CS227561B1

CS227561B1 - Method of indentifying microorganisms by chromatography

Info

Publication number: CS227561B1
Application number: CS417282A
Authority: CS
Inventors: Jiri Rndr Csc Haeusler; Vladimir Rndr Richter
Original assignee: Jiri Rndr Csc Haeusler; Vladimir Rndr Richter
Priority date: 1982-06-04
Filing date: 1982-06-04
Publication date: 1984-04-16
Also published as: GB2121434A; FR2528071A1; GB2121434B; GB8306380D0; CH659257A5; FR2528071B1; JPS58212798A; DE3306689A1

Description

Dosud obvyklý způsob identifikace mikroorganismů je založen na sledování jejich morfologie? kých, kultivačních, fyziologických a biochemických, po případě serologických a jiných vlastností. V případě bakterií a jim podobných mikroorganismů, které jsou morfologicky těžko rozeznatelné se při jejich identifikaci klade hlavní důraz na stanovení jejich fyziologických a biochemických vlastností na čisté kultuře organismu. Tento proces je zdlouhavý, obvykle trvá déle, než jeden týden a personálně i pracovně je náročný. K přesnému určení podle současných světových zvyklostí je potom zapotřebí provádět až 70 testů na různých kultivačních médiích. ·

Tyto nevýhody vyvolaly snahu využít k řešení dané problematiky moderních analytických přístrojů. Byly činěny pokusy o rozlišení dvou nebo několika kmenů jedné skupiny mikroorganismů, případně o hrubé rozlišení vzájemně nepříbuzných skupin mikroorganismů. Systematické zpracování ' celé čeledě, její odlišení od jiných podobných čeledí, vzájemné rozlišení jednotlivých rodů, druhů a zároveň i nižších taxonů uvnitř této čeledě však nebylo dosud provedeno. Stanovení mikroorganismů pomocí pyrolysy je velmi náročné z hlediska reprodukovatelnosti a interpretace získaných výsledků. Z dosavadních známých způsobů identifikace se způsobu identifikace podle vynálezu blíží způsob podle amerického patentu č. 3,891,508 (J. Merrick), podle kterého se stanovením blíže nespecifikovaných sacharidů, obsažených v lipopolysacharidech buněčných stěn mikroorganismů od sebe rozlišují některé skupiny gram negativních bakterií. Způsobem uvedeným v popisu amerického patentu lze . stanovit tyto skupiny mikroorganismů:

1. Střevní enterobakterie

2. Pseudomonas

3. Vibrio

4. Hemophilus

5. Bordetella

6. Pasteurella

7. Brucella

8. Neisseria

Pro každou z uvedených skupin ' však autor v popisu požaduje použít jiné kultivační médium což v praxi znamená, že je nutné v daném vzorku předem hrubě klasifikovat, o jakou z výše uvedených . skupin se jedná. Podle tohoto postupu by také bylo obtížné stanovit více mikroorganismů vedle sebe a provit jejich podrotoou ktastfikací až na jednotlivé druhy, popřípadě serotypy.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se čistá

Ί · ' kultura mikroorganismu kultivuje za konstantních .| podmínek až do dosažení stacionární fáze růstu, získaná biomasa se oddělí centrifugací, promyje,; vysuší a získaný vzorek se hydrolyzuje např. v kyselém prostředí chlorovodíkem, popřípadě esterifikuje např. methylátem sodným a poextrak, ci se ícfromatograficky stanoví vzniklé organické = i kyseliny ^: nebo jejich estery a získané výsledky ΐ stanovení se porovnají s výsledky získanými u stan- | dartních kmenů mikroorganismů.

Tento postup využívá jevu, že jak pro každou i taxonomickou skupinu mikroorganismů, tak i pro nižší taxony, jako je druh, popřípadě serotyp, je , charakteristický určitý výskyt a vzájemný . poměr : I organických kyselin, obsažených přímo v buňce J ' mikroorganismu. Jedná se hlavně o hydroxykyseli-1 ny, kyseliny s cyklopropanovým kruhem, nasycené ' mastné . kyseliny a nenasycené mastné kyseliny. Stanovení lze rozšířit i na další typy organických ! kyselin, např. ketokyseliny, kyseliny s . více karboxylovými a hydroxylovými skupinami a aminokyseliny. Získané výsledky chromatografického stanovení tvoří charakteristický obraz, anglicky fin- ; I. gerprint, který je typický pro ' určitý mikroorganisi mus, při čemž vzhledem k reprodukovatelnosti s výsledků, . získaných za konstantních podmínek není rozhodující přesná znalost chemického stože^· ní . a prostorového uspořádání jednotlivých orga-, nických . kyselic ne^bo jejich estery ate ‘ určeni vzájemné podobnosti výsledků z jednotlivých^. ' chromatografických stanovení. Toto určení lze' : s výhodou ' provádět pomocí počítače s tím, že] výsledky stanovení u standartních organismů jsou předem . uloženy v databance. ,

Tento způsob identifikace mikroorganismů do- j ' . yoluje určit bez předběžné klasifikace na jednom ! typu půdy a současně vedle sebe nejen většinu I i gram negativních mikroorganismů, ale i . většinu i _; gram positivních organotrofních mikroorganismů, navíc při zkrácení potřebného času.

Charakteristické ’ obrazce příslušné jednotlivým _; ^; t^ypům m^ikroor^gamsm^ů jsou .zretetaě rozH&telró , a pro některé je typický výskyt určitých organických kyselin. Např. pro čeleď Pseudomonadaceae ; je týpická dominance kyselin se stejným elučním . ‘ časem jaký má kyselina olejová, pro čeleď Enterot bacteriaceae je typická dominance kyselin se stej! ným elučním časem jaký má kyselina palmitová.

Na přiložených výkresech jsou uvedeny normo, ván^{é g}ra^fic^ké z^áznam^{y p}o^číta^če. ^Na ose x je vynášen relativní eluční čas, na . ose y. je relativní výška píku. Na obrázku č. 1 je záznam charakteristický pro Pseudomonas aeruginosa, na obrázku č. *2 je záznam charakteristický pro Vibrio cholerae, na obrázku č. 3 je záznam charakteristický pro Edwardsiella tarda a na obrázku č. 4 je záznam charakteristický pro Bacillus thuringiensis kurstakii.

Na obr. 1 je záznam, charakteristický pro Pseudomonas aeruginosa. Pík 1 odpovídá kyselinám se stejným elučním časem, jaký má kyselina palmitolejová. Pík 2 odpovídá kyselinám se stejným elučním časem jaký má kyselina palmitová. Pík' 3 ' odpovídá kyselinám se stejným elučním časem, jaký má kyselina olejová.

Na obr. 2 ' je záznam, charakteristický pro Vibrio cholerae. Pík 4 odpovídá kyselinám . se stejným elučním časem, jaké 'má kyselina myristová, pík ! 1 odpovídá kyselinám se stejným elučním časem | jaké má kyselina palmitolejová, pík 2 odpovídá kyselinám se stejným elučním časem, . jaké má’ kyselina palmitová, pík 3 odpovídá kyselinám se stejným elučním časem, jaké má kyselina ole- í jová. I

Na obr. 3 je záznam typický pro Edwardsiella ' tarda. Pík 4 odpovídá kyselinám se stejným eluč! ným časem, jaké má kyselina myristová, pík ! 2 odpovídá kyselinám se stejným ·elučním časem ' I jaké má kyselina palmitová, pík 5 odpovídá kyseli- , | nám se stejným elučním ^časem^, ja^ké m^á ’ ^kyselrna i i methylenhexadekanová. j

Na obr. 4 ' je záznam typický pro Bacillus | thuringiensis kurstakii. Pík 4 odpovídá ’ kyselinám ΐ se stejným elučním časem, jaké má kyselina i i isomyristová, pík 6 odpovídá kyselinám se stejným .. : . elučním časem, jaké má kyselina methyltetradeka- | : nová, pík 2 odpovídá kyselinám se stejným elučním | ‘ časem, jaké má kyselina palmitová,'pík 7 odpovídá | kyselinám se stejným elučním . časem, jaké má | i . kysehna methylhexadekanová.

Konkrétní provedení identifikace mikroorganismů je . pro všechny druhy stejné. Neznámá čistá i . kultura, např. vyrostlá při běžném stanovení indi; kátorů fekálního znečištění, . se přeočkuje na | povrch živného média o složení:

Masový výtažek (sušina) ’ 10 g/1, pepton pro bakteriologii 10 g/1, chlorid sodný 5 g/1, · agar j 15 g/1, na petriho misku o průměru 10 cm tak, aby ί došlo k masovému nárostu a získalo se dostatečné ;

? množství biomasy. Po kultivační době, odpovídají- : i cí dosazení stacionární fáze růstu ' sledovaného ihikroorganismu, např. 24 hod., se biomasa smýje - . s povrchu agaru pomocí 5 ml išotonického roztoku í NaCl do centrifugační kyvety o objemu 10 ml. Po i centrifugací se čistý supematant . slije, suspenze buněk se promyje 5 ml išotonického roztoku NaCl I a znovu podrobí centrifugací. Proces promývání se I třikrát ' opakuje. Potom se . zahuštěná suspense ; buněk vysuší lyofilisací. Provede se es.terifikace;

> 20 mg suchého preparátu methylátem sodným. Vzniklé estery se extrahují do hexanu a po zahušte-; ní odpařením hexanu na celkové množství 10 ml se i

I provede nástřik 1 μΐ do injektoru plynového chroI matografu s kolonou o délce 3 m a . průměru 1,5 mm s nepolární fází.

^{! P}růto^k nosn^ého pl^yriu ^dus^íku je nastaven na· ml za minutu, detektor je použit plamenoíoníi, začni. Počáteční teplota je 100 °C, gradient 1 °Cza j ' minutu, konečná teplota je 260 °C. Získané výsledky lze pomocí integrátoru a počítače provést na , i normované diagramy, nebo pomocí počítače přímo ; ; zpracovat. Čas nutný k provedení celého postupu ' identifikace je cca 32 hodiny, z ' ' čehož samotná; j kultivace trvá 24 hodiny. _t

Tímto způsobem identifikace mikroojganisk^ lze výho^dně urat mtooorgamsmy, zúčastňující se' koloběhu biogenních prvků ve vodách při ¹ proce- i šech samočištění, . nebo při procesech biologického, | čištění ^; odpadních vod, dále mikroorganismy, které ' mají klinický nebo hygienický význam a mikroor- 1 ' gamsm^{y důl}e^žité · ^pro potravrn^ský ^průmysl;’^Navrzený způsob je· vhodný i pro další odvětví technické i mikrobiologie.

' ^f · Zvlhni význam m^á tato metoda ^pro teoretici studie v taxonomii a genetice mikroorganismů.

Claims

PREDMET VYNALEZU

Způsob identifikace mikroorganismů pomocí! chromatografie, při kterém se čistá kultura mikro- i organismů kultivuje za konstantních podmínek až do - dosažení stacionární fáze růstu, získaná biomasa ( . se oddělí centrifugací, promyje a vysuší, vyznačený j tím, že získaný vzorek se hydrolyzuje, například ] ² v kyselém prostředí - chlorovodíkem, popřípadě j esterifikuje,' například methylátem - sodným a po I extrakci se chromatograficky stanoví vzniklé orga-1 ! nické kyseliny, nebo jejich estery, načež se provede ( porovnání · získaných výsledků s výsledky, získaný- í mi u standartmch kmenů mikroorganismů.