CS216993B1

CS216993B1 - A method for the quantitative determination of beta-carotene, sum of xanthophylls and pheophytin a

Info

Publication number: CS216993B1
Application number: CS210780A
Authority: CS
Inventors: Pavel Mader; Jarmila Chladova
Original assignee: Pavel Mader; Jarmila Chladova
Priority date: 1980-03-26
Filing date: 1980-03-26
Publication date: 1982-12-31

Abstract

Vynález se týká způsobu kvantitativního stanovení beta-karotenu, sumy xantofylů a feofytinu a. Jeho podstata spočívá v tom, že se rostlinná barviva extrahují z analyzovaného rostlinného materiálu acetonem, načež extrakcí uvolněná barviva se převedou z acetonu do hexanu, heptanu nebo petroléteru a beta-karoten, suma xantofylů a feofytin a se vzájemně chromatograficky oddělí na sloupci polyamidu a jejich množství se stanoví spektrofotometricky. K analýze lže použít Čerstvého, sušeného i fermentovaného rostlinného materiálu, krmiv a krmných směsí používaných v zemědělství. Lze rovněž použít rostlinných surovin a produktů potravinářského a farmaceutického průmyslu (čerstvé a konzervované ovoce, zelenina, ovocné slávy, čerstvé a sušené léčivé rostliny, léčivé čaje). Obsah beta- -karotenu spoluurčuje nutriční hodnotu analyzovaného materiálu. Obsah sumy xantofylů rozhoduje o výsledné pigmentaci živočišných produktů (máslo, žloutky vajec, kůže brojlerů). Obsah feofytinu a poskytuje informaci o kvalitě skladování či technologického zpracování (sušení, fermentace, konzervování) rostlinných surovin.The invention relates to a method for quantitative determination of beta-carotene, sum of xanthophylls and pheophytin a. Its essence lies in the fact that plant dyes are extracted from the analyzed plant material with acetone, after which the dyes released by extraction are transferred from acetone to hexane, heptane or petroleum ether and beta-carotene, sum of xanthophylls and pheophytin a are separated from each other by chromatography on a polyamide column and their amount is determined spectrophotometrically. Fresh, dried and fermented plant material, feed and feed mixtures used in agriculture can be used for analysis. Plant raw materials and products of the food and pharmaceutical industry (fresh and canned fruits, vegetables, fruit juices, fresh and dried medicinal plants, medicinal teas) can also be used. The content of beta-carotene co-determines the nutritional value of the analyzed material. The content of sum of xanthophylls determines the resulting pigmentation of animal products (butter, egg yolks, broiler skin). The content of pheophytin provides information about the quality of storage or technological processing (drying, fermentation, preservation) of plant raw materials.

Description

Vynález se týká metodiky pro kvantitativní stanovení obsahu beta-karotenu, sumy xantofylů a feofytinu a v různých typech rostlinného materiálu.The invention relates to a methodology for the quantitative determination of beta-carotene content, the sum of xanthophylls and pheophytin, and in various types of plant material.

Kvantitativní stanovení karotenů a xantofylů v materiálech rostlinného a živočišného původu vyžaduje obecně následující dílčí kroky:Quantitative determination of carotenes and xanthophylls in materials of plant and animal origin generally requires the following sub-steps:

příprava průměrného vzorku, extrakce pigmentů z průměrného vzorku do polárního rozpouštědla, saponifikace přítomných esterů, převedeni pigmentů z polárního do nepolárního rozpouštědla, chromatografické separace pigmentů a.preparation of an average sample, extraction of pigments from an average sample into a polar solvent, saponification of the esters present, conversion of pigments from a polar to a non - polar solvent, chromatographic separation of pigments and.

kvantitativní stanovení jednotlivých pigmentů nebo jejich skupin.quantitative determination of individual pigments or groups thereof.

V konkrétních případech některé z těchto dílčích kroků odpadají. Nápr. při analýzách vzorků rostlinného původu často odpadá saponifikace přítomných esterů. Při použití tahové techniky chromatografické separace, při které lze na chromatografický nosič nanést pigmenty v polárním rozpouštědle, odpadá nutnost převedení pigmentů z polárního do nepolárního rozpouštědla.In particular cases, some of these sub-steps are omitted. E.g. in the analysis of samples of plant origin, saponification of the esters present is often omitted. By using a tensile chromatographic separation technique in which pigments in a polar solvent can be applied to a chromatographic support, there is no need to transfer pigments from a polar to a non-polar solvent.

Přípravu průměrného vzorku je nutno provést vždy; používají se různé postupy v závislosti na povaze analyzovaného materiálu. K extrakci pigmentů se používá polárních organických rozpouštědel (aceton, metanol, etanol), a to buč samotných, nebo ve směsi s vodou či dalšími organickými rozpouštědly. Saponifikace lipidů (tj. esterů) se provádí pomocí alkoholického roztoku hydroxidu draselného, a to buč dlouhodobě (do 24 hod) při teplotě místnos ti, nebo krátkodobě (desítky minut) při zvýšené teplotě. K převedeni pigmentů z polárního, do nepolárního rozpouštědla se běžně používá děličky, ve které se protřepává směs obsahující polární extrakt, nepolární rozpouštědlo a vodu event. vodný roztok NaCl. Chromatografická separace pigmentů z polárního či nepolárního extraktu se provádí na různých nosičích, často na celulóze (papír, tenká vrstva, sloupec), rovněž často na kysličníku hlinitém nebo silikagelu, a to jak ve formě sloupce, tak tenké vrstvy. Kvantitativní stanovení pigmentů nebo jejich směsí se běžně provádí spektrofotometricky vzhledem k tomu, že se jedná o barevné látky.The preparation of an average sample should always be carried out; different procedures are used depending on the nature of the material analyzed. Polar organic solvents (acetone, methanol, ethanol) are used for extraction of pigments, either alone or mixed with water or other organic solvents. Saponification of lipids (i.e., esters) is carried out using an alcoholic potassium hydroxide solution, either long-term (within 24 hours) at room temperature or briefly (tens of minutes) at elevated temperature. For the conversion of pigments from a polar to a non-polar solvent, a separator is conventionally used in which a mixture comprising a polar extract, a non-polar solvent and water or a mixture is shaken. aqueous NaCl solution. The chromatographic separation of the pigments from the polar or non-polar extract is carried out on various carriers, often on cellulose (paper, thin layer, column), also often on alumina or silica gel, both in the form of a column and a thin layer. Quantitative determination of pigments or mixtures thereof is commonly performed spectrophotometrically as they are colored substances.

Extrakční, separační a determinační postupy pro stanovení beta-karotenu, a xantofylů, doporučované ve světové literatuře, jsou přehledně shrnuty a diskutovány v práci DAVIES, 1976. V ČSSR existuje pro stanovení beta-karotenu státní norma ČSN 46 7007 a ČSN 56 0053· Pro zemědělské oblastní laboratoře vydal v r. 1975 Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (dále ÚKZÚZ) v Praze jednotnou metodiku, která vychází z ČSN 46 7007. Pro stanovení xantofylů a feofytinu a v rostlinném materiálu úřední předpis v ČSSR neexistuje. Postup v současné době předepsaný státní normou a jednotnými předpisy ÚKZÚZ používá pro extrakci pigmentů z rostlinného materiálu alkoholický roztok hydroxidu draselného, pro chromatografickou separaci kysličník hlinitý a pro kvantitativní stanoveni spektrofotometrického vyhodnocení při 450 nm. Všechny tyto tři základní fáze metodiky však vyžadují velký počet doplňkových operací. Tak např. po extrakci pigmentů z rostlinného materiálu alkoholickým roztokem KOH se na rostlinný materiál působí 25% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a dále se znovu několikrát extrahuje organickým rozpouštědlem, konkrétně acetonem, až do úplného odbarvení výluhu. Chromatografickou separaci předchází mnohonásobné přetřepáváni části pigmentů z původního etanolicko-acetonového extraktu do benzinu v děličce, a to nejprve s vodou, pak s etanolickým roztokem hydroxidu draselného, a nakonec opět s vodou.Extraction, separation and determination procedures for the determination of beta-carotene, and xanthophylls recommended in the world literature are summarized and discussed in DAVIES, 1976. In Czechoslovakia, the state standard ČSN 46 7007 and ČSN 56 0053 exists for the determination of beta-carotene. In 1975, the Central Institute for Supervising and Testing in Agriculture (hereinafter ÚKZÚZ) issued a unified methodology based on ČSN 46 7007 for the determination of xanthophylls and pheophytin and in plant material there is no official regulation in Czechoslovakia. The procedure currently prescribed by the state standard and uniform regulations CISTA uses an alcoholic potassium hydroxide solution, aluminum oxide for chromatographic separation and quantitative determination of spectrophotometric evaluation at 450 nm for extraction of pigments from plant material. However, all these three basic phases of the methodology require a large number of complementary operations. For example, after extraction of the pigments from the plant material with an alcoholic KOH solution, the plant material is treated with a 25% aqueous hydrochloric acid solution and further extracted several times with an organic solvent, in particular acetone, until the leachate is completely discolored. Chromatographic separation is preceded by multiple shaking of a portion of the pigments from the original ethanol-acetone extract into the gasoline in the divider, first with water, then with ethanolic potassium hydroxide solution, and finally again with water.

Rovněž u adsorbentu - kysličníku hlinitého - je nutno před naplněním chromatografické kolony upravit jeho aktivitu na 2. stupeň podle Brockmanna, a to dvouhodinovým žíháním při 650 až 700 °C; po vychladnuti se přidají 2 % vody, dokonale se protřepe a ponechá stát do druhého dne, kdy ho lze teprve použít jako nosiče k separaci. Před nanesením benzinového extraktu pigmentů na kolonu je ještě třeba sloupec kysličníku hlinitého převrstvit 1 až 1,5 cm vysokou vrstvou bezvodého síranu sodného. Vlastní eluce beta-karotenu se provádí směsí benzinu a dietyléteru 3:1. Předpis neuvádí, že dietyléter by měl být před použitím zbaven peroxidů, které v něm vznikají po delší době stání a které silně degradují karotenoidy včetně beta-karotenu tvorbou epoxidů (DAVIES 1976). Spektrofotometrické vyhodnocení eluátu vyžaduje kalibrační křivku, kterou je nutno sestavit předem proměřením sady standartních roztoků buď čistého beta-karotenu, nebo dvojchromanu draselného.Also for the adsorbent - alumina - it is necessary to adjust its activity to the Brockmann stage 2 by annealing at 650 to 700 ° C for two hours before loading the chromatographic column; After cooling, 2% of water is added, shaken perfectly and allowed to stand until the next day when it can only be used as a carrier for separation. Prior to applying the gasoline pigment extract to the column, the alumina column had to be overlaid with a 1 to 1.5 cm high anhydrous sodium sulfate layer. The elution of beta-carotene is carried out with a 3: 1 mixture of petrol and diethyl ether. The Regulation does not state that diethyl ether should be free from peroxides which are formed after prolonged standing and which severely degrade carotenoids including beta-carotene by epoxide formation before use (DAVIES 1976). The spectrophotometric evaluation of the eluate requires a calibration curve, which must be prepared in advance by measuring a set of standard solutions of either pure beta-carotene or potassium dichromate.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že se rostlinná barviva extrahují acetonem, načež extrakcí uvolněná barviva se převedou z acetonu do hexanu, heptanu nebo petroléteru a beta-karoten, suma xantofylů a feofytin a se vzájemně chromatograficky oddělí na sloupci polyamidu a jejich množství se stanoví spektrofotometricky.SUMMARY OF THE INVENTION The plant dyes are extracted with acetone, whereupon the dyes released by extraction are transferred from acetone to hexane, heptane or petroleum ether and beta-carotene, the sum of xanthophylls and pheophytins and separated by chromatography on a polyamide column and quantified spectrophotometrically .

V porovnání s dosavadním postupem, který je v ČSSR v současné době předepsán státní normou a jednotnými předpisy ŮKZÚZ, modifikuje navrhovaný postup dílčí kroky převedení pigmentů z polárního do nepolárního rozpouštědla, dále chromatografické separace pigmentů, a konečně kvantitativního stanovení jednotlivých pigmentů a jejich skupin.Compared with the current procedure, which is currently prescribed in the CSSR by the state standard and unified regulations, the proposed procedure modifies the partial steps of transfer of pigments from polar to non-polar solvent, further chromatographic separation of pigments, and finally quantitative determination of individual pigments and their groups.

Při převedení pigmentů z polárního do nepolárního rozpouštědla je dosavadní způsob, spočívající v opatrném krouženi směsi acetonového extraktu pigmentů s nepolárním rozpouštědlem a vodou v dělicí nálevce, nahrazen potupeni, při kterém se tato směs intenzivně promíchá v kádince na elektromagnetické míchačce a vodně acetonová zóna se odsaje. Voda je přitom nahrazena nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Při chromatografické separaci pigmentů je chromatografický materiál (kysličník hlinitý) nahrazen polyamidem. Separace se provádí za atmosférického tlaku. Při kvantitativním stanovení jednotlivých pigmentů nebo jejích skupin je dosavadní postup, který spočívá v sestrojení kalibrační křivky a v případě použití čistého beta-karotenu jako standartu rovněž ve spektrofotometrickém ověření jeho účinností, nahrazen postupem, při kterém je obsah beta-karotenu vypočten přímo z naměřené hodnoty absorbance. Navrhovaný postup umožňuje navíc kvantitativně stanovit i celkový obsah xantofylů a v případě, že je přítomen, i feofytinu a.When transferring pigments from a polar to a non-polar solvent, the prior art method of carefully circulating a mixture of acetone extract of pigments with a non-polar solvent and water in a separating funnel is replaced by an abrasion in which the mixture is vigorously mixed in a beaker on an electromagnetic mixer. . The water is replaced by a saturated aqueous solution of sodium chloride. In the chromatographic separation of pigments, the chromatographic material (alumina) is replaced by polyamide. The separation is carried out at atmospheric pressure. In the quantitative determination of individual pigments or their groups, the previous procedure, which consists of constructing a calibration curve and, in the case of using pure beta-carotene as a standard also in spectrophotometric verification of its efficiency, is replaced by a procedure where the beta-carotene content is calculated directly from the measured value absorbance. In addition, the proposed procedure makes it possible to quantitatively determine the total xanthophylls content and, if present, the pheophytin a.

K přesně odváženému množství analyzovaného materiálu (asi 0,5 g u vitaminozních mouček, asi 1 g u úsušků, asi 2 g u čerstvého rostlinného materiálu a krmných směsí, asi 5 g u senáže a siláže) se v třecí misce přidá malé množství uhličitanu horečnatého a mořského písku a přelije se asi 10 ml acetonu. U suchých vzorků je extrakce usnadněna předchozí několikahodinovou macerací odváženého vzorku s vodou nebo se směsí voda + aceton (1:1) při teplotě místnosti. Po důkladném rozetření se acetonový extrakt vpraví na skleněnou fritu S3 a pod vakuem prosaje do odsávací baňky. K pevnému zbytku ve třecí misce se přidá dalších asi 10 ml acetonu a postup se ještě jednou nebo víckrát opakuje až do úplného odbarvení pevného zbytku. Po posledním roztírání se na fritu vpraví i pevný zbytek, třecí miska se vypláchne malým množstvím acetonu, který se rovněž vpraví na fritu, a extrakt se prosaje do banky.To the accurately weighed amount of material analyzed (about 0,5 g of vitamin meal, about 1 g of dry matter, about 2 g of fresh plant material and compound feed, about 5 g of silage and silage), add a small amount of magnesium carbonate and sea sand in a mortar; Pour about 10 ml of acetone. For dry samples, extraction is facilitated by prior maceration of the weighed sample for several hours with water or water / acetone (1: 1) at room temperature. After thoroughly trituration, the acetone extract is applied to a glass frit S3 and sieved under vacuum to a suction flask. Approximately 10 ml of acetone is added to the solid residue in the mortar and the process is repeated one or more times until the solid residue is completely discolored. After the last spreading, a solid residue is injected on the frit, the mortar is rinsed with a small amount of acetone, which is also injected on the frit, and the extract is sieved into a flask.

K acetonovému extraktu se v kádince přidá třetina objemu hexanu a dvojnásobný objem nasyceného vodného roztoku chloridu sodného NaCl. Vzniklá těžká emulze se několik minut (5 min) intenzivně míchá na elektromagnetické míchačce. Po vypnutí míchačky se ze střičky nebo injekční stříkačky pomalu přidává za současného přerušovaného mírného promíchávání směsi destilovaná voda tak dlouho, až se vypadlý chlorid sočný NaCl téměř rozpustí. Pomocí injekční stříkačky se spodní vodně-acetonová zóna odsaje, k hexan-acetonové zóně se znovu přidá nasycený roztok NaCl a celý postup se opakuje. Hexanový extrakt se pak zbaví posledních stop acetonu promytím samotnou destilovanou vodou. Po odsátí vody se hexanový extrakt přelije do kalibrované zkumavky a odečte se jeho objem a v ml.To the acetone extract was added a third volume of hexane in a beaker and twice the volume of saturated aqueous sodium chloride solution. The resulting heavy emulsion was vigorously stirred on an electromagnetic mixer for several minutes (5 min). After the mixer has been switched off, distilled water is slowly added from the syringe or syringe with intermittent gentle stirring until the precipitated NaCl is almost dissolved. The lower water-acetone zone is aspirated with a syringe, saturated NaCl solution is added to the hexane-acetone zone and the procedure is repeated. The hexane extract is then freed of the last traces of acetone by washing with distilled water alone. After aspiration of the water, the hexane extract is poured into a calibrated tube and its volume is read in ml.

Chromatografická kyveta o vnitřních rozměrech 10 x 100 mm, dole zúžené na rozměr 4 x 40 mm, se utěsní kouskem vaty, zvlhčeným hexanem, a naplní se řídkou kaší polyamidu v. hexanu. Sloupec polyamidu po jeho úplné sedimentaci má mít výšku 30 až 40 mm. Ihned po vsáknutí hexanu se na sloupec nanese alikvot hexanového extraktu pigmentů o objemu b ml.A 10 x 100 mm internal tube, tapered down to 4 x 40 mm, is sealed with a cotton swab moistened with hexane and filled with a thin slurry of polyamide in hexane. After complete sedimentation, the polyamide column should have a height of 30 to 40 mm. Immediately after the hexane was soaked, a b ml aliquot of hexane extract of pigments was applied to the column.

Po jeho vsáknutí do kolony se kolona promývá hexanem až do úplného vymytí karotenů, které se jímají do kalibrované zkumavky. Výsledný objem hexanového eluátu karotenů je y ml. Na spektrofotometru se pak proměří absorbance tohoto eluétu v 1 cm silné kyvetě při vlnové délce 45' nm. Obsah beta-karotenu v analyzovaném materiálu se vypočte ze vzorceAfter it has been soaked in the column, the column is washed with hexane until the carotenes that are collected in a calibrated tube are completely washed out. The final volume of carotene hexane eluate is γ ml. The absorbance of this eluate was then measured on a spectrophotometer in a 1 cm thick cell at 45 nm. The beta-carotene content of the analyzed material is calculated from the formula

3,86 . a . y . A^^3.86. a. y. A ^^

K = ->K = ->

N . b kde K je obsah beta-karotenu v mg.kg“', N je navážka analyzovaného materiálu v g, a ^Ai₅?^mje absorbance hexanového eluátu karotenů v 1 cm silné kyvetě při 451 nm.N. b where K is the beta-carotene content in mg.kg “', N is the weight of the analyzed material in g, and ^A i ₅ ? ^m is the absorbance of the hexane eluate of carotenes in a 1 cm thick cell at 451 nm.

Konstanta 3,86 zahrnuje hodnotu specifického absorbančního koeficientu beta-karotenu v hexanu, aJ - 2,59 při 45i nm a převodní koeficient pro navážku analyzovaného materiálu.The 3.86 constant includes the value of the specific absorbance coefficient of beta-carotene in hexane, α-2.59 at 45 nm and the conversion coefficient for the weighed material.

Princip stanovení sumy xantofylů spočívá v tom, že se po vymytí karotenů z kolony vymyjí z kolony i xantofyly směsí hexanu s benzenem. Kolona se po vymytí karotenů převrství 0,5 až 1 ml směsi 5% benzenu v hexanu. Tento postup se několikrát opakuje, avšak obsah benzenu v promývací směsi se postupně zvyšuje (10%, 20%, 30%) až na konečnou hodnotu 50%, Kterou se kolona promývá až do úplného vymytí xantofylů. Hexart-benzenový eluát xantofylů se jímá do kalibrované zkumavky a stanoví se jeho objem z v. ml. Na spektrofotometru se proměří absorbance tohoto eluátu při vlnové délce 447 nm. Obsah sumy xantofylů v analyzovaném materiálu se vypočte ze vzorceThe principle of determining the sum of xanthophylls is that after washing the carotenes from the column, the xanthophylls are also washed out of the column with a mixture of hexane and benzene. 0.5-1 ml of a 5% benzene / hexane mixture was applied to the column after washing the carotenes. This procedure is repeated several times, but the benzene content of the wash mixture is gradually increased (10%, 20%, 30%) to a final value of 50%, which is washed until the xanthophylls are completely eluted. Collect the hexan-benzene eluate of xanthophylls into a calibrated tube and determine its volume in ml. The absorbance of this eluate is measured on a spectrophotometer at 447 nm. The sum of xanthophylls in the analyzed material is calculated from the formula

4,06 . a . z . a’^“4.06. a. of . and '

X = -1X = -1

N . b kde X je obsah sumy xantofylů v mg.kg“' , N je navážka analyzovaného materiálu v g a Α^γ“ je absorbance hexan-benzenového eluátu xantofylů v 1 cm silné kyvetě při 447 nm. Konstanta 4,06 v sobě zahrnuje hodnotu specifického absorbančního koeficientu pro směs xantofylů v eluční směsi hexan + benzen (4:1), A^ - 2,46 při 447 nm a převodní koeficient pro navážku analyzovaného materiálu.N. b where X is the sum of xanthophyll sums in mg.kg “', N is the weight of the analyzed material in g and Α ^ γ“ is the absorbance of the xanthophyll hexane-benzene eluate in a 1 cm thick cell at 447 nm. The 4.06 constant includes the value of the specific absorbance coefficient for the xanthophyll mixture in the hexane + benzene (4: 1) eluent, λ-2.46 at 447 nm and the conversion coefficient for weighing the analyzed material.

Princip stanovení feofytinu a spočívá v tom, že kolona se po nanesení hexanového extraktu pigmentů promývá směsí hexanu s benzenem do okamžiku, kdy z kolony začnou vytékat xantofyly. Kolona se po vsáknutí hexanového extraktu pigmentů převrství 0,5 až 1 ml směsi 5% benzenu v hexanu. Tento postup se několikrát opakuje, avšak obsah benzenu v promývací směsi se postupně zvyšuje (10%, 20%) až na konečnou hodnotu 30%, kterou se kolona promývá až do počátku eluce xantofylů. Hexan-benzenový eluát feofytinu a, který obsahuje rovněž beta-karoten a část xantofylů, se jímá do kalibrované zkumavky a stanoví se jeho objem f v ml. Na spektrofotometru se proměří absorbance tohoto eluátu při vínové délce 667 nm. Obsah feofytinu a v analyzovaném materiálu se vypočte ze vzorceThe principle of the pheophytin determination is that after application of the hexane extract of pigments, the column is washed with a mixture of hexane and benzene until xanthophylls start to flow out of the column. The column was overcoated with 0.5-1 ml of 5% benzene in hexane after soaking the hexane pigment extract. This procedure is repeated several times, but the benzene content of the wash mixture is gradually increased (10%, 20%) to a final value of 30%, which is washed until the xanthophyll elution begins. Pheophytin α hexane-benzene eluate, which also contains beta-carotene and a portion of xanthophylls, is collected in a calibrated tube and its volume f is determined in ml. The absorbance of this eluate is measured on a spectrophotometer at a wavelength of 667 nm. The content of pheophytin a in the analyzed material is calculated from the formula

17,86 . a . f . A|₆=^m 17.86. a. f. A | ₆ = ^m

Fa = -’Fa = - ’

N . b kde Fa je obsah feofytinu a v mg.kg“' , N je navážka analyzovaného materiálu v g a je absorbance hexan-benzenového eluátu feofytinu a, obsahujícího rovněž beta-karoten a část xantofylů, v 1 cm silné kyvetě při 667 nm. Konstanta 17,86 v sobě zahrnuje hodnotu specific kého absorbančního koeficientu feofytinu a, aJ - o, 56 při 667 nm a převodní koeficient pro navážku analyzovaného materiálu.N. b where Fa is the phaeophytin content a in mg.kg -1, N is the weight of the analyzed material in g and is the absorbance of the pheophytin α hexane-benzene eluate, also containing beta-carotene and a portion of xanthophylls, in a 1 cm thick cell at 667 nm. The constant 17.86 includes the value of the specific absorbance coefficient of pheophytin α, λ - δ, 56 at 667 nm and the conversion coefficient for weighing the analyzed material.

Hexan je možno při stanovení obsahu beta-karotenu, sumy xantofylů i feofytinu a nahradit heptanem nebo petroléterem.Hexane can be replaced by heptane or petroleum ether when determining the beta-carotene content, the sum of xanthophylls and pheophytin.

2!69936993

Výhody navrhovaného způsobu spočívají v tom, že intenzivním promícháním směsi acetonového extraktu pigmentů s nepolárním rozpouštědlem a nasyceným roztokem chloridu sodného NaCl se docílí mnohem účinnějšího a rychlejšího převedení acetonu do vodní fáze, bez nebezpečí tvorby emulze. Odstranění vodně-acetonové fáze odsátím podstatně snižuje ztráty pigmen tů. Celý postup se provádí v otevřené nádobě a tím odpadá nutnost častého odvzdušňování, což usnadňuje převedení pigmentů z polárního do nepolárního rozpouštědla. Přítomnost chloridu sodného ve vodě značně zkvalitňuje separaci obou oddělených zón; množství chloridu sodného, které vypadne z roztoku po promíchání směsi přitom indikuje množství acetonu dosud přítomného v nepolárním rozpouštědle. Tento vypadlý chlorid sodný je možno znovu rozpustit opatrným přidáváním destilované vody k vodně acetonové zóně. Tím se dále posune termodynar mická rovnováha rozděleni acetonu mezi obě vzájemně nemísitelná rozpouštědla - vodu a nepolární rozpouštědlo - v příznivém směru.Advantages of the proposed method are that by vigorously mixing a mixture of acetone pigment extract with a non-polar solvent and a saturated sodium chloride solution, a much more efficient and faster conversion of acetone into the aqueous phase is achieved without the risk of emulsion formation. Removal of the water-acetone phase by suction significantly reduces pigment losses. The entire process is carried out in an open container, eliminating the need for frequent venting, which facilitates the transfer of pigments from a polar to a non-polar solvent. The presence of sodium chloride in water greatly improves the separation of the two separate zones; the amount of sodium chloride that falls out of solution after mixing the mixture indicates the amount of acetone still present in the non-polar solvent. This precipitated sodium chloride can be redissolved by carefully adding distilled water to the aqueous acetone zone. This further shifts the thermodynamic balance of the acetone distribution between the two immiscible solvents - water and a non-polar solvent - in a favorable direction.

Náhradou kysličníku hlinitého polyamidem se docílí kvalitnějšího oddělení karotenů od ostatních pigmentů vzhledem k tomu, že při promývání kolony nepolárním rozpouštědlem jsou karoteny jedinými fotosyntetickými pigmenty, které se pohybují, kdežto všechny ostatní foto syntetické pigmenty zůstávají na vstupu kolony. Polyamid má navíc mnohem nižší aktivitu než kysličník hlinitý a při jeho použití je tedy mnohem menší nebezpečí přesmyků a jiných degradačních procesů karotenoidů v průběhu vlastní chromatografické separace. K úplnému vymytí karotenů z polyamidové kolony dojde již za 2 až 3 minuty, tedy mnohem dříve, než na kysličníku hlinitém. Objem činidla, potřebného k vymytí karotenů z polyamidové kolony, je mnohem nižší, než v případě kolony z kysličníku hlinitého.By replacing alumina with polyamide, better separation of carotenes from other pigments is achieved, since when washing the column with a non-polar solvent, carotenes are the only photosynthetic pigments that move while all other photo synthetic pigments remain at the column inlet. In addition, polyamide has a much lower activity than alumina, and there is therefore much less risk of rearrangements and other degradation processes of carotenoids during chromatographic separation. Carotenes are completely washed out of the polyamide column in 2 to 3 minutes, much earlier than on alumina. The volume of reagent needed to elute the carotenes from the polyamide column is much lower than that of the alumina column.

Náhradou kysličníku hlinitého polyamidem se docílí též možnosti snadno stanovit celkový obsah xantofylů v analyzovaném materiálu, vzhledem k tomu, že na polyamidu migrují xanto Tyly v jediné společné zóně. Je rovněž nožné snadno stanovit obsah feofytinu a u vzorků, které tento degradační produkt chlorofylu a obsahují.By replacing alumina with polyamide, it is also possible to easily determine the total xanthophyll content of the analyzed material, since xanto Tyles migrate to polyamide in a single common zone. It is also easy to determine the pheophytin content of samples containing this degradation product of chlorophyll.

Náhradou kysličníku hlinitého polyamidem se docílí možnosti pracovat při atmosférickém tlaku, což snižuje nároky na aparaturu a zvyšuje bezpečnost práce.By replacing alumina with polyamide, it is possible to work at atmospheric pressure, which reduces equipment requirements and increases work safety.

Ve svém souhrnu navrhovaný postup předčí dosavadní postup také v tom, že celková spotřeba chemikálií je mnohem menší, aktivitu polyamidu není nutno nijak upravovat a odpadá i nutnost provedeni některých dílčích operací (ověření kvality benzinu na přítomnost dehtovítých látek; přečištění chloroformu k odstranění chlorovodíku; destilace dietyléteru se sodíkem k odstranění peroxidů; práce se silnými louhy a kyselinami).In summary, the proposed process also outperforms the previous process in that the total consumption of chemicals is much lower, there is no need to modify the polyamide activity, and there is no need to perform some partial operations (checking the quality of gasoline for tars; purification of chloroform to remove hydrogen chloride; diethyl ether with sodium to remove peroxides; work with strong lyes and acids).

Na připojeném výkresu je znázorněn příklad provedení sloupcové chromatografie hexanového extraktu pigmentů z úsušku vojtěšky, provedené navrhovaným postupem. Křivka j. na výkresu představuje průběh eluce beta-karotenu, který vytekl z kolony při jejím promývání hexanem. Křivka 2 na výkresu představuje průběh eluce feofytinu a, který vytéká z kolony při jejím promývání hexanem a později směsí hexanu s benzenem (5 až 30 °h benzenu). Křivka 2 na výkresu představuje průběh eluce xantofylů, které vytékají z kolony při jejím promývání směsi hexanu s benzenem (30 až 50 % benzenu). Křivka 4 na výkresu představuje průběh eluce chlorofylů a a b, ktere vytékají z kolony při jejím promývání acetonem. Hodnoty na ose x značí celkový objem elučního činidla, resp. činidel v ml, hodnoty na ose y absorbanci. příslušných eluátů v 1 cm silné kyvetě. V případě beta-karotenu a xantofylů byla tato absorban ce měřena při vlnové délce 451 , resp. 447 nm, u feofytinu a a chlorofylů a a b při vlnové délce jejich červeného absorpčního maxima (663 až 667 nm).The accompanying drawing shows an exemplary column chromatography of hexane extract of alfalfa pigments carried out by the proposed process. The curve j in the drawing represents the course of the elution of beta-carotene which escaped from the column as it was washed with hexane. The curve 2 in the drawing represents the course of elution of pheophytin α which flows out of the column as it is washed with hexane and later with a mixture of hexane and benzene (5 to 30 ° h of benzene). Curve 2 in the drawing shows the elution pattern of xanthophylls that flow out of the column as it elutes with a mixture of hexane and benzene (30 to 50% benzene). The curve 4 in the drawing represents the course of elution of chlorophylls a and b that flow out of the column as it is washed with acetone. Values on the x-axis indicate the total volume of the eluent, respectively. reagents in ml, values on the y-axis absorbance. of appropriate eluates in a 1 cm thick cuvette. In the case of beta-carotene and xanthophylls, this absorbance was measured at 451 resp. 447 nm, for pheophytins a and chlorophylls a and b at the wavelength of their red absorption maximum (663 to 667 nm).

Stanovení obsahu beta-karotenu, sumy xantofylů a feofytinu a je možno využít ke kvalitativní i kvantitativní charakteristice materiálů rostlinného původu. Obsah beta-karotenu a sumy xantofylů ve tkáni zelených rostlin doplňuje informace o složení a funkční aktivitě fotosyntetického aparátu, na níž závisí tvorba biomasy. Množství těchto pigmentů je rovněž ukazatelem dynamiky ontogenetického vývoje analyzovaného orgánu nebo rostliny. Obsah beta-karotenu ve tkáni zelených rostlin je navíc vhodným indikátorem stavu dusíkaté výživy těchto rostlin. Obsah beta-karotenu v čerstvé a konzervované píci je vzhledem k provitaminové aktivitě beta-karotenu (vitamin A) jedním z důležitých ukazatelů celkové nutriční hodnoty píce. Obsah beta-karotenu a sumy xantofylů v krmivech rozhoduje o výsledné pigmentaci mnoha živočišných produktů (máslo, vaječné žloutky, kůže brojlerů apod.). Obsah feofytinu a v materiálech rostlinného původu je ukazatelem kvality jeho technologického zpracování a skladování. Vedle nutriční hodnoty je obsah beta-karotenu, sumy xantofylů a nepřímo i feofytinu a v zemědělských produktech významný i pro jejich tržní hodnotu.Determination of beta-carotene content, sum of xanthophylls and pheophytin and can be used for qualitative and quantitative characterization of materials of plant origin. The content of beta-carotene and the sum of xanthophylls in green plant tissue complements the information on the composition and functional activity of the photosynthetic apparatus on which biomass production depends. The amount of these pigments is also an indicator of the dynamics of the ontogenetic development of the organ or plant being analyzed. In addition, beta-carotene content in green plant tissue is a suitable indicator of the nutritional status of these plants. The content of beta-carotene in fresh and preserved forage is one of the important indicators of the total nutritional value of forage due to the provitamin activity of beta-carotene (vitamin A). The content of beta-carotene and the sum of xanthophylls in feed determines the resulting pigmentation of many animal products (butter, egg yolks, broiler skin, etc.). The content of pheophytin and in materials of plant origin is an indicator of the quality of its technological processing and storage. In addition to the nutritional value, the content of beta-carotene, the sum of xanthophylls and indirectly also of pheophytin and in agricultural products are also important for their market value.

Claims

Method for the quantitative determination of beta-carotene, sum of xanthophylls and pheophytin and characterized in that the plant dyes are extracted with acetone, after which the extracted dyes are transferred from acetone to hexane, heptane or petroleum ether and beta-carotene, sum of xanthophylls and pheophytins. They were separated on a polyamide column and their amount was determined by spectrophotometry.