CS225279B1 - The brewing strain saccharomyces uvarum p9/lkl2-1 - Google Patents

Description

^s^skk1 popis vynálezu

REPUBLIKA 1191 K AUTORSKÉMU OSVĚDČENÍ

(61) (23) Výstavní priorita(22) Přihlášeno 16 04 82 (21) PV 2750-82 225 279 (11) (Bl) (51) Int. Cl? C 12 N 1/16

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zveřejněno 27 05 83(45) Vydáno qi 07 85 (75) BENDOVÁ OLGA PhMr.RNDr.prof.DrSc. í Autor vynalezu janDEBOVÁ BLANKA RNDríCSc.

KUPCOVA' LUDMILA VERNEROVÁ JANA ing.CSc.

V0NUÍEJS VLADIMÍR RNDr.CSc., HíAHA (54) Pivoverský kmen Saccharomyces uvarum P9-LKL2/1

Vynález se týká pivovarského kmene kvasinek Saccharomyces uvarum P9-LKL2/1,vhodného pro výrobu biologicky stabilních piv bez pasteurace. Tento kmen produkujebílkovinný faktor účinný proti řadě druhů kvasinek rodu Saccharomyces. Produkce faktorua resistence k němu umožňuje, aby tento kmen eliminoval případnou kontaminaci divokýmikmeny kvasinek rodu Saccharomyces, která zhoršuje kvalitu kvasných produktů. Řada kvasinek Je schopna produkovat tyto faktory, které působí jako mykocíny nařadu příbuzných druhů kvasinek. Produkce faktoru je determinována dvojřetězcovouribonukleovou kyselinou (RNA), přítomnou v cytoplasmě příslušných kmenů. Na reprodukcia vyjádření genetické informace této ribonukleové kyseliny se navíc podílí řadachromozomálních genů. Uvedenou kyselinu lze přenášet pouze konjugací buněk, cytodukcíěi indikovanou fúzí protoplastů. Při konstrukci kmene podle vynálezu byla použita metoda indukované fúze protoplastů,která umožnila hybridizaci haploidního kmene Saccharomyces cerevisiae T 158C , his“, producent faktoru, resistent k faktoru) s polyploidním pivovarským kmenemSaccharomyces uvarum P9. Tento kmen je citlivý na faktor druhého rodičovského kmene.

Po reversi hybridních protoplastů na normální buňky a selekci na minimálním mediu 225 279 225 279 2 s faktorem byl získán velký počet hybridních klonů, které produkovaly faktor, bylyk němu resistentní a schopny růstu bez přítomnosti histidinu. Průměrný obsah kyselinydesoxyribonukleové (DNA) a objem hybridních buněk vybraných klonů byl větší nežu výchozích rodičovských kmenů. Růstová rychlost vybraných hybridů v exponenciálnífázi růstu byla srovnatelná s rodičovskými kmeny· Vybrané hybridní kmeny byly podrobenypasážováni na mladině. Monokoloniové izoláty byly testovány a mezi nimi byl nalezenstabilní hybridní klon Sacchsromyces uvarum P9-LK12/1 s vysokou produkcí účinnéhofaktoru, který navíc vykazoval stupeň prokvašení mladiny, sedimentaci a další industrl-álně významné vlastnosti shodné s výchozím industrlálním kmenem Saccharomyces uvarum P9.

Charakteristika kmene S. uvarum P9-LK-12/1 spočívá v tom, že produkuje killerfaktor a je resistentní ke killer faktoru typu T 158 C. Buňky má nesporulujlcí a tvaruelipsoidu, přičemž délka činí 8,5 - 1,2 um a Šířka 7 ” 1,2 um, čímž se získají stacio-nární buňky v 8 % sladině kultivované při 28 °C. Tyto se množí pučením, obsah desoxy-ribonukleové kyseliny ve stacionární buňce je více než třikrát větší než u haploidníhorodiče S, cerevisiae T 158 C. Stacionární buňky jsou jednojaderné. Generační dobaexponenciální kultury v komplexním mediu při 28 °C činí 114 + 7 min. Získaný kmen Saccharomyces uvarum P9-LK12/1, uložený ve sbírce mikroorganismůkatedry genetiky, mikrobiologie a biofyziky přírodovědecké fakulty University Karlovyv Praze pod číslem LK12A, lze s výhodou použít jako produkční kmen pro kvasný procesa to zejména tehdy, hrozí-li kontaminace divokými kmeny kvasinek rodu Saccharomyces,

Vynález je blíže objasněn na konkrétním příkladu eliminace masivní kontaminacemladiny kvasinkami Saccharomyces bayanus.

Kmen kvasinek Saccharomyces uvarum P9-LKL2/1 byl vyveden standardním způsobemz laboratorní kultury do mladiny ve standardních kvasných válcích. Kultura bylakontaminována kmenem Saooheromyces bayanus tak, že 10 % celkového množství inokulatvořily kontaminantní buňky. Kvašení probíhalo způsobem spodního pivovarského kvašenípři teplotě 6 až 10 °C. Vzorky byly odebírány každý den a v mediu byl stanovovánpočet buněk hybridního a kontamlnantního kmene. Již po dvou dnech společné kultivacebyly buňky kontamlnantního kmene z kultury prakticky eliminovány. Zatímco v kontrolnímexperimentu, ve kterém byl rodičovský pivovarský kmen Saecharonyces uvarum P9 (nepro-dukující faktor) kultivován v přítomnosti stejného množství kontamlnantního kmenese buňky obou kmenů množily a buněk kmene Saccharomyces bayanus v kultuře rychlepřibývalo.

Obdobná eleminace buněk kontaminace hybridním kmenem S. uvarum P9-LKL2/1 bylau dalších kmenů citlivých druhů kvasinek rodu Saccharomyces. Spektrum citlivostina faktor se kryje se spektrem účinnosti původního rodičovského kmene Saccharomycescerevisiae T 158C (°^ , his”, faktor produkující). Hybridní kmen dokonce vykazujeve srovnání s rodičovským kmenem T 158C vyšší intenzitu efektu, jak bylo demonstrovánostandardním zónovým testem.

Claims (1)

1. 3 225 279 Dále je uveden příklad reprodukovatelného postupu šlechtění. Indukovaná fúzeprotoplastů kmene S. cerevlsae T 158 C a S. uvarum P9 probíhala v 30 % polyethylenglykolua 0,3 M CaClg. Selekce hybridů probíhala souběžně s reversí protoplastů v minimálnímosmoticky stabilisovaném mediu (agarové plotny) při 28 °C dva dny. Potom byl na povrchegaru rozetřen killer faktor, 0,2 ml media (po kultivaci kmene S. cerevisiae T 158 Ctři dny), ze kterého byly odstraněny buňky filtrací přes membránový filtr. Mezihybridními klony vyrostlými na tomto mediu při 20 °C, byly vybrány ty, které produkovalynejvíce killer faktoru, dále byly pasážovány opakovaně na 8 % mladině při 7 °C avysety na kompletní agarové medium. Monokoloniové izoláty byly testovány z hlediskapivovarsky významných vlastností, zejména sedimentace a prokvašení mladiny. Bylvybrán kmen, který produkoval killer faktor, byl k němu resistentní a nejvíce seblížil rodičovskému kmenu S. uvarum P9 s pivovarsky významnými vlastnostmi. PŘEDMĚT VYNXLEZU Pivovarský kmen Saechnrorayces uvarum P9-LK12/1.