CS231398B1 - Způsob přípravy kyseliny D-glukuronové značené radioisotopen 1Ζ*Ό nebo stabilním isotopem - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisotopem 1Ζ|Ό nebo stabilním isotopem ^C. Podstata navrženého řešení spočívá v tom, že příslušným isotopem značený -D-glukan, isolovaný s výhodou z fotoautotrofních organismů nebo/a methyl- -«/-D-glukopyranosid se oxidují na odpovídající 6-karboxyderiváty, které se hydrolysují kyselinou trifluoroctovou, Γ a výhodou o 25 až 45 % koncentraci.

Description

c 07 C 59/105

Způsob přípravy kyseliny D-glukuronové značené radioisotopen ^1Ζ*Ό nebo stabilním isotopem

Vynález se týká způsobu přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisotopem ^1Ζ|Ό nebo stabilním isotopem ^C.

Podstata navrženého řešení spočívá v tom, že příslušným isotopem značený

-D-glukan, isolovaný s výhodou z fotoautotrofních organismů nebo/a methyl-«/-D-glukopyranosid se oxidují na odpovídající 6-karboxyderiváty, které se hydrolysují kyselinou trifluoroctovou,

Γ a výhodou o 25 až 45 % koncentraci.

251 598

231 398

Vynález řeší způsob přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisotopem nebo stabilním isotopem

Kyselina D-glukuronová je po biochemické i fysiologické stránce velmi důležitá přírodní látka. Ve formě značené isotopy uhlíku ^1ζ*Ό nebo C je efektivně využitelná při studiu metabolismů, zejména při sledování vylučování pro organismus nežádoucích látek a při lékařské diagnostice metabolických poruch, nebo při sledování metabolismu pólysacharidů, zejména pocházejících z buněčných stěn mikroorganismů.

Přírodním zdrojem kyseliny D-glukuronové jsou polysacharidy a proteiny, ze kterých jí lze získat, poměrně s obtížemi, hydrolysou /Staněk J., Černý Μ., Kocourek J., Pacák J.: Monosacharidy, NČSAV, Praha 1960, s. 409/· K synthetické přípravě kyseliny D-glukuronové se využívá oxidace primární hydroxylové skupiny v molekule D-glukosy, přičemž je současně třeba chránit jiná, oxidace schopná místa v molekule, především anomerní hydroxylovou skupinu, případně i sekundární hydroxylové skupiny, zejména v polohách C-2 a C-4.

Vhodnými výchozími deriváty D-glukosy jsou D-glukosidy, především methyl-o(-D-glukopyranosid /Patentové spisy USA 2 592 249 a 2 592 266, Britský patentový spis 670 929/ a různé acetaly /Japonské patentové spisy 376/52 a 6282/53 /· Podmínku současného chránění hydroxylových skupin v polohách C-1 a C-4 splňují polysacharidy obsahující L-glukosu, které jsou rovněž využívány k přípravě kyseliny D-glukuronové, jako škrob /Japonské patentové spisy 6321/58 a 179 069, Patentový spis USA 2 472 590/ a celulosa /McGee P.A., Fowler W.F., Unruh C.C., Kenyon W.O.: J. Amer. Chem. Soc. 20, 2700 /1948/ /.

231 398

- 2 Jako oxidační činidla se používají /viz též shora citované patentové spisy/ kyslík nebo vzduch /Heyns Κ., Heinemann R.: Ann. 558, 187 /1947/ /, manganistan draselný /Stacey M.: J. Chem. Soc. 1939, 1529/, plynný nebo kapalný oxid dusičitý /Kerr R.W.: J. Amer· Chem. Soc. 72«

816 /1950/ /, kyselina dusičná /Heyns Κ., Graefe G.: Chem. Ber. 86,

646 /1953/ /, halogeny /Farley F.F., Hixon R.M,: Ind. Eng· Chem· 34«

677 /1942/ /, případněji jiná, méně významná.

Kyselina D-glukuronová se po oxidaci z příslušných 6-karboxylových derivátů uvolňuje hydrolytickou cestou použitím minerálních kyselin /sírové, chlorovodíkové/, organických kyselin /mravenčí, octové/ nebo enzymově /vždy viz už výše uvedené citace/. Právě tento stupeň přípravy kyseliny D-glukuronové je zdrojem největších problémů, především^ při použití polysacharidů jako výchozích látek. Výtěžky Isyseliny D-glukuronové se v důsledku obtížné hydrolysy snižují do té míry, že obvykle nedosahují ani 10 % /viz např. shora citované patentové spisy/.

Za podmínek, kdy teprve dochází k hydrolyse, nastává již i značný rozklad kyseliny D-glukuronové a to zejména při použití minerálních kyselin /Heyns Κ., Graefe G.: Chem. Ber. 86, 646 /1953/, Staněk J., Černý Μ., Kocourek J., Pacák J.: Monosacharidy, NČSAV, Praha 1960, s. 413/. Použití mírnějších činidel je zase málo účinné a probíhá s nízkými výtěžky /Hardegger E., Spitz D.: Helv. Chim. Acta 32, 2165 /1949/, jako je tomu u kyseliny mravenčí nebo enzymové hydrolysy amylázovými nebo diastázovými preparáty /Kerr L.M.H., Graham A.F.,

Levvy G.A.: Biochem. J. 42, 191/1948/ /. S podobnými obtížemi se setkává i způsob přípravy kyseliny D-/U-^^C/-glukuronové /Bílik V., Zemek J., Tihlárik Κ., Sandtnerová R.: PV 6160-79/, používající zmíněnou hydrolysu kyselinou mravenčí.

Při přípravě značené kyseliny D-glukuronové, kdy se jedná navíc . o práci s množstvím výchozí látky cca 10 krát nižším, než je obvyklé při práci s neradioaktivním materiálem v laboratorních podmínkách, vedou obvyklé způsoby hydrolysy jak kyselin polyglukuronových, tak i uronosidů k dalšímu snížení výtěžků.

Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisotopem nebo stabilním isotopem ^^C jehož podstata spočívá v tom, že příslušným isotopem značený o(-D-glukan, isolovaný s výhodou z fotoautotrofních organismů nebo/a methyl-o(-D-glukopyranosid se oxidují na odpovídající 6-karboxyderiváty, které se hydrolysují kyselinou trifluoroctovou, s výhodou o 25 až 45% koncentraci.

- 3 231 398

Hydrolysa se provádí za normálního tlaku, výhodně při teplotách až 100 ^dC po dobu 12 až 22 hodin.

Hydrolysu je též možno provádět v uzavřeném systému /tj. při zvýšeném tlaku/, s výhodou při teplotách 90 až 120 po dobu 8 až hodin.

Výhoda tohoto způsobu přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisotopem nebo stabilním isotopem spočívá v použití kyseliny trifluoroctové k hydrolyse meziproduktů, vznikajících oxidací značeného aL-D-glukanu nebo me thyl-ď-D-glukopyr ano sidu výhodně kapalným oxidem dusičitým. Takto prováděná hydrolysa , - probíhá snadněji, za mírnějších podmínek a dochází k menším ztrátám rozkladem produktu než při použití minerálních kyselin,

- probíhá snadněji, úplněji a bez nutnosti dodatečné hydrolysy esterů, Vznikajících jako vedlejší produkty než při použití jiných organických kyselin,

- probíhá úplněji a rychleji, než při enzymové hydrolyse,

- umožňuje odstranění hydrolysujíčího činidla pouhým vakuovým odpařením,

- vede k vyšším výtěžkům produktu.

Způsob podle vynálezu je blíže objasněn v následujících příkladech provedení.

Příklad 1 oí-D-/U-^^C/-Glukan /370 MBq/, isolovaný z řasy Chlore 11a vulgaris

Beijerinck, se vysuší vymrazením in vacuo a při teplotě 0 ^cC se převrství 5 ml kapalného oxidu dusičitého. Reakční směs se nechá stát při teplotě 0 až 5 °C po dobu 120 hodin. Oxid dusičitý se vakuově odstraní a oxidovaný produkt se hydrolysuje 40% kyselinou trifluoroctovou /8 ml/ za varu pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin.

Vzniklý roztok se vakuově odpaří k suchu, odparek rozpustí ve vhodném objemu vody a kyselina D-ZU-^^CZ-glukuronová jednak volná, jednak ve formě laktonu, se kterým vytváří rovnovážné směsi, se isoluje preparativní papírovou chromatografli na papíře Whatman 3 v soustavě n-butanol - ethanol - voda /4:1:1/.

Radiochemický výtěžek kyseliny D-/U-^^C/-glukuronové /včetně laktonu/ 95 MBq, tj. 26 %.

Příklad 2

231 398 o(-D-/U-^^C/-Glukan /88 MBq/, isolovaný z řasy Chlore 11a vulgaris Beijerinck, se vysuší vymrazením in vacuo a při teplotě O °C se převrství 2 ml kapalného oxidu dusičitého. Reakční směs se nechá stát při teplotě 0 až 5 °G po dobu 80 hodin. Oxid dusičitý se vakuově odstraní a oxidovaný produkt se hydrolysuje 25% kyselinou trifluoroctovou /4 ml/ v autoklávu pži teplotě 115 až 120 po dobu 9 hodin. Reakční směs se dále zpracuje a produkt isoluje jak je uvedeno v příkladu 1.

Radiochemický výtěžek kyseliny D-/U-^^C/-glukuronové /včetně laktonu/ 15,8 MBq, tj. 18 %.

Příklad 3

Methyl-oC-D-glukopyranosid /10 mg/ se přidá ke 2 ml vodného roztoku methyl-o-D-/U-¹4c/-glukopyranosidu /60 MBq/, roztok se vakuově odpaří k suchu a vysuší vymrazením. Odparek se převrství 4 ml kapalného oxidu dusičitého při teplotě 0 až 5 °C a nechá při téže teplotě stát po dobu 100 hodin. Oxid dusičitý se vakuově odstraní a oxidovaný produkt se hydrolysuje 45% kyselinou trifluoroctovou /4,5 ml/ v zatavené skleněné ampuli při 95 až 100 °C po dobu 8 hodin. Reakční směs se dále zpracuje a produkt isoluje jak je uvedeno v příkladu 1.

Radiochemický výtěžek kyseliny D-ZU-^cAglukuronové /včetně laktonu/ 27 MBq, tj. 45 %·

Příklad 4

Methyl-o(-D-/U-^^C/-glukopyranosid /203 MBq/ se vysuší vymrazením in vacuo a při teplotě O ‘O se převrství 3 ml kapalného oxidu dusičitého. Reakční směs se nechá při teplotě O až 5°C stát po dobu 124 hodin. Oxid dusičitý se vakuově odstraní a Oxidovaný produkt se hydrolysuje 35% kyselinou trifluoroctovou /5 ml/ za varu pod zpětným chladičem po dobu 6 hodin a poté po přídavku dalších 3 ml 35% kyseliny trifluoroctové ještě 8 hodin. Reakční směs se dále zpracuje a produkt isoluje jak je uvedeno v příkladu 1.

Radiochemický výtěžek kyseliny D-/U-^^C/-glukuronové /včetně laktonu/ 71 MBq, tj. 35 %·

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (3)

1. Způsob přípravy kyseliny D-glukuronové, značené radioisoto14 11 pem C nebo stabilním isotopem C vyznačený tím, že příslušným isotopem značený d-D-glukan, isolovaný s výhodou z fotoautotrofních organismů nebo/a methyl-oÉ-D-glukopyranosid se oxidují na odpovídající 6-karboxyderiváty, které se hydrolysují kyselinou trifluoroctovou, s výhodou o 25 až 45% « koncentraci· ¹

2· Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že hydrolysa se provádí za normálního tlaku, výhodně při teplotách 80 až 100 °C po dobu 12 až 22 hodin.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že hydrolysa se provádí v uzavřeném systému, s výhodou při teplotách 90 až 120 ⁰C po dobu 8 až 14 hodin.