CS237939B1

CS237939B1 - Hemoglobin infusion solution production

Info

Publication number: CS237939B1
Application number: CS996583A
Authority: CS
Inventors: Vaclava Fricova; Tomas I Pristoupil; Eduard Paluska; Marie Kramlova; Stanislav Ulrych
Original assignee: Vaclava Fricova; Tomas I Pristoupil; Eduard Paluska; Marie Kramlova; Stanislav Ulrych
Priority date: 1983-12-27
Filing date: 1983-12-27
Publication date: 1985-11-13

Description

Vynález se týká způsobu výroby netoxického hemoglobinového infúzního- roztoku přenášejícího kyslík.The invention relates to a process for the production of a non-toxic oxygen-carrying hemoglobin infusion solution.

Potřeba krve pro lékařské účely stále stoupá a její zdroje jsou omezené. Pro infúzní -protišokovou terapii za mimořádných okolností a při hromadných neštěstích je nutné vyvíjet vhodné roztoky, které by byly schopné krev nahradit. Zejména jde o náhradu ztraceného krevního objemu při těžkém krvácení a současně o přenos kyslíku tkáním a odstraňování oxidu uhličitého. Dosud komerčně vyráběné koloidní náhradní roztoky jsou schopny zajistit pouze náhradu a udržení krevního objemu, ale nejsou schopny přenášet kyslík ani oxid uhličitý.The need for blood for medical purposes continues to increase and its resources are limited. For infusion-anticancer therapy in extraordinary circumstances and in mass disasters, it is necessary to develop suitable solutions to replace the blood. In particular, it involves the replacement of lost blood volume during severe bleeding, and at the same time oxygen transfer by tissue and removal of carbon dioxide. Commercially available colloidal replacement solutions are only able to provide replacement and maintenance of blood volume, but are unable to transfer oxygen or carbon dioxide.

Protože hemoglobin i mimo krvinky si zachovává v jisté míře schopnost transportu těchto- plynů, orientoval se výzkum posledních let na využití prošlých lidských erytromas pro přípravu hemoglobinového infúzního roztoku.Since hemoglobin also retains the ability to transport these gases to some extent, research in recent years has focused on the use of expired human erythromasses for the preparation of a hemoglobin infusion solution.

Jak bylo zjištěno, intravenózně podaný volný hemoglobin dokonale zbavený stromat a jejich fragmentů (S. F. Rabiner asp., J. exp. Med., 126, 1 127 (1967), S. F. Rabiner, Fed. Proč. 34, 1 454 (1975), Τ. I. Přistoupil,It has been found that intravenously administered free hemoglobin free of stroma and fragments thereof (SF Rabiner asp., J. exp. Med., 126, 1 127 (1967), SF Rabiner, Fed. Proc. 34, 1454 (1975), I. I acceded,

S. Ulryctl AO 154 000) Je i ve velkém množství snášen příjemcem bez toxických prízna237939 ků. Ve srovnání s hemoglobinem uzavřeným v- krvince má tento destromatizovaný hemoglobin větší afinitu ke kyslíku, snáze disociuje na diméry, které se rychle vylučují z krevního- řečiště (poločas T/2 = 1,5 až 2 hod.) a postupně se při skladování nezvratně oxiduje na methemogl-ohin, který není schopen vázat molekulární kyslík.S. Ulryctl AO 154,000) It is tolerated in large quantities by the recipient without toxic symptoms. Compared to hemoglobin encapsulated in blood cells, this destromatized hemoglobin has a greater affinity for oxygen, easier dissociation into dimers that are rapidly cleared from the bloodstream (half-life T / 2 = 1.5 to 2 hours) and gradually irreversibly stored upon storage oxidizes to methemogl-ohin, which is unable to bind molecular oxygen.

Tyto negativní vlastnosti hemolyzátu byly v průběhu let postupnými modifikacemi odstraňovány. Navázáním pyridoxal-5-fosfátu na molekulu hemoglobinu snížil Ben-esch a sp. (Binochemistry 11, 3 576 (1972) afinitu hemoglobinu ke kyslíku, a tím podstatně zvýšil přenos kyslíku tkáním. Pyridoxalfosfátem modifikovaný hemoglobin však má rovněž nízký intravaskulární poločas (T/2 = = 5 h.) Aby se hodnota T/2 dále zvýšila, modifikovala řada autorů hemoglohln-pyridoxalfosfát různými dialdehydy (např. glutaraldehydem) za tvorby heterogenní směsi konjugátů a polymerů. U takt-o modifikovaných a polymerovaných hemoglobinů se příznivě prodloužil poločas vylučování z krevního řečiště, avšak za cenu určitéhosnížení -schopnosti přenosu kyslíku.These negative properties of hemolysate have been eliminated over the years by gradual modifications. By binding pyridoxal-5-phosphate to the hemoglobin molecule, Ben-esch et al. (Binochemistry 11, 3576 (1972)) the affinity of hemoglobin to oxygen and thereby substantially increased oxygen transfer by tissue. However, the pyridoxal phosphate-modified hemoglobin also has a low intravascular half-life (T / 2 = 5 h). Modified hemoglohine-pyridoxalphosphate by various dialdehydes (e.g. glutaraldehyde) to form a heterogeneous mixture of conjugates and polymers.

Jiné varianty hemoglobinových infúzních roztoků se zakládaly na příměsi makromolekulárních látek, které se používají jako náhražka za plasmu, .na-př. želatina, dextran, sérový albumin apoid. Bylo zjištěno, že přítomnost těchto makromolekulámícih roztoků má příznivý vliv na viskozitu, vaskulární retenci, stabilitu výsledných hemoglobinových preparátů i na jejich lepší snášenlivost v organismu příjemce.Other variants of hemoglobin infusion solutions have been based on admixtures of macromolecular substances which are used as a plasma substitute, e.g. gelatin, dextran, serum albumin apoid. The presence of these macromolecular solutions has been found to have a beneficial effect on viscosity, vascular retention, stability of the resulting hemoglobin preparations, and on their better tolerability in the recipient organism.

Dalším krokem byla tvorba kopolyméru, resp. kondenzátů hemoglobinu s těmito látkami. Někteří autoři (K. Bonhard a sp. Patent 2 449 885, 1979 NSR, A. A. Clhačaturjan a sp. Perenosčiki kisloroda str. 83, 1979 MZ SSSR) polymerovali hemoglobin se sérovým albuminem pomocí různých dialdehydů. Modifikace hemoglobinu a navázání dalších makromolekul se prováděla v několika postupných etapách trvajících až tři týdny, čímž značně stoupá riziko kontaminace, oxidace apod. Výsledné konjugované preparáty měly podle autorů vylučovací poločas 5 až 10 hodin a Pso podobné jako nativní hemoglobin.The next step was the formation of copolymer, respectively. hemoglobin condensates with these substances. Some authors (K. Bonhard et al., Patent 2,449,885, 1979 NSR, A.A. Clhačaturjan and sp. Perenoschiki kisloroda p. 83, 1979 MZ USSR) polymerized hemoglobin with serum albumin using various dialdehydes. Modification of hemoglobin and binding of other macromolecules was carried out in several successive stages lasting up to three weeks, significantly increasing the risk of contamination, oxidation, etc. The resulting conjugated preparations, according to the authors, had an elimination half-life of 5 to 10 hours and Pso similar to native hemoglobin.

Koncentrace hemoglobinu se pohybovala od 6 % do 15 % a průměrná molekulová hmotnost většiny preparátů od 200 000 do 600 000. Tím stoupá riziko nepříznivých reakcí organismu příjemce, riziko blokády ,retikulO' endoteliálního systému apod. Někteří autoři proto preparát ještě dodatečně frakcionovali např. síranem amonným, aby se odstranily složky o vysokých molekulových hmotnostech. To přinášelo další technické komplikace (dialysa síranu), ztráty a rizika.The hemoglobin concentration ranged from 6% to 15% and the average molecular weight of most preparations ranged from 200,000 to 600,000. This increases the risk of adverse reactions of the recipient organism, the risk of blockage, reticulum of the endothelial system, etc. ammonium to remove high molecular weight components. This brought further technical complications (sulfate dialysis), losses and risks.

Autoři tohoto vynálezu vycházeli z uvedených poznatků z literatury i z vlastních zkušeností a vypracovali nový způsob přípravy pozměněného hemoglobinu, který se od dosavadních preparátů odlišuje v těchto bodech:The present inventors, based on the above-mentioned knowledge from the literature and from their own experience, have developed a new method for the preparation of altered hemoglobin which differs from the prior art in the following points:

1. Reakce hemoglobinu s pyridoxal-5-fosfátem v anaerobním prostředí neprobíhá samostatně, ale za přítomnosti sérového albuminu. Tento postup umožňuje použít při následující kondenzační, resp. polymerizační reakci dvakrát nižší koncentraci glutaraldehydu než při pyridoxalaci samotného hemoglobinu (pro polymeraci pyridoxalovaného hemoglobinu je zapotřebí 25 mg až 30 mg glutaraldehydu na l g hemoglobinu, u nás pouze 15 mg glutaraldehydu na 1 g hemoglobinu).1. The reaction of hemoglobin with pyridoxal-5-phosphate in an anaerobic environment does not occur alone but in the presence of serum albumin. This procedure allows the use of the following condensation, respectively. polymerization reaction two times lower concentration of glutaraldehyde than pyridoxalation of hemoglobin alone (for polymerization of pyridoxalized hemoglobin 25 mg to 30 mg of glutaraldehyde per 1 g of hemoglobin is needed, in our country only 15 mg of glutaraldehyde per 1 g of hemoglobin).

2. Vzniklý produkt pak obsahuje kondenzáty a polymery o nižší průměrné molekulové hmotnosti (45 000 až 200 000), tím odpadá nutnost dodatečné frakcionace a při intravenózní aplikaci lze očekávat menší zatížení organismu příjemce.2. The resulting product then contains condensates and polymers of lower average molecular weight (45,000 to 200,000), thus eliminating the need for additional fractionation and less intravenous loading of the recipient organism.

3. Celá příprava infůzního roztoku podle tohoto vynálezu probíhá při hodnotě pH blízké neutrální oblasti v 0,1 M tris-(hydroxymethylj-aminometihanu v destilované vodě, upraveném koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,5; na rozdíl od alkalických borátových pufrů o hodnotě pH 9, používaných jinými autory; při teplotě 4 °C celíkem 20 hodin.3. The entire preparation of the infusion solution according to the invention is carried out at a pH close to the neutral zone in 0.1 M tris- (hydroxymethyl) aminomethanate in distilled water, adjusted to pH 7.5 with concentrated hydrochloric acid, in contrast to alkaline borate buffers of pH 9 used by other authors at 4 ° C for 20 hours.

4. Reakce s glutaraldehydem je ukončena přidáním roztoku borohydridu, který zredukuje jatk nezreagované aldehydy, tak i methemoglobin a současně zpevní Schiffovy báze za tvorby kovaleintních —CHa— můstků. Není třeba přidávat lysin a podobné látky používané dřívějšími autory.4. The reaction with glutaraldehyde is terminated by the addition of a borohydride solution, which reduces the slaughter of unreacted aldehydes as well as methemoglobin and at the same time solidifies the Schiff's bases to form covalintine —CH-bridges. There is no need to add lysine and similar substances used by earlier authors.

5. Nežádoucí nízkomolekulární příměsi použité či vzniklé během reakce se odstraňují v závěrečné fázi přípravy gelovou chromatografií, přičemž se preparát současně převádí do 'polyiontového roztoku vhodného pro biologickou aplikaci.5. Undesirable low molecular weight impurities used or formed during the reaction are removed at the final stage of the preparation by gel chromatography, while the preparation is simultaneously transferred to a polyionic solution suitable for biological application.

6. Preparát je dlouhodobě skladovatelný buď ve zmraženém stavu, nebo v suchém stavu po lyofilizaci se sacharózou (vynález přihlášen pod číslem 222-83), je dobře a rychle rozpustný bez závažnějších změn původních vlastností.6. The preparation can be stored for a long time either in a frozen state or in a dry state after freeze-drying with sucrose (invention filed under No. 222-83), it is well and rapidly soluble without significant changes in the original properties.

Podle provedených měření má konečný produkt tyto základní vlastnosti:According to the measurements made, the final product has the following basic characteristics:

Koncentrace hemoglobinu: 60 g až 70 g/1, z toho 85 až 90 °/o oxyhemoglobin, 10 až 11 procent methemoglobiu.Hemoglobin concentration: 60 g to 70 g / l, of which 85 to 90% oxyhemoglobin, 10 to 11 percent methemoglobin.

Jde o značně heterogenní směs asi 10 až 20 '% nepozměněných hemoglobinových frakcí, hlavní podíl tvoří pyridoxalované deriváty hemoglobinu a jejich inter- a intramolekulární konjugáty. Tato směs má při standardních preparačních podmínkách repirodukovatelné vlastnosti a složení (podle analýzy izoelektrickou fokusací, chromatofokusací, rychlou kapalinovou chromatografií bílkovin a elektroforézou na polyakrylamidovém gelu).It is a highly heterogeneous mixture of about 10-20% of unchanged hemoglobin fractions, the major part being pyridoxalized hemoglobin derivatives and their inter- and intramolecular conjugates. This mixture has, under standard preparation conditions, reproducible properties and composition (as determined by isoelectric focusing, chromatofocusing, fast liquid chromatography of proteins, and polyacrylamide gel electrophoresis).

Molekulová hmotnost subfralkcí se pohybuje mezi 45 000 až 200 000 s jedním maximem při 65 000 a určitou asymetrií distribuční křivky směrem k vyšším molekulárním hmotnostem.The molecular weight of the subfractions is between 45,000 to 200,000 with one maximum at 65,000 and some asymmetry of the distribution curve towards higher molecular weights.

Podíl nehemoglobinových bílkovin cca 10 %. Celková bílkovina (hemoglobin -j- albumin) g až 77 g/1, pH 7,4.The proportion of non-hemoglobin proteins is about 10%. Total protein (hemoglobin -? - albumin) g to 77 g / l, pH 7.4.

Viskozite rel. (při 20 °C pH 7,4) = 1,5. Onkotický tlak izoonkotický s plasmou.Viscosity rel. (at 20 ° C pH 7.4) = 1.5. Oncotic pressure isooncotic with plasma.

P 50 (37 °C, pH 7,4) = 15 až 18 mm Hg (2 až 2,4 kPa).P 50 (37 ° C, pH 7.4) = 15 to 18 mm Hg (2 to 2.4 kPa).

Hillův koeficient n = 2,1.Hill coefficient n = 2.1.

Polyiontové složení: Krebs-Henseleitův podobný roztok podle potřeby.Polyionic composition: Krebs-Henseleite-like solution as needed.

Při testu akutní toxicity na myších a krysách je preparát netoxický. Krysy přežívají v dobrém stavu výměnou transfúzi, při níž se vymění až 95 % vlastní krve za roztok hemoglobinu podle vynálezu. To svědčí jednak o dostatečném transportu kyslíku prostřednictvím použitého infůzního roztoku, jednak o dostatečné ventilaci oxidu uhličitého. Orientační pokusy in vitro na izolovaných orgánech krys — srdce, plíce, mozek, játra — rovněž svědčí o tom, že uvedený preparát nepoškozuje tyto orgány a má pří237839 znivý efekt přenosu kyslíku a ventilace oxidu uhličitého.In the acute toxicity test in mice and rats, the preparation is non-toxic. Rats survive in good condition by exchanging a transfusion in which up to 95% of their own blood is exchanged for the hemoglobin solution of the invention. This indicates, on the one hand, sufficient oxygen transport by the infusion solution used and, on the other hand, sufficient ventilation of carbon dioxide. In vitro orientation experiments on isolated rat organs - heart, lung, brain, liver - also indicate that the preparation does not damage these organs and has a noticeable effect of oxygen transfer and carbon dioxide ventilation.

V tomto směru jsou nejprůikaznější výsledky na izolovaném srdci, kde bylo zjištěno, že kontrakční síla srdce promývamého hemoglohinovým roztokem podle vynálezu při nízkém parciálním tlaku kyslíku 13 až 19 kPa je prakticky stejná jako v solném roztoku 's parciálním tlakem kyslíku 85 kPa.In this regard, the most significant results on an isolated heart were found to have been found to have a contraction force of the heart washed with the hemoglohine solution of the invention at a low oxygen partial pressure of 13 to 19 kPa, practically the same as in saline with an oxygen partial pressure of 85 kPa.

Předmět vynálezu je doložen v následujícím příkladu, aniž by však byl tímto příkladem omezován.The subject matter of the invention is illustrated in the following example, without being limited thereto.

PříkladExample

Roztok 100 ml destromatizovaného a deoxygenovanébo hemolyzátu z lidské erytromasy podle čs. AO 154 000 obsahující 10 g hemoglobinu a méně než 0,3 g methemogloblnu se v uzavřené skleněné aparatuře smíchá se 4,4 ml tris-[ hydroxymethy] J-aminomethanu koncentrace 121 g/1 upraveného koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,5, a hodnota pH reakční směsi se upraví vodným roztokem hydroxidu sodného· koncentrace 100 g/1 na hodnotu pPI 7,2 až 7,7, s výhodou na pH 7,5.A solution of 100 ml of destromatized and deoxygenated or hemolysate from human erythromassin according to Art. AO 154,000 containing 10 g of hemoglobin and less than 0.3 g of methemoglobin is mixed in a closed glass apparatus with 4.4 ml of 121 g / l tris- [hydroxymethy] J-aminomethane adjusted to pH 7.5 with concentrated hydrochloric acid, and the pH of the reaction mixture is adjusted with an aqueous sodium hydroxide solution of 100 g / l to a pH of 7.2 to 7.7, preferably to a pH of 7.5.

Ve směsi hemolyzátu a pufru se rozpustí 100 mg pyridoxal-5-fosfátu a 1 g sušeného· lidského albuminu za chlazení na 4 ^CC a intenzivního míchání na elektromagnetické míchačce. Po rozpuštění se aparatura 35 minut udržuje při podtlaku 0,8 až 1,06 kPa a reakce se nechá probíhat po 4 hodiny pod100 mg of pyridoxal-5-phosphate and 1 g of dried human albumin are dissolved in the hemolysate-buffer mixture with cooling to 4 ^° C and vigorous stirring on an electromagnetic stirrer. After dissolution, the apparatus is maintained at a vacuum of 0.8 to 1.06 kPa for 35 minutes and the reaction is allowed to proceed for 4 hours under

S proudem dusíku. Do reakční směsi se potom přidá v průběhu 5 minut roztok glutaraldehydu, deoxygenovaný proudem dusíku po· dobu 30 minut, do konečné koncentrace 15 miligramů glutaraldehydu na 1 g hemoglobinu, s výhodou v roztoku o koncentraci 10 g glutaraldehydu na litr 0,1 M tris-(hydroxymeťhylj-aminomethanu, tj. 12,1 g/1 upraveném koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 7,5.With a stream of nitrogen. A solution of glutaraldehyde, deoxygenated with a nitrogen stream for 30 minutes, is then added over a period of 5 minutes to a final concentration of 15 milligrams of glutaraldehyde per g of hemoglobin, preferably in a solution of 10 g glutaraldehyde per liter of 0.1 M tris- (hydroxymethyl) -aminomethane, i.e. 12.1 g / L adjusted to pH 7.5 with concentrated hydrochloric acid.

Reakce s glutaraldehydem se nechá nejprve probíhat 60 minut pod proudem dusíku za intenzivního míchání a chlazení a potom bez míchání ještě 17 až 18 hodin při teplotě 1 až 10 ^O,C, s výhodou při 4 °C, v uzavřené nádobě pod dusíkem. Po uvedené době se aparatura opět evakuuje 30 minut a dalších 60 minut se přivádí dusík. Pak se do reakční siměsi přidá 50 až 300 mg borohydridu sodného, s výhodou 200 mg v 8 ml 0,001 N NaOH — hydroxidu sodného, a ponechá se bez mechanického míchání 18 až 20 hodin v lednici, s výhodou při 4 ^CC.The reaction with glutaraldehyde is first allowed to proceed 60 minutes under a stream of nitrogen with vigorous stirring and cooling, then without agitation for 17 to 18 hours at a temperature of ^about 1-10 ^C, preferably at 4 ° C in a closed vessel under nitrogen. After this time, the apparatus is again evacuated for 30 minutes and nitrogen is supplied for a further 60 minutes. 50-300 mg of sodium borohydride, preferably 200 mg in 8 ml of 0.001 N NaOH-sodium hydroxide are then added to the reaction mixture and left in the refrigerator, preferably at 4 ^DEG C., for 18 to 20 hours without mechanical stirring.

Hotový preparát se zbaví nežádoucích nízkoraolefculárních příměsí gelovou filtrací na sloupci Sephadexu G 25 a současně se tak převede do ipolyiontového roztoku vhodného pro biologickou aplikaci, např. Krebs-Henseleitův roztok, Ringer-laktát apod.The finished preparation is freed of undesirable low-olefular admixtures by gel filtration on a Sephadex G 25 column and at the same time transferred to an ipolyionic solution suitable for biological application, eg Krebs-Henseleit solution, Ringer-lactate and the like.

Hotový preparát se sterilně filtruje, rozplňuje do sterilních NTS lahví a uchovává se ve zmrzlém stavu nebo se lyofilizuje za přítomnosti sacharózy a provede se jeho analytická a biologická kontrola.The finished preparation is sterile filtered, filled into sterile NTN bottles and stored frozen or lyophilized in the presence of sucrose and analyzed and biological checked.

Claims

A process for the manufacture of a hemoglobin solution for infusion from a destromatized hemolysate of human or animal erythromase, by modifying pyridoxal-5-phosphate in the presence of serum albumin or without serum albumin, followed by polymerization of gluitaraldehyde, characterized in up to 150 g per liter with an irreversible primase 3 g to 5 g methemogiobine dissolve pyridoxSl-5-phosphate to a final concentration of 0.5 g to 1.5 g per liter and, when a serum album is added, to a final concentration of 50 mg to 500 mg per 1 g hemoglobin at pH 7.2 to 7.7 under a stream of nitrogen with stirring and cooling at 1 to 8 ° C for 2 to 6 hours, then a glutaraldehyde solution is added to a final concentration of 15 mg to 25 mg per 1 g hemoglobin; reaction was allowed to proceed at 1-10 ^r C for 1 to 20 hours, further added 0.5 g to 30 g of potassium or sodium boroihydridu per liter of reaction mixture and after the disappearance of foams, the resulting preparation is further processed in known manner.