CS226480B1 - Zařízení pro izolaci savčích embryí - Google Patents

Description

Vynález se týká zařízení pro rychlou izolaci savčích embryí. Jedná se o způsob izolace savčích embryí z tekutin získaných po chirurgických a nechirurgických lavážích pohlavního traktu donorů pomocí silonových sít.

Práce s časnými embryi savců je v základním i aplikovaném výzkumu nezbytná při řeiení celá řady problémů z oblasti reprodukční biologie jako preimplantačního vývoje regulace fertility, interakce matka-embryc, mutagenní a teratogenní studia aj.

Současné zkušenosti ukazují, že základní embryologické metody nalézají rozsáhlé použiti také v praxi, v oblasti živočišné výroby a plemenářské práce. Dokladem mohou být programy využívající přenosu embryí za účelem maximálního využití reprodukčního potenciálu vynikajících matek, cílené produkce dvojčat skotu, využití možnosti banky embryí, importovat a exportovat embrya místo zvířat apod.

Extrémně licitovaný počet embryí, který lze získat od jednoho donora, vyžaduje účinnou metodu izolace embryí z pohlavního traktu donora.

Při současném stavu techniky se embrya získávají několika způsoby; a) výplachem vypreparovaného pohlavního traktu po zabití zvířete, b) kanylací pohlavního traktu po laparotomii z boku nebo v linea alba, c) výplach děložních rohů pomocí katetru zavedeného přes děložní krček (skot, koně, člověk). Množství média použité k výplachu se pohybuje od 0,1 ml (vejcovod myši) do několika set mililitrů při nechirurgických lavážích (skot). Ve všech dosavadních metodických postupech byly výplachy shromažSovény na hodinových sklech nebo sběračích různých velikostí a z různého materiálu. Po 10 až 60 minutách byla embrya v malých množstvích média vyhledávána pod stereomikroskopem.

Vyhledávání embryí vyžaduje značnou zkušenost. I pro zkušeného pracovníka vSak prohlédnutí 300 až 500 ml výplachu představuje přibližně hodinu intenzívní práce. V případě kontaminace výplachu krví, ke kterému při nechirurgickéa způsobu získávání embryí často dochásí, je vyhledávání embryí velmi obtížné a často neúspěšné, stejně jako v případě silné leukocytérní invaze způsobené infekcí nebo hormonální disbalancí provázející v některých případech superovulaci. Dlouhý interval mezi vypláchnutím embryí a jejich izolaci nepříznivě ovlivňuje životaschopnost embryi.

Je v zájmu dalšího použití embryí tento interval co možné nejvíqe zkrátit. Při dosavadním způsobu získávání ambryí je obtížné zachovat sterilitu používaného materiálu i médií.

Při větších objemech výplachů a zvláště u výplachů kontaminovaných krví nebo leukocyty značně narůstá spotřeba pracně připraveného sterilního materiálu (hodinových skel, sběračů, injekčních stříkaček).

Je zřejmé, že každé embryo (zvlóště u hospodářských zvířat), ztracené během izolace, nepříznivě ovlivňuje efektivnost transplantačních programů a mé i nepříznivý ekonomický dopad.

Předpokladem pro úspěšnou práci s embryi je rychlá manipulace během pobytu in vitro.

Je založena na nasátí embryí do kapiláry a přenesení do zvoleného prostředí (kultivační, manipulační, zmrazovací médium). Také tato část vyžaduje značnou zručnost. Při přenéěení embryí může dochózet k dalším ztrátám, jejichž nejčastější příčinou je odplavení embryí vzduchovou bublinou nebo přichycení embryí na stěně kapiláry nebo jiné skleněné nádoby (sběrače, hodinového skla). V řadě případů je nezbytné rychle přenést rozsáhlejší skupiny embryí (příprava před zmrazovéním), což zvyšuje možnost delších ztrát.

Uvedené nedostatky nebo metodické obtížnosti řeší zařízení podle vynálezu, jehož podstatou je, že výplachovó trubice je opatřena alespoň dvěma vyjímatelnými pouzdry, ve kterých jsou síta, z nichž jedno síto, určené pro zachycení savčích embryí, je opatřeno síťovinou s oky o rozměrech 40 až 60 /ím, a tomuto sítu je předřazeno síto pro zachycení hrubých nečistot. Při sestavování pouzder slouží pro zachycení shluků buněk a částí tkání, případně jiných nečistot předřazená síta s oky většími než 150 £im. Výhodné je, aby pouzdro i síťovina byly z umělých hmot např. z poly-kaprolaktanu (Silonu), polyetylénu, polymetylmetakrylótu apod. Ale lze použít i jiných materiálů, např. kovu. Silonové síťovina s velikostí ok kolem 50 až 60 mikrometrů zachytóvó embrya všech laboratorních i hospodářských zvířat a propouští všechny buňky a zbytky tkání menší než embrya. Předřazeni aít s většími oky umožňuje zachytit větší kusy tkání.

Stavebnicově uspořádané síta umožňují získat všechna embrya zachycená výplechem. Současně umožňují separovat zbytky tkání, krevní elementy, cervikální hlen a nečistoty. Při vhodné volbě sít lze úspěšně Izolovat embrya věech laboratorních a hospodářských zvířat, případně i člověka. Vynález dále řeěí rychlou manipulaci se skupinami, případně jednotlivými embryi v podmínkách in vitro.

Pouzdro může mít tvar trubice, které je v dolní části konusovitá nebo je opatřena závitem pro spojeni jednotlivých pouzder do sebe.

Navařením síťoviny různých průměrů z plastů na spodek trubky nebo nádoby tvořící pousdro umožňuje libovolně měnit plochu sít, přizpůsobit ji množství použitého média, způsobu výplachu, případně dalším požadavkům (sterilita, skupiny embryí od jednotlivých zvířat aj.). Napojení nádob se síty na plastikové trubičky poskytuje uzavřené systémy, ve kterých lzo sterilně pracovat. Při použití sít podle vynálezu je nepatrná spotřeba tkáňově čistého skla, a v malém množství média, ve kterém jsou embrya spláchnuta ze síta, snadno vyhledává embrya i méně zkušený pracovník. Kontaminace média krví nebo leukocyty nemá vliv na rychlost a úspěšnosti izolace embryí. Počet získaných embryí lze zjistit přímo na sítech pod stereomikroskopem.

Přímo na sítech mohou být embrya (skupiny ambryí) proplachována, přenášena do zvoleného prostředí, případně transportována na potřebnou vzdálenost.

Materiál potřebný k výrobě sít je běžně dostupný, levný, lze jej sterilizovat a jinak upravovat.

Přiklad zařízení podle vynálezu je schematicky znázorněn na přiloženém výkresu v nárysu.

Zařízení sestává ze sběrače 1 média, do kterého je vyvedena výplachová trubice 2 se dvěma vyjímatelnými pouzdry J. V horním pouzdře J je síto 2, jehož sílovina je opatřena oky o rozměrech 160<um, dolní pouzdro 2 má síto A, jehož sílovina je opatřena oky o rozměrech 50 jum.

Provede se děložni výplach. Zachycená embrya zůstávají na dolním sítu A, na horním sítu 5. jsou zachyceny nečistoty. Na sítech nezachycené médium se odvede do sběrače A média.

Při získávání 7 až 9 denních embryí skotu byly proplachovány a) děložni rohy získané ze zabitých zvířat, 20 ml média, b) děložni rohy nechirurgickýra způsobem přes děložni krček, 300 ml média. Bnbrya byla vyhledávána běžně používaným způsobem a izolována pomocí silonových sít. Při vyhledávání embryí pod stereomikroskopem trvala izolace embryí z malého množství média 10 až 30 minut a z nechirurgických výplachů 20 až 50 minut. Při izolaci embryí z kontaminovaných výplachů byly časové intervaly 2 až 3x delší. V některých výplaších nebyla embrya nalezena. Při použiti sít byla izolace embryi ukončena za 4 až 8 minut. Kvalita výplachů neměla vliv na rychlost izolace. Z výplachů o známém počtu embryi byla získána všechna.

Claims (1)

1. pSedmít vynálezu.

   Zařízení pro izolaci savčích embryí získaných výplachem děložnich orgánů, sestávajících ze sběrače média a z výplachové trubice, vyznačené tím, že výplachová trubice (2) je opatřena alespoň dvěma vyjímatelnými pouzdry (3), ve kterých jsou síta (4, 5), z nichž jedno síto (4), určené pro zachycení savčích embryí, je opatřeno sílovinou s oky o rozměrech 40 až 60jum, a tomuto sítu (4) je předřazeno síto (5) pro zachycení hrubých nečistot.

   1 výkres

   J 1—xr ] ¹......

   Severografia, η. ρ., MOST

   Cena 2,40 Kčs