CS218624B1 - Sposob přípravy P-l,4-xylooligosachari<lov a P-l,4-(U«14C)xylooligosacha· ridov - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká spósobu přípravy p-l,4-xyloolii gosacharidov neznačených alebo značených rádionuklidom uhlíka 14C, , Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa na aryl-P-xylozidy alebo aryl-P-(U-14C)xylozidy v koncentrácii vyššej ako 100 mM pósobí extracelulárnou β-xylanázou kvasiniek Cryptococcus albidus a výsledný produkt sa izoluje papierovou chromatografiou. Lineárně 3-l,4-xylooligosacharidy majú využitie ako modelové látky na štúdium chemických vlastností a reaktivity hemicelulóz. Predstavujú tiež vhodné substráty na štúdium mechanizmu k účinku mikrobiálnych 3-1,4-xylanáz.

Description

3

Vynález sa týká spósobu přípravy β-1,4-χγ1οο1ί-gosacharidov neznačených alebo značených rádio-nuklidom uhlíka 14C reakciou aryl-p^D-xylopyra-nozidov s extracelulárnou endo-1,4-β-xylanázouprodukovanou kvasinkami Cryptococcus al-bidus. p-l,4-Mylooligosacharidy sa nachádzajú v znač-nom množstve v predhydrolyzátoch dřeva. Tieto savšak obvykle nepoužívajú na ich izoláciu, leboobsahuju celý rad dalších sacharidových zložiek,ktoré. komplikujú izolačný proces. Najbežnejšímipostupmi přípravy xylooligosacharidóv je parciál-na kyslá hydrolýza a enzýmová hydrolýza rastlin-ných a dřevných xylánov (R. L. Whistler a C. C. Tu,J. Am. Chem. Soc., 73, 1389 [1951], 74, 3609[1952], 75, [1953]; C. T. Bishop, Can. J. Chem.,33, 1073 [1955]; T. E. Timell, Svensk Paperstid.,65,435 [1962]). Predovšetkým enzýmová hydrolý-za poskytuje poměrně dobré výtažky vzhradom namnožstvo východzieho xylánu (J. Kusakabe, T.Yasui a T. Kobayashi, Nippon Nogeikagaku Kaishi49, 383 [1975]). Žiadna z uvedených metod však neposkytujemožnost’ přípravy β-1,4-xylooligosacharidov zna-čených rádionuklidom uhlíka 14C, pokiaf sa nezíská14C značený polysacharid, čo je finančně i experi-mentálně náročný proces.

Pri štúdiu vlastností extracelulámej β-xylanázykvasiniek Cryptococcus albidus (P. Biely, M. Vr-šanská a Z. Krátký, Eur. J. Biochem., v tlači) sazistilo, že enzým napriek tomu, že vykazuje všetkytypické vlastnosti endoxylanázy (hydrolyzuje xylánná xylooligosacharidy, znižuje viskozitu jeho roz-tokov a nehydrolyzuje xylobiózu) má schopnost’uvolňovat’ p-nitrofenol z p-nitrofenyl^-D-xylopy-ranozidu podobné ako β-xylozidáza. Podrobnýmštúdiom tejto reakcie sa zistilo, že rozklad p-nitro-fenyl-, o-nitrofenyl- a fenyl^-D-xylopyranoziduneprebieha hydrolytickým štiepením na xylózua aglykón, ale je sprevádzaný vznikom xylobiózy,xylotriózy, xylotetraózy a xylózy. Kvantitativnouanalýzou reakčných produktov fenyl-P-D-[U--14C]xylopyranozidu syntetizovaného z (Ur14Č)xy-lózy podlá Montgomery a spol. (J. Am. Chem. Soc.64, 690 [1942]) sa dokázala závislost’ reakčnejrýchlosti a zloženia produktov reakcie β-xylanázyna koncentrácii substrátu. Najvyššie výťažky oligo-sacharidov sa dosahujú pri koncentráciách fenyl-β-xylozidu vyšších ako 100 mM. Kedže s výnimkouxylobiózy sa koncentrácie vyšších xylooligosacha-ridov menia v priebehu inkubácie, t. j. najprv saakumulujú a neskoršíe miznú v reakčnej zmesi,reakciu je potřebné zastavit’ podlá toho, akýoligosacharid sa izoluje. Za účelom přípravy xylo-triózy a xylotetraózy je vhodné reakciu jsastaviťpřibližné v štádiu 40 až 50 % rozkladu fenyl^-xy-lozidu. Najvyššie výťažky xylobiózy sa dosiahnu, aksa reakcia nechá pokračovat’ do ustavenia rovno-vážnej zmesi, ktorá už oligosacharidy vyššie akoxylobiózu neobsahuje.

Transglykozylačné reakcie β-xylanázy s aryl-β--xylozidmi sú stereošpecifické, vedú výlučné ktvor- 218624 be xylooligosacharidov s p-l,4-glykozidickýmivazbami. Potvrdilo sa to hmotnosťou spektromet-"riou per-0-metylovanej xylobiózy a hodnotamioptickej otáčavosti a bodom topenia kryštalickejxylobiózy izolovanej z enzýmovej reakčnej zmesi.Konštanty bolí v zhode s Iiterárnymi údajmi.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa naaryl- β-xylozidy alebo aryl- β- (U -14 C)xy lozidyv koncentrácii vyššej ako 100 mM pósobí extrace-lulárnou β-xylanázou kvasiniek Cryptococcus albi-dus a výsledný produkt sa izoluje papierovouchromatograf iou. Výhodou navrhovaného spósobu přípravy niž-ších β-1,4-xylooligosacharidov je, že představujev súčasnej době jedinú reálnu cestu k získaniuβ-1,4-xylooligosacharidov univerzálně značenýchrádionuklidom uhlíka 14C pri použití aryl^-D-(U--14C) xylozidov ako substrátu. příprava aryl^-D-xylopyranozidov je z časové-ho híadiska menej náročná ako izolácia rastlinnýchxylánov pre enzýmovú hydrolýzu, nie je viazaná na použitie purifikovanej β-xyla-názy, ako zdroj β-xylanázy sa dá použit’ zahuštěnéa dialyzované rastové médium kvasiniek C. albiduszískané po kultivácii kvasiniek na xyláne alebo poindukcii enzýmu metyl^-D-xylozidom, pri použití neznačených aryl-^-D-xylopyranozi-dov uvedený spósob přípravy xylobiózy móžekonkurovat’ spósobu získania týchto látok enzýmo-vou hydrolýzou xylánu. Příklad 1 p-Nitrofenyl^-D-xylopyranozid sa rozpustí vovodě aby sa získal 100 mM roztok. K roztokusubstrátu sa přidá preparát extracelulámej β-xyla-názy kvasiniek Cryptococcus albidus a zmes sainkubuje pri 30 °C po dobu 0,5 až 20 hodin. Poinkubácii a zahuštění sa zmes chromatografuje napapieri Whatman No 1 alebo 3 MM v sústaveetylacetát-kyselina octová — voda (18 : 7 : 8, v/v).Po detekcii vodiacich pásov sa zóny odpovedajúcexylobióze a xylotrióze vystrihnú, eluujú vodou a porechromatografii sa oligosacharidy kryštalizujúz vodného metylalkoholu. Výťažky závisí a odštádia ukončenia reakcie. Příklad 2

Kmeň Cryptococcus albidus CCY-17-4-1 sapestuje na pode obsahujúcej 1 % xylánu, 0,67 %kvasničnej dusíkatej bázy, 0,2 % asparagínua 0,5 % dihydrofošforečnanu draselného. Po4 dňoch sa narastené buňky odstránia centrifugá-ciou a získaná kultivačná tekutina sa zahustí vovákuu pri 40 °C na 1/10 póvodného objemua dialyzuje sa oproti destilovanej vodě pri 4 °C. Podialýze sa objem dialyzačného čreva použije akopreparát β-xylanázy. Roztok fenyl^-D-xylozidu(150 mM) sa inkubuje s prídavkom enzýmovéhopreparátu (1/10 objemu roztoku substrátu) pri30 °C. Po ukončení reakcie sa reakčná zmesspracuje ako v bode 1.

Claims (1)

1. 4 Příklad 3 Fenyl-P-D-(U-14C)xylozid syntetizovaný z U--14C)xylózy sa koncentrácii 150 mM inkubuje s pu-rifikovanou endo-xylanázou pri 30 °C (koncentrá-cia enzýmu 3 jednotky/ml). Pod jednotkou enzy-mu sa rozumie také množstvo enzymu, ktoréuvolní za 1 minútu pri 30 °C a pH 5,4 (acetátovýpufor)v0,5 mlinkubačnejzmesiobsahujúcej 1 mgxylánu redukujúcej oligosacharidy rovné 1 móluxylózových ekvivalentov. Reakčná zmes sa po 0,5až 20 hodinách zahustí a chromatografuje napapieri Whatman No 1 v sústave etylacetát-kyseli-na octová-voda (18 : 7 : 8, v/v). Radioaktivněprodukty sa lokalizujú autorádiografiou, vystrihnú PREDMET Spósob přípravy β-1,4-xylooligosacharidova p-l,4-(U-14C)xylooligosacharidov vyznačujúcisa tým, že sa na aryl-P-xylozidy alebo aryl-P-(U--14C)xylozidy v koncentrácii vyššej ako 100 mM 218624 z papiera a eluujú vodou. V závislosti od štádiazastavenia reakcie sá získájú (U-14C)xylobióza,(U-14C)xylotrióza a (U-14C)xylotetraóza o špeci-fickej radioaktivitě rovnej dvoj-, troj-, štvornásob-ku špecifickej rádioaktivity východiskového fenyl--(U-14C)xylozidu. Lineáme -1,4-xylooIigosacharidy sa využívajuako modelové látky na štúdium chemických vlast-ností a reaktivity hemicelulóz. Predstavujú tiežvhodné substráty na štúdium mechanizmu účinkumikrobiálnych -1,4-xylanáz. Z posledného hradis-ka majú hlavně význam xylooligosacharidy znače-né rádionuklidom uhlíka 14C, ktoré nie sú do-stupné. VYNÁLEZU pósobí extracelulámou β-xylanázou kvasiniekCryptococcus albidus a výsledný produkt sa izolujepapierovou chromatografiou. Vytiskly Moravské tiskařské závody,provoz 12, Leninova 21, Olomouc Cena: 2,40 Kčs