjemcových buněk určených pro klonování, zejména buněk E. coliz Bacillus subtilis nebo Streptococcus, načež se provede selekce rekombinantních klonů.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS722283A CS238268B1 (cs) | 1983-10-03 | 1983-10-03 | Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS722283A CS238268B1 (cs) | 1983-10-03 | 1983-10-03 | Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS238268B1 true CS238268B1 (cs) | 1985-11-13 |
Family
ID=5420988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS722283A CS238268B1 (cs) | 1983-10-03 | 1983-10-03 | Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS238268B1 (cs) |
-
1983
- 1983-10-03 CS CS722283A patent/CS238268B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hickey et al. | Sequence and regulation of a gene encoding a human 89-kilodalton heat shock protein | |
| Watson | A new revision of the sequence of plasmid pBR322 | |
| Broglie et al. | Cloned DNA sequences complementary to mRNAs encoding precursors to the small subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase and a chlorophyll a/b binding polypeptide | |
| Chan et al. | Nucleotide sequence and gene organization of ColE1 DNA. | |
| Auer et al. | Organization and structure of the Methanococcus transcriptional unit homologous to the Escherichia coli “spectinomycin operon”: Implications for the evolutionary relationship of 70 S and 80 S ribosomes | |
| Hackett et al. | Localization of the hsp83 transcript within a 3292 nucleotide sequence from the 63B heat shock locus of D. melanogaster | |
| FI108796B (fi) | Menetelmä kädellisen granulosyytin/makrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä -proteiinin valmistamiseksi | |
| AU760224B2 (en) | Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFs), the proteins encoded, and uses thereof | |
| EP0189481B1 (en) | Insulin-like growth factor ii | |
| EP0020147B1 (en) | A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor | |
| JP3030417B2 (ja) | インビトロでのｄｎａの増幅、ゲノムクローニングおよびマッピングの、改良された方法 | |
| EP0067213A1 (en) | Method for cloning genes | |
| CS273152B2 (en) | Method of mature human leucocytic interferon production | |
| CN111511912A (zh) | 标记来自单个细胞的核酸分子以进行定相测序 | |
| JPH0321151B2 (cs) | ||
| Parsian et al. | The human Hsp70B gene at the HSPA7 locus of chromosome 1 is transcribed but non-functional | |
| EP0593580A4 (en) | Sequences characteristic of human gene transcription product | |
| US5169941A (en) | DNA sequences coding for the DR β-chain locus of the human lymphocyte antigen complex and polypeptides, diagnostic typing processes and products related thereto | |
| Agami et al. | Functional analysis of cis-acting DNA elements required for expression of the SL RNA gene in the parasitic protozoan Leishmania amazonensis | |
| Mastrangeli et al. | Cloning of murine LAG-3 by magnetic bead bound homologous probes and PCR (gene-capture PCR) | |
| JPH0783717B2 (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子 | |
| Willis et al. | Construction and identification by partial nucleotide sequence analysis of bovine casein and β-lactoglobulin cDNA clones | |
| Carroll | Introduction to recombinant-DNA technology | |
| JPS6361960B2 (cs) | ||
| CS238268B1 (cs) | Způsob klónování genů pro prochymosin hovězího původu |