CS217802B1

CS217802B1 - A method for analytically determining the activity of hydrolases and a means for performing the method

Info

Publication number: CS217802B1
Application number: CS611780A
Authority: CS
Inventors: Vlastimil Svoboda; Eva Hrboticka
Original assignee: Vlastimil Svoboda; Eva Hrboticka
Priority date: 1980-09-10
Filing date: 1980-09-10
Publication date: 1983-01-28

Abstract

Jedná se o diagnostický proužek použitelný v lékařství. Podstata vynálezu spočívá v tom, že nasákavý nosič se skládá * části reakční . a indikační, čáat reakční obsahuje ve vodě nerozpustný barevný substrát, z něhož„se v průběhu analytického stanoveni uvolňuji ve vodě rozpustné barevné Štěpné produkty. Do části indikační tyto Štěpné produkty migruji a jsou v nl na základě svého zabarveni vizuálně nebo fotometričky stanovovány. Prostředek je určen k analytickému stanoveni aktivity enzymů, zejména hydrolas, v různých biologických materiálech.This is a diagnostic strip usable in medicine. The essence of the invention lies in the fact that the absorbent carrier consists of a reaction part and an indicator part, the reaction part contains a water-insoluble colored substrate, from which water-soluble colored cleavage products are released during the analytical determination. These cleavage products migrate to the indicator part and are determined visually or photometrically there based on their color. The device is intended for the analytical determination of enzyme activity, especially hydrolases, in various biological materials.

Description

Předmětem vynálezu je způsob analytického stanovení aktivity enzymů, zejména hydrolas, v různých biologických materiálech.The subject of the invention is a method for the analytical determination of the activity of enzymes, in particular hydrolases, in various biological materials.

Stanoveni aktivity enzymů v biologických, mikrobiologických a biochemických laboratořích nabývá stále většího významu; přítomnost a aktivita určitých enzymů je pro řadu biologických materiálů charakteristické, takže na základě důkazu jejich přítomnosti a kvantitativního stanovení jejich aktivity lze např. jednoznačně identifikovat některé kmeny a druhy mikroorganismů, studovat a vysvětlovat projevy různých Sivých buněk, posuzovat funkci různých orgánů vyšěích živočichů apod.The determination of enzyme activity in biological, microbiological and biochemical laboratories is becoming increasingly important; the presence and activity of certain enzymes is characteristic of many biological materials, so that by demonstrating their presence and quantitatively determining their activity, it is possible, for example, to clearly identify certain strains and species of microorganisms, study and explain the manifestations of various gray cells,

Mezi zvlášl významné enzymy patří mimo jiné tzv. hydrolasy, z nichž zejména některé glykoaido-hydrolasy (systematické označení 3.2) a proteolytické enzymy (systém, označeni 3.4) mají obzvláštní důležitost, nebol svou schopností odbourávat polymerní molekuly polysacharidů nebo polypeptidů představují základ řady trávicích pochodů. U vyšších živočichů a člověka je pak jejich výskyt například u pankreatické nebo duodenální-'Slávě, případně i krvi nebo moči přímým obrazem funkce příslušného orgánu, zejména pankreatu. Stanovením aktivity některých těchto hydrolytických enzymů (alfa-amylasy, lipasy, chymotrypsinu, trypsinu, kolagenasy apod.) v séru nebo moči je pak možné s poměrně vysokým procentem pravděpodobnosti určit diagnózu některých funkčních poruch organismu.Particularly important enzymes include, among others, so-called hydrolases, of which some glycoaido-hydrolases (systemic designation 3.2) and proteolytic enzymes (system designation 3.4) are of particular importance since they are the basis of many digestive processes due to their ability to degrade polymeric polysaccharide . In higher animals and humans, their occurrence, for example, in pancreatic or duodenal glands, or possibly blood or urine, is a direct reflection of the function of the organ, particularly the pancreas. By determining the activity of some of these hydrolytic enzymes (alpha-amylases, lipases, chymotrypsin, trypsin, collagenase, etc.) in serum or urine, it is then possible to make a diagnosis of some functional disorders of the organism with a relatively high percentage of probability.

Pro stanovení těchto hydrolytických enzymů jsou v současné době známy a používány složité fotometrické metody, založené na principu měření buá úbytku substrátu, nebo množství vzniklých štěpných produktů. Všechny tyto metody mají společnou nevýhodu v tom, že jsou zdlouhavé a vyžadují řadu manipulací, jako je přesné odměřování jednotlivých činidel, temperování, fotoaetrovánl, provedení slepých zkoušek, přepočet naměřených hodnot abáorbance na jednotky aktivity enzymů apod. Je samozřejmé, že k provedení takto komplikovaných testů je zapotřebí dokonale vybavená analytická laboratoř s vysoce kvalifikovaným technickým personálem a řada čistých, speciálních a poměrně drahých chemikálií a činidel.For the determination of these hydrolytic enzymes, complex photometric methods are currently known and used, based on the principle of measuring either the loss of substrate or the amount of fission products formed. All these methods have a common disadvantage in that they are lengthy and require a number of manipulations, such as accurate metering of individual reagents, annealing, photoaetration, blind tests, conversion of measured ababorance values into units of enzyme activity, etc. Of course, to perform such complicated processes. Testing requires a well-equipped analytical laboratory with highly qualified technical staff and a range of pure, special and relatively expensive chemicals and reagents.

Tato skutečnost ukazovala již po řadu let na potřebu nalezení jednoduchého a rychlého způsobu stanoveni aktivity enzymů, který by byl proveditelný i méně kvalifikovanými pracovníky s dostatečnou správností a přesností a případně bez potřeby speciálního laboratorního vybavení.This has shown for many years the need to find a simple and quick method of determining enzyme activity, which would be feasible even by less qualified personnel with sufficient accuracy and accuracy and possibly without the need for special laboratory equipment.

Nastíněný úkol se podařilo vyřešit předloženým vynálezem, jehož předmětem je jednoduchý prostředek k analytickému stanovení aktivity enzymů, zejména hydrolas, sestávající z nasákavého nosiče, jako je například filtrační papír, rouno ze skleněných nebo organických vláken, porézní polymerní syntetické hmoty apod., vyznačený tím, že se skládá z části reakční, obsahující nerozpustný barevný substrát, z něhož se v průběhu analytického stanovení uvolňují barevná štěpné produkty, a části indikační, do níž tyto barevné štěpné produkty migrují a jsou v ní na základě svého zabarvení vizuálně nebo fotometricky stanovovány Vedle uvedené hlavní složky, nerozpustného barevného substrátu, obsahuje tento prostředek ještě řadu dalších látek, zajišlujlcích optimální průběh analytického stanovení příslušného enzymu; jsou to například tlumiče, různé stabilizátory nebo aktivátory enzymů, smáčedla, tzv. zahušlovadla a podobně.The object of the present invention is to provide a simple means for the analytical determination of the activity of enzymes, in particular hydrolases, consisting of an absorbent carrier, such as filter paper, glass or organic fiber web, porous polymeric synthetic material and the like, It consists of a reaction part containing an insoluble color substrate from which the color fission products are released during the analytical determination and an indication part into which the color fission products migrate and are visually or photometrically determined thereon by coloration. the insoluble colored substrate component, the composition also contains a number of other substances to provide an optimal analytical assay for the respective enzyme; such as dampers, various stabilizers or enzyme activators, wetting agents, so-called thickeners, and the like.

Prostředek k analytickému stanoveni aktivity enzymů dle tohoto vynálezu představuje s výhodou proužek nasákavého nosiče, široký 5 až 10 mm, na jehož dolní část je v délce 5 až 30 mm nanesen nerozpustný barevný substrát. Je výhodné, jestliže tato reakční část s nerozpustným barevným substrátem je vzdálena 3 až 10 mm od jednoho příčného okraje proužku nasákavého nosiče. Tato 3 až 10 mm volná část nasákavého nosiče pak slouží k nanesení vzorku, případně ponoření do vyšetřované kapaliny; v obou těchto případech působí jako knot, zajištující nasátí vyšetřované kapaliny do reakční části proužku. V této reakční části dochází ke štěpení barevného nerozpustného substrátu, přičemž rozpustné barevné štěpné produkty jsou unášeny vzlínající kapalinou, tj. vyšetřovanou kapalinou nebo další tzv. vyvijecí kapalinou, do sousední, tzv. indikační části proužku, přičemž intenzita tohoto zabarvení je přímo úměrná množství uvolněných Štěpných produktů a tím aktivitě stanovovaného enzymu. Vzhledem k tomu, že vzlínající kapalina postupuje proužkem přes reakční zónu do zóny indikační zvolna, takže stanovení trvá 5 až 20 minut, je výhodná proužek nasákavého nosiěe pokrýt na převážná části obou stran vhodnou nepropustnou látkou, jako je například fólie ze syntetické hmoty, aby se zabránilo odpařování vzlínající kapaliny.The means for analytically determining the activity of the enzymes of the present invention is preferably a 5-10 mm wide absorbent carrier strip with an insoluble colored substrate over its length of 5-30 mm. Preferably, the reaction portion with the insoluble colored substrate is 3 to 10 mm from one transverse edge of the absorbent support strip. This 3 to 10 mm free portion of the absorbent carrier is then used to deposit the sample or immerse it in the test liquid; in both cases, it acts as a wick to suck up the test liquid into the reaction portion of the strip. In this reaction part, the colored insoluble substrate is cleaved, wherein the soluble colored fission products are carried by the capillary liquid, i.e. the test liquid or another so-called developing liquid, into the adjacent so-called indicator portion of the strip. Fission products and thus enzyme activity. Since the capillary liquid passes the strip through the reaction zone slowly into the indicator zone so that the determination takes 5 to 20 minutes, it is preferable to cover the strip of absorbent carrier on most parts of both sides with a suitable impermeable material such as a synthetic film to prevent evaporation of the rising liquid.

Jedno z možných výhodných provedení takových proužků dle vynálezu je schematicky znázorněno na přiloženém obrázku č. 1. Na nasákavý nosiě i, který je naimpregnovén pomocnými činidly popsanými níže, je v části 1a (část reakční) nanesen barevný nerozpustný substrát 2,; až na malou část 1b na jednom konci proužku je na tento nosič z obou stran pomocí adhesiva nalepena fólie z bílé, neprůhledné plastické hmoty 4, 4a. 2> které na horní části proužku přesahuje filtrační papír a tvoři jakýsi držák (£). Horní fólie se tím skládá ze dvou částí 4 a 2i nalepených na nasákavý nosič tak, že ponechávají na nasákavý nosič volný průhled na indikační část 1c nasákavého nosiče.One possible embodiment of such strips according to the invention is shown schematically in the accompanying figure 1. A colored insoluble substrate 2 is deposited in part 1a (reaction part) on the absorbent carrier 1, which is impregnated with the auxiliary agents described below; except for a small portion 1b at one end of the strip, a white, opaque plastic sheet 4, 4a is adhered to the support from both sides by means of an adhesive. 2> which extends over the filter paper at the top of the strip and forms a holder (£). The topsheet thus consists of two parts 4 and 2i glued to the absorbent carrier so as to leave a clear view of the absorbent carrier indicating portion 1c on the absorbent carrier.

Jako nasákavý nosič J. je ve smyslu tohoto vynálezu možno použít jakoukoliv látku, mající dostatečný počet a objem vnitřních pórů, umožňujících snadná a rychlá vzlinánl kapaliny. Mohou to být. nosiče vláknitého typu, jako například filtrační papír z vláken přírodního původu, jako je celulóza, vlna, bavlna aj. nebo i rouno z vláken umělých, jako například polyamidu, polyesteru, skla nebo i jejich nejrůznějěích směsí. Vedla toho lze ověem použít například i porézní nevléknité nosiče mající potřebná vlastnosti z hlediska nasákavosti; u látek tohoto typu jsou to zejména látky isotropně-porézního charakteru, připravená například technikou fázově inverzní polymerace nebo separace, jak jsou popisovány například v publikaci Kesting R. E., Syntetic Polymeric. Membranes. Základní sloužkou prostředku dle tohoto vynálezu je nerozpustný barevný substrát; dle druhu enzymu, který má být pomocí tohoto prostředku stanoven, je nutná volit i odpovídající substrát, který svým chemickým složením a strukturou odpovídá specifickým účinkům stanovovaného enzymu. Substráty tohoto druhu jsou obecně známá a pro obdobná účely používané látky, jako například tzv. RBB-Starch ke stanovení alfa-amylasy (viz Experientia 23. 1967, 805), Fibrln-Blue ke stanovení pepsinu a jiných kyselých proteas (Clin. Chim. Aeta 21. /1968/, 197), Azocoll ke stanovení kolagenasy (J. Path. Biochem. 58 /1946/, 229) aj. Obecně lze tedy použít jakýkoliv specifický substrát, na nějž bylo chemicky navázáno vhodné barvivo, který je v daném vodném prostředí nerozpustný a působením enzymu se štěpí na nižší barevné štěpné produkty, ve vodě, případně daném vodném prostředí relativně dobře rozpustná.Any substance having a sufficient number and volume of internal pores to allow the liquid to be easily and rapidly ventilated can be used as the absorbent carrier. They could be. fibrous type carriers, such as filter paper of fibers of natural origin, such as cellulose, wool, cotton and the like, or even a web of artificial fibers, such as polyamide, polyester, glass, or even a variety of mixtures thereof. In addition, for example, porous non-fibrous carriers having the necessary absorbency properties may also be used; for substances of this type, they are in particular isotropic-porous in nature, prepared, for example, by the technique of phase inversion polymerization or separation, as described, for example, in Kesting R.E., Syntetic Polymeric. Membranes. An essential component of the composition of the present invention is an insoluble colored substrate; depending on the type of enzyme to be determined by this means, it is also necessary to select a corresponding substrate which, by its chemical composition and structure, corresponds to the specific effects of the enzyme to be determined. Substrates of this type are generally known and used for similar purposes, such as RBB-Starch for the determination of alpha-amylase (see Experientia 23, 1967, 805), Fibrin-Blue for the determination of pepsin and other acidic proteases (Clin. Chim. Aeta 21. (1968), 197), Azocoll for the determination of collagenase (J. Path. Biochem. 58 (1946), 229), etc. Thus, in general, any specific substrate to which a suitable dye is chemically coupled can be used. insoluble in the aqueous medium and, under the action of the enzyme, cleavage into lower color cleavage products, relatively soluble in water or in the aqueous medium.

Nanesení tohoto substrátu na nasákavý nosič je možné provést nejrůznějšími způsoby: například je možné substrát rozpustit ve vhodném rozpouštědle, jako je dimetylsulfoxid, etanol, aceton, apod. nebo jejich směsi, vzniklým roztokem napojit nosič do nasycení a rozpouštědlo odstranit vysušením. Jiný použitelný způsob je rozpuštění barevného substrátu například ve vodném roztoku hydroxidu nebo uhličitanu alkalického kovu nebo 1 jiné, alkalicky reagující látky, nanesení tohoto roztoku na nosič a vysrážení substrátu na nosiči v nerozpustné formě okyselením vhodnou kyselinou. Bále je pak možné připravit nosič s barevným substrátem 1 tak, že se částice substrátu zabudují do nosiče již při jeho výrobě, tj. například jemně rozemletý substrát se přidá do papiroviny, z niž se pak odleje papír, Většinou substrátu je konečně možno na nosič nanésti tak, že se pevný, jemně práškový substrát mechanicky vetře do pórů nasákavého nosiče. Z hlediska požadovaných vlastností prostředku dle tohoto vynálezu je věak výhodné - a také nejjednodušší - pevný, práškový sub-strát nalepit na adhezívní povrch samolepicí pásky a s touto páskou jej pak pevně připojit k povrchu nosiče.The substrate may be deposited on the absorbent carrier in a variety of ways: for example, the substrate may be dissolved in a suitable solvent such as dimethylsulfoxide, ethanol, acetone, or the like, or a mixture thereof to render the carrier saturated and saturate the solvent. Another useful method is to dissolve the colored substrate in, for example, an aqueous solution of an alkali metal hydroxide or carbonate or other alkaline reacting substance, depositing the solution on the support and precipitating the substrate on the support in insoluble form by acidification with a suitable acid. It is still possible to prepare the carrier with the colored substrate 1 by incorporating the substrate particles into the carrier during its manufacture, i.e., for example, the finely ground substrate is added to the paper stock from which the paper is then poured. such that the solid, finely powdered substrate is mechanically rubbed into the pores of the absorbent carrier. However, in view of the desired properties of the composition of the present invention, it is advantageous - and also simplest - to adhere a solid, powdered substrate to the adhesive surface of the pressure-sensitive adhesive tape and then firmly attach it to the carrier surface.

Jak již bylo výše uvedeno, obsahuje prostředek k analytickému stanovení aktivity enzymů dle vynálezu ještě také řadu dalších látek, potřebných pro optimální průběh enzymové reakce, na níž je stanoveni založeno. Je to v první řadě tlumič, zajišlujicí při použití prostředku takové-podmínky, při nichž je stanovovaný enzym dostatečně stabilní a jeho aktivita nejvyšší. Druh použitého tlumiče a jeho hodnota pH se přitom řídí druhem ensymu, k jehož stanovení je prostředek dle vynálezu určen. Obecně je však možno použít známé a proAs already mentioned above, the means for the analytical determination of the activity of the enzymes according to the invention also contains a number of other substances necessary for the optimal course of the enzymatic reaction on which the determination is based. First of all, it is a silencer which, when used in the formulation, ensures that the enzyme to be determined is sufficiently stable and has the highest activity. The type of buffer used and its pH value depend on the type of ensemble to be determined by the composition according to the invention. In general, however, it is possible to use known and well known compounds

217302 obdobná stanovení aktivity enzymů běžné používané tlumiče, jako jsou například tlumiče fosforečnanové, citrátové, tlumiče na bázi tris-hydroxymetylaminometanu a kyseliny chlorovodíkové apod., o hodnotách pH odpovídajících maximu enzymové aktivity a stability stanovovaného enzymu a uvedených například ve známé monografii H. U. Bergmayera Methods of Enzyme tic Análysis.217302 similar assays for enzyme activity of commonly used buffers, such as phosphate, citrate, tris-hydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid buffers, etc., at pH values corresponding to the maximum enzyme activity and stability of the enzyme to be determined, for example in the well-known monograph HU Bergmayer Enzyme tic Anamsis.

Další součástí prostředku k analytickému stanovení aktivity enzymů mohou být tzv. aktivátory enzymové ektivity. Jsou to například chloridy a/nebo kyselina cholová, bromidy v prostředku pro stanovení aktivity alfa-amylasy, hořečnaté soli, jako například síran nebo chlorid hořečnatý v prostředku pro stanovení aktivity trypsinu, vápenaté soli v prostředku určeném ke stanovení aktivity alfa-chymotrypsinu apod. Obecně se opět jedná o látky, jejichž specifické aktivační účinky jsou známy a jsou používány i při jiných způsobech stanovení aktivity enzymů. Jejich přítomnost v reakční části prostředku dle vynálezu je však nutná jen v některých případech; má-li prostředek sloužit například ke stanovení aktivity alfa-amylasy v moči nebo séru, pak přítomnost chloridů v prostředku není bezpodmínečně nutná, neboí obě uvedené vyšetřované biologické kapaliny obsahující relativně vysoké koncentrace chloridových iontů, které v průběhu vlastního stanovení stanovený enzym dostatečně aktivuji.The enzyme activity activators may be a further part of the means for the analytical determination of enzyme activity. These include, for example, chlorides and / or cholic acid, bromides in an alpha-amylase activity assay, magnesium salts such as sulfate or magnesium chloride in a trypsin assay device, calcium salts in an alpha-chymotrypsin assay device, and the like. they are again substances whose specific activating effects are known and are also used in other methods of determining enzyme activity. However, their presence in the reaction portion of the composition of the invention is only necessary in some cases; if the composition is to be used, for example, to determine the activity of alpha-amylase in urine or serum, then the presence of chlorides in the composition is not absolutely necessary, since the two biological fluids examined contain relatively high concentrations of chloride ions which sufficiently activate the enzyme.

Vedle těchto látek může prostředek dle vynálezu obsahovat i tzv. stabilizátory enzymů, tj. látky, které brání inaktivaci enzymů v průběhu jejich stanovení, jako jsou například vápenaté soli pro stabilizaci alfa-amylasy nebo trypsinu. Obdobně jako u výše uvedených aktivátorů enzymové aktivity není přítomnost stabilizátorů enzymů nutná v prostředku dle vynálezu, je-li určen ke stanovení aktivity enzymů v prostředích obsahujících dostatečné množství těchto stabilizátorů, jako jsou některé biologické kapaliny.In addition to these substances, the composition according to the invention may also contain so-called enzyme stabilizers, i.e. substances which prevent the inactivation of enzymes during their determination, such as calcium salts for stabilizing alpha-amylase or trypsin. As with the aforementioned enzyme activators, the presence of enzyme stabilizers is not necessary in the composition of the invention when intended to determine enzyme activity in environments containing a sufficient amount of such stabilizers, such as some biological fluids.

Prostředek dle vynálezu může konečně s výhodou obsahovat i různá smáčedla a/nebo tzv. zahuělovadla. Jako smáčedel, jejichž úkolem je urychlit proniknutí enzymu k nerozpustnému barevnému substrátu a migraci solubilizovaných barevných štěpných produktů, lze použít jakákoliv běžná smáčedla, tj. obecně známé a průmyslově vyráběné povrchově aktivní látky anionaktivního, kationaktivního nebo i neionogenního charakteru, jako jsou například různé aryl- případně aralkylsulfonáty, kvartérní amoniové soli s delšími alkylovými nebo aralkylovými řetězci, nebo neionogenní polymery alkylenoxidů s různými delšími alifatickými řetězci. Druh smáčedla, vhodný pro použití v prostředku dle tohoto vynálezu, se pak volí s ohledem na účel použití prostředku, tj. řídí se druhem enzymu, k jehož stanoveni je prostředek určen. Obecně se však jeví nejvýhodnějšlm použití neionogenních smáčedel na bázi substituovaných polyoxyalkylenů.Finally, the composition according to the invention may advantageously also contain various wetting agents and / or so-called thickeners. Any conventional wetting agent, i.e., generally known and industrially produced surfactants of anionic, cationic or even non-ionic nature, such as various aryl- optionally aralkyl sulfonates, quaternary ammonium salts with longer alkyl or aralkyl chains, or non-ionic polymers of alkylene oxides with various longer aliphatic chains. The type of surfactant suitable for use in the composition of the present invention is then selected with respect to the intended use of the composition, i.e. it is governed by the type of enzyme to be determined. In general, however, the use of nonionic surfactants based on substituted polyoxyalkylenes is most preferred.

Tzv. zahušlovadla jsou polymerní, ve vodě rozpustné látky přírodního nebo syntetického původu jako je například želatina, albumin, agar, alginát sodný, karboxymetylcelulóza, póly· vinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, polyakrylamid apod. Tyto látky zdokonalují migraci barevných štěpných produktů enzymové reakce a zvyšují stejnoměrnost vybarvení indikační části prostředku.Tzv. thickeners are polymeric, water-soluble substances of natural or synthetic origin such as gelatin, albumin, agar, sodium alginate, carboxymethylcellulose, poles · vinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, etc. These substances improve the migration of colored fission products of the enzymatic reaction and means.

Všechny tyto látky jsou v prostředku přítomny v nasákavém nosiči, na nějž se nanesou ve formě roztoku ve vodě, nebo jiných vhodných inertních kapalinách a vysuší. Způsob tohoto nanesení je obecně znám a používán i při výrobě obdobných tzv. reagenčních proužků.All of these substances are present in the composition in an absorbent carrier to which they are applied as a solution in water or other suitable inert liquids and dried. The method of this deposition is generally known and used in the production of similar so-called reagent strips.

Podrobnější složení prostředku dle vynálezu a způsob jeho přípravy vyplývá z níže uvedených příkladů, které popisují několik provedení a ukazují i obecnou použitelnost prostředku pro stanovení různých hydrolas.The more detailed composition of the composition according to the invention and the process for its preparation follow from the examples below, which describe several embodiments and also show the general applicability of the composition for the determination of various hydrolases.

PřikladlHe did

Proužky ke stanoveni alfa-amylasy v módiStrips to determine alpha-amylase in mode

Pruh filtračního papíru Whatman č. 4, široký 40 mm se naimpregnuje následující směsí roztoků a vysuší při teplotě okolo 60 °C:A 40 mm wide Whatman No. 4 filter paper is impregnated with the following mixture of solutions and dried at a temperature of about 60 ° C:

fosfátový tlumič, pH = 7,0, 0,2 mol/1 chlorid sodný 0,2 mol/1 g% etanolový roztok TRITONu X-100 g% roztok kyseliny cholové g% roztok agaruphosphate buffer, pH = 7.0, 0.2 mol / l sodium chloride 0.2 mol / 1 g% TRITON X-100 ethanol solution cholic acid solution g% agar solution

0,5 g% roztok alginátu sodného0.5 g sodium alginate solution

10,0 ml 10,0 ml 2,0 ml 1 ,0 ml 2,5 ml 0,5 ml10.0 ml 10.0 ml 2.0 ml 1.0 ml 2.5 ml 0.5 ml

Současně se na jednu adhezívní stranu oboustranné samolepicí pásky o šíři 20 mm přilepí stejně široký pruh bílé fólie PVC o síle 0,2 mm. Na druhou adhezívní stranu samolepicí pásky se nanese 10 mm široký pás jemně rozetřeného, práškového substrátu a přitlačením fixuje tak, aby po obou stranách tohoto pásu zbyly 5 mm široké proužky volné adhezívní plochy; těmito adhezívními plochami se samolepicí páska s fólií PVC a naneseným barevným substrátem přilepí podélně na pruh naimpregnovaného papíru 6 mm od jeho jednoho podélného okraje. Poté se na druhou stranu naimpregnovaného papíru přilepí - opět pomocí oboustranné samolepicí pásky - fólie PVC, široké 34 mm tak, aby fólie byla vzdálena 6 mm od okraje papíru, stejně jako páska se substrátem. Nakonec se na papír - 6 mm od fólie se substrátemAt the same time, an equally wide strip of 0.2 mm thick white PVC foil is adhered to one adhesive side of double-sided self-adhesive tape of 20 mm width. A 10 mm wide strip of finely divided, powdered substrate is applied to the other adhesive side of the self-adhesive tape and fixed by pressing so that 5 mm wide strips of free adhesive area remain on both sides of the strip; by means of these adhesive surfaces, a self-adhesive tape with a PVC foil and a colored substrate applied is adhered longitudinally to a strip of impregnated paper 6 mm from its one longitudinal edge. Then, on the other side of the impregnated paper, a 34 mm wide PVC foil is glued again with a double-sided self-adhesive tape so that the foil is 6 mm from the edge of the paper as well as the substrate tape. Finally, the paper - 6 mm from the foil with the substrate

- nalepí držák z fólie PVC, široké 48 mm. Celý tento pás se poté příčně nařeže na proužky o šíři 6 mm.- glues 48 mm wide PVC foil holder. The entire strip is then cut transversely into strips of 6 mm width.

Jako substrát je možné použít některou z těchto látek: bramborový škrob s kovalentně navázanou remazolovou brilantní modří R, bramborový škrob s remazolovou brilantní violetí 5R, škrob s ostazinovou modří, škrob s ostazinovou brilantní žlutí H-5Q, škrob s ostazinovou brilantní červení S-5B.Potato starch with covalently bonded remazole brilliant blue R, potato starch with remazol brilliant violet 5R, starch with ostazin blue, starch with ostazin brilliant yellow H-5Q, starch with ostazin brilliant red S-5B .

Použije-li se při přípravě těchto proužků jako substrát bramborový škrob s kovalentně navázanou remazolovou brilantní modří, získají se diagnostické proužky, vhodné ke stanovení aktivity amylasy například v lidské moči. Toto stanovení se provede tak, že se vyčnívající část papíru namočí po dobu 4 až 5 s do vyšetřované moče a proužek se vloží do mikrozkumyvky. Po lOminutové inkubaci se proužek vyjme a krátce namočí - opět vyčnívající částí papíruWhen potato starch with covalently bound remazol brilliant blue is used as a substrate in the preparation of these strips, diagnostic strips suitable for determining amylase activity in, for example, human urine are obtained. This determination is performed by dipping the protruding portion of the paper into the urine to be examined for 4 to 5 seconds and placing the strip in a microtube. After incubation for 10 minutes, the strip is removed and briefly soaked - again by the protruding portion of the paper

- do vyvíjecí kapaliny, složené z 0,4 mol/1 NaOH, k němuž bylo přidáno 0,5 % cetylpyridiniumbromidu. Papírek se poté vrátí do zkumavky a po 5 í 2 minuty vyvíjení se vzniklé modré zbarvení indikační části proužků vyhodnotí buá vizuálně srovnáním se stupnicí nebo fotometricky. Intenzita tohoto zbarvení je přímo úměrná aktivitě alfa-amylasy ve vyšetřované moči v rozsahu 500 až 10 000 U/l.- to a developing liquid composed of 0.4 mol / l NaOH to which 0.5% cetylpyridinium bromide was added. The paper is then returned to the tube and after 5 to 2 minutes developing, the blue color of the indicator portion of the strips is evaluated either visually by comparison with the scale or photometrically. The intensity of this staining is directly proportional to the activity of alpha-amylase in the urine examined in the range of 500 to 10,000 U / l.

Příklad 2Example 2

Proužky ke stanovení aktivity trypsinuStrips for determination of trypsin activity

Proužky se připraví stejným způsobem,jak popsáno v příkladě 1, avšak s použitím impregnačního roztoku o složení:The strips were prepared in the same manner as described in Example 1, but using an impregnating solution of the composition:

Tris-tlumič, 0,2 mol/1, pH~8,0 chlorid sodný, 0,2 mol/1 chlorid vápenatý, 0,2 mol/1 Triton X-100, 2% etanolový roztok agar, 1% vodný roztok alginát sodný, 0,5% vodný roztokTris-buffer, 0.2 mol / l, pH ~ 8.0 sodium chloride, 0.2 mol / l calcium chloride, 0.2 mol / l Triton X-100, 2% ethanol solution agar, 1% aqueous alginate solution sodium, 0.5% aqueous solution

10,0 ml10,0 ml

8.5 ml8.5 ml

2.5 ml 2,0 ml 2,5 ml 0,5 ml ř2.5 ml 2.0 ml 2.5 ml 0.5 ml ř

Jako substrát se použije tzv. OBR-kolagen, tj. kolagen s kovalentně navázanou ostazinovou brilantní červení. Stanovení trypsinu, resp. jeho aktivity se provede stejným způsobem jako stanovení alfa-amylasy, popsané v předešlém příkladě. Indikační část proužku se přitom zbarví růžově až sytě karmínově červeně, přičemž intenzita tohoto zabarvení je úměrná aktivitě trypsinu v rozmezí 100 až t 500 jednotek BAEE/ml ve vyšetřovaném vzorku.The substrate used is so-called OBR-collagen, i.e. collagen with covalently bound ostazine brilliant red. Determination of trypsin, respectively. its activity is performed in the same manner as the alpha-amylase assay described in the previous example. The indicator portion of the strip becomes pink to deep crimson red, the intensity of which is proportional to the trypsin activity in the range of 100 to 500 units of BAEE / ml in the sample to be examined.

Příklad 3Example 3

Proužky ke stanovení aktivity chymotrypsinuStrips for the determination of chymotrypsin activity

Proužky se připraví stejným způsobem jak je popsáno výše, avšak s použitím impregnačního roztoku o složení:The strips are prepared in the same manner as described above but using an impregnating solution of the composition:

Tris tlumič, 0,2 mol/1, ρΗ^δ,Ο chlorid sodný, 0,2 mol/1 chlorid vápenatý, 0,2 mol/1 Triton X-100, 2% etanolový roztok karboxymetylcelulóza, 1% vodný roztok alginát sodný, 0,5% vodný roztokTris buffer, 0.2 mol / l, ρΗ ^ δ, sodný sodium chloride, 0.2 mol / l calcium chloride, 0.2 mol / l Triton X-100, 2% ethanol solution carboxymethylcellulose, 1% aqueous sodium alginate solution 0.5% aqueous solution

10,0 ml10,0 ml

8.5 ml8.5 ml

2.5 ml 2,0 ml 2,5 ml 0,5 ml2.5 ml 2.0 ml 2.5 ml 0.5 ml

Jako substrát se použije nerozpustný komplex kožní prášek-kongočerveň. Stanovení aktivity chymotrypsinu se provede stejným způsobem jako stanovení alfa-amylasy, popsané v příkladě 1.The insoluble skin powder-conglow-red complex is used as the substrate. The chymotrypsin activity is determined in the same manner as the alpha-amylase assay described in Example 1.

Příklad 4Example 4

Proužky pro stanovení aktivity pepsinuPepsin activity strips

Proužky se připraví stejným způsobem jak je popsáno v předešlém příkladě, avšak s použitím impregnačního roztoku obsahujícího tlumič o pH = 2,0. Jako substrát se použije kolagen s kovalentně navázanou remazolovou brilantní violetí 5R. Stanovení aktivity pepsinu pomoci těchto proužků se provede stejně jako stanovení alfa-amylasy popsané v příkladě 1. Indikační část proužku se přitom barví fialově, přičemž dle intenzity tohoto zbarvení lze s poměrně vysokou přesností stanovit aktivitu pepsinu ve vyšetřovacím vzorku.The strips were prepared in the same manner as described in the previous example, but using an impregnating solution containing a buffer of pH = 2.0. Collagen with covalently bonded remazole brilliant violet 5R is used as substrate. The determination of pepsin activity by means of these strips is carried out in the same way as the alpha-amylase assay described in Example 1. The indicator part of the strip is dyed violet and the pepsin activity in the test sample can be determined with relatively high precision according to the intensity of this coloring.

Claims

Method for the analytical determination of hydrolase activity, characterized in that the enzyme solution to be analyzed is applied to a strip of absorbent support and allowed to flow over the reaction part of the support on which the enzyme is applied in water and visually or photometrically evaluated by color colored soluble products released by hydro-. by enzymatic treatment of the enzyme from the insoluble colored substrate and transported by the liquid to the indicator portion of the strip lying downstream of the insoluble substrate portion.

2. Method for the analytical determination of hydrolase activity according to claim 1, characterized in that the hydrolysis being determined is alpha-amylase, cellulose, pectinase, trypsin, ehymotrypsin, pepsin, collagenase, elastase.

3. A composition for the analytical determination of hydrolase activity according to claim 1, characterized in that it consists of a strip of absorbent carrier (1), e.g. filter paper, of an eynt fleece. fibers or a porous polymer impregnated with a buffer of pH 1-10 with known enzyme activators

217302 enzyme activity or stabilizers, cationic, anionic or nonionic type wetting agents and optionally thickeners, such as polyvinylpyrrolldone, polyvinyl alcohol, gelatin or agar, and consisting of the reaction part (1a) on which a water-insoluble colored substrate is applied (2 ), and preferably covered on both sides with sheets of opaque material (4, 4a and 5) attached to the carrier, e.g. by means of an adhesive (3), and in addition to the indicating portion of the carrier (1c) and the exposed end of the carrier (1b).