CS216762B1

CS216762B1 - A method for the fermentation of L-lysine

Info

Publication number: CS216762B1
Application number: CS311581A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Smekal; Vladimir Bulant; Jaromir Pirko; Zdenek Grunt; Vladimir Rousal
Original assignee: Frantisek Smekal; Vladimir Bulant; Jaromir Pirko; Zdenek Grunt; Vladimir Rousal
Priority date: 1981-04-25
Filing date: 1981-04-25
Publication date: 1982-11-26

Abstract

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy L-lysinu kultivací produkčních mikroorganismů Brevibacterium flavum nebo Corynebacterium, za submerzních podmínek, S použitím kyselého hydrolyzátu odpadních zemědělských surovin nebo sušeného mléka nebo krmného droždí jako zdroje esenciálních aminokyselin, nezbytných pro růst mikroorganismu.The invention relates to a method for the fermentation preparation of L-lysine by cultivating the production microorganisms Brevibacterium flavum or Corynebacterium, under submerged conditions, using an acidic hydrolyzate of waste agricultural raw materials or powdered milk or feed yeast as a source of essential amino acids necessary for the growth of the microorganism.

Description

Vynález ee týká způsobu fermentační přípravy L-lysinu, a to kultivací produkčních mikroorganismů kmenů Brevibacterium flavum nebo Corynebacterium glutamicum v tekuté živné půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli, vitaminy a další biofaktory, za submerzních podmínek.The invention relates to a process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing production microorganisms of strains of Brevibacterium flavum or Corynebacterium glutamicum in a liquid culture medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrient salts, vitamins and other biofactors under submerged conditions.

Fermentační příprava L-lysinu pomocí produkčních mutant Brevibecterium flavum a Corynebacterium glutamicum je známa z mnoha literárních údejů, zejména z pat. spisů, kde bylo popsáno použití různých médií, lišících se většinou jen kvantitativními poměry mezi uhlíkatou a dusíkatou složkou, které zabezpečují růst mikroorganismů. Tak je například popsán fermentační ppůsob přípravy L-lysinu pomocí kmenů Corynebacterium glutamicum s použitím hydrolyzátu extrahované bílkoviny sojové nebo arašídové mouky /americké pat.spisy č. 3 535 831 a 3 687 810/. Při dalším způsobu se používá jako komplexního zdroje dusíku tzv. NZ-aminu /švýcarský pat.spis č. 515 77/. Jsko další vhodné komplexní zdroje dusíku jsou uváděny například krevní moučka, odpady po zpracování masa, rybí moučka apod/americký pat. spis č. 3 595 751; australský pat. spis č. 432 304/. Produkční kmeny mikroorganismů flavum a Corynebacterium glutamicum jsou většinou auxotrofní mutanty, vyžadující k růstu homoserin nebo threonin a methionin, některé leucin, a dále se vyznačují rezistencí k analogům aminokyselin, jak je charakteristické pro regulační mutanty. Proto jako zdroj aminokyselin, nezbytných pro růst mikroorganismů, byl výhradně používán hydrolyzát komplexního zdroje dusíku, představovaného arašídovou moukou. Tato surovina je z ekonomického hlediska málo výhodné a proto se objevovaly snahy nahradit ji surovinou nebo surovinami levnějšími a snadno dostupnými..The fermentative preparation of L-lysine by producing mutants of Brevibecterium flavum and Corynebacterium glutamicum is known from many literature, especially from U.S. Pat. The use of various media has been described, differing mostly only in quantitative ratios between the carbonaceous and nitrogenous components, which ensure the growth of microorganisms. Thus, for example, a fermentation process for the preparation of L-lysine using Corynebacterium glutamicum strains using a soy or peanut flour protein hydrolyzate (U.S. Pat. Nos. 3,535,831 and 3,687,810) is described. In another method, the so-called NZ-amine is used as a complex nitrogen source (Swiss Patent Specification No. 515 77). Other suitable complex sources of nitrogen include, for example, blood meal, meat waste, fish meal and the like. No. 3,595,751; Australian Pat. No. 432,304]. The production strains of flavum and Corynebacterium glutamicum are mostly auxotrophic mutants requiring homoserine or threonine and methionine, some leucine to grow, and further characterized by resistance to amino acid analogs as characteristic of regulatory mutants. Therefore, the hydrolyzate of the complex nitrogen source represented by peanut flour was exclusively used as a source of amino acids necessary for the growth of microorganisms. This raw material is economically inadequate and therefore there have been efforts to replace it with raw material or raw materials cheaper and readily available.

Výhodný, snadno dostupný a levný komplexní zdroj aaimilovatelného dusíku byl nalezen v hydrolyzátech různých odpadních zemědělských surovin rostlinného původu, jako jsou šroty olejní například řepkový, bavlníkový nebo lněný, popřípadě výrobků potravinářského průmyslu, jako je sušené odtučněné mléko nebo krmqé droždí. Tyto suroviny se zpracovávají takto: ke 450 g výchozího materiálu se přidá 600 ml vody a 60 ml konc. kyseliny sírové, rozmíchá se a směs se nechá stát při teplotě místnosti 6 až 8 h. Potom se teto směs zahřívá v uzavřené nádobě 3 až 4 h na 120 °C, po vychladnutí se zfiltruje a ve filtrátu se stanoví obsah celkového dusíku, který činí 7 až 8 % hmotn. V této formě ae hydrolyzát používá jako součást fermentačních půd, jsko komplexní zdroj dusíku.A convenient, readily available and inexpensive complex source of and assimilable nitrogen has been found in hydrolysates of various waste agricultural raw materials of vegetable origin, such as oil meal, for example rapeseed, cotton or linseed, or food industry products such as skimmed milk powder or yeast. The raw materials are treated as follows: 600 ml of water and 60 ml conc. sulfuric acid, stirred and allowed to stand at room temperature for 6 to 8 hours. The mixture is then heated in a sealed vessel for 3 to 4 hours at 120 ° C, filtered and cooled to determine the total nitrogen content of the filtrate. 7 to 8 wt. In this form, the hydrolyzate uses as part of the fermentation broths a complex nitrogen source.

V následující tabulce jsou uvedena množství threoninu a methioninu v různých typech hydrolyzátů, získaných výše popsaným postupem /v mg/ml hydrolyzátu/:The following table lists the amounts of threonine and methionine in the different types of hydrolyzates obtained as described above (in mg / ml hydrolyzate):

Amino- Amino- Řepkový Rapeseed Bavlníkový Cotton Krmné Feeding Lněný Linen Arašídové Peanut Sušené Dried kyselina acid šrot scrap šrot scrap droždí yeast šrot scrap mouka flour mléko milk threonin threonine 1,31 1.31 0,74 0.74 0,83 0.83 0,90 0.90 0,70 0.70 0,83 0.83 methionin methionine 0.76 0.76 0.74 0.74 0.44 0.44 0.52 0.52 ..... 0.57 ..... 0.57 1.34 1.34 Celkem Total 2,07 2.07 1,48 1.48 1,27 1,27 1,42 1.42 1,27 1,27 2,17 2.17

Popsané suroviny jsou uvedeny pouze jako příklad bez limitujícího významu. Jsou samozřejmě použitelné i další, pokud jejich hydrolyzáty, připravené výše popsaným způsobem, svými vlastnostmi vyhovují požadavkům pro komplexní zdroj dusíku a pokud se neprojevuje nějaký nepříznivý vliv na průběh fermentace a na dosažené výtěžky L-lysinu.The raw materials described are given by way of example only, without limitation. Of course, others can be used as long as their hydrolysates, prepared as described above, meet the requirements for a complex nitrogen source and do not adversely affect the fermentation process and the yields of L-lysine achieved.

předmětem vynálezu je tedy způsob fermentační přípravy L-lysinu kultivací produkčních mikroorganismů kmenů Brevibacterium flavum nebo Corynebacterium glutamicum v tekuté živné půdě obsahující zdroje aeimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli, vitaminy a další biofaktory, za aubmerzních podmínek, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivace provádí v živné půdě, obsahující jako zdroj esenciálních aminokyselin, nezbytných pro růst mikroorganismu, kyselý hydrolyzát odpadních zemědělských surovin rostlinného původu, jako jsou šroty olejnin, zejména řepkový, bavlníkový nebo lněný šrot, nebo výrobků potravinářského průmyslu, zejména sušeného odtučněného mléka nebo krmného droždí, obsahující 7 až 8 % hmotn. celkového dusíku, v množství 10 sž 30 % obj., vztaženo na objem živné půdy.Accordingly, the present invention provides a process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing the production microorganisms of the strains of Brevibacterium flavum or Corynebacterium glutamicum in a liquid nutrient medium containing sources of aealable carbon and nitrogen, mineral nutrient salts, vitamins and other biofactors. in that the cultivation is carried out in a culture medium containing, as a source of essential amino acids necessary for the growth of the microorganism, an acid hydrolyzate of waste agricultural raw materials of vegetable origin, such as oilseed meal, in particular rapeseed, cotton or linseed meal; % milk or feed yeast, containing 7 to 8 wt. % of total nitrogen, in an amount of 10 to 30% by volume, based on the volume of culture medium.

Jak vyplývá z údajů v uvedené tabulce, jsou hydrolyzáty z jednotlivých surovin více než rovnocennými zdroji threoninu a methioninu ve srovnání se standardně užívaným hydrolyzátem arašídové mouky. Rovněž výtěžky L-lyainu, samozřejmě v závislosti na použitém produkčním kmeni, jsou uspokojující, bez větších výkyvů.As shown in the table, hydrolyzates from individual raw materials are more than equivalent sources of threonine and methionine compared to the standard peanut flour hydrolyzate. Also, yields of L-lyaine, of course depending on the production strain used, are satisfactory, without major fluctuations.

Způsob podle vynálezu představuje tedy významnou ekonomizaci fermentační výroby L-lysinu. Sližší podrobnosti vyplývají z příkladů podle vynálezu, které způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.The process according to the invention thus represents a significant economization of the fermentation production of L-lysine. The details of the invention are illustrated in more detail by way of example only, but not by way of illustration.

Příklad 1Example 1

Produkčním kmenem Brevibacterium flavum, který vyžaduje k růstu homoserin a který je rezistentní vůči S-aminoethyl-L-oysteinu, se zaočkuje 50 ml inokulačního médie, umístěného v 500 ml varné baňce, jež má toto složení: sacharosa techn. 30 g, octěn sodný kryst. 20 g, kukuřičný extrakt /60 % hmotn. sušiny/ 30 g, voda do 1000 ml. Po zaočkování se dále kultivuje na rotační třepačce /240 ot/min/ při teplotě 29 °C po dobu 18 až 24 h. Vyrostlou kulturou se v množství 10 % obj. zaočkuje 20 ml fermentačního měéía, umístěného v 500 ml varné baňce, jež má toto složení: sacharosa techn. 180 g, hydrolyzát bávlníkové mouky nebo šrotu 200 ml, kukuřičný extrakt /60 % hmotn. sušiny/ 10 g, síran amonný kryst. 1 g, fosforečnan draselný sek. 1 g, síran hořečnatý kryst. 0,1 g, uhličitan vápenetý mletý 30 g, voda do 1000 ml; pH media po sterilizaci 6,8 až 7,0. Kultivace probíhá dále na rotační třepačce při 29 °C, po dobu 96 až 120 h.The Brevibacterium flavum production strain, which requires homoserine for growth and which is resistant to S-aminoethyl-L-oysteine, is inoculated with 50 ml of inoculation medium, placed in a 500 ml boiling flask having the following composition: sucrose techn. 30 g, sodium vinegar crystals. 20 g, corn extract / 60 wt. dry matter / 30 g, water up to 1000 ml. After inoculation, it is further cultured on a rotary shaker (240 rpm) at 29 ° C for 18 to 24 h. the following composition: sucrose techn. 180 g, hydrolyzate of crab flour or meal 200 ml, corn extract / 60 wt. dry matter / 10 g, ammonium sulfate crystals. 1 g, potassium phosphate sec. 1 g, magnesium sulfate crystals. 0.1 g, calcium carbonate ground 30 g, water to 1000 ml; pH of the medium after sterilization 6.8 to 7.0. Cultivation is continued on a rotary shaker at 29 ° C for 96 to 120 h.

V průběhu kultivace ae pH kultury upravuje pomocí 10 % obj. roztoku čpavku na hodnotu kolem 7,0. Po ukončení kultivace činí produkce L-lysinu u kmene Brevibacterium flavum 36 až 42 g/litr media; u kmenů Corynebacterium glutamicum činí za tsejných podmínek produkce L-lysinu 36 až 38 g/litr media.During the cultivation, the pH of the culture is adjusted to about 7.0 with 10% v / v ammonia solution. After cultivation, the production of L-lysine in the Brevibacterium flavum strain is 36 to 42 g / liter of medium; in the case of Corynebacterium glutamicum strains, under the same L-lysine production conditions, 36-38 g / liter of medium.

Příklad 2Example 2

Stejně jako v příkladu 1 se inokulem produkčního kmene Brevibacterium flavum zaočkuje medium stejného složení jako v příkladu 1, jen a tím rozdílem,že jako komplexního zdroje dusíku se použije hydrolyzátu řepkmvého šrotu, a to ve stejném množství jeko u bavlníkovéno hydrolyzátu.As in Example 1, the inoculum of the production strain of Brevibacterium flavum was seeded with a medium of the same composition as in Example 1, except that beet complex hydrolyzate was used as the complex nitrogen source in the same amount as cottonseed hydrolyzate.

Za fermentačních podmínek jako v příkladu 1 se po 96 sž 120 h dosáhne produkce L-lysinu 37 sž 43 g/litr media; při aplikaci produkčních kmenů Corynebacterium glutamicum se za stejných podmínek a za stejnou dobu fermentace dosáhne produkce L-lysinu 40 až 45 g/litr media.Under fermentation conditions as in Example 1, after 96 to 120 hours, L-lysine production of 37 to 43 g / liter of medium was achieved; When using production strains of Corynebacterium glutamicum, production of L-lysine of 40-45 g / liter of medium is achieved under the same conditions and the same fermentation time.

Příklad 3Example 3

Stejně jako v příkladu 1 se inokulem produkčního kmene Brevibacterium flavum zaočkuje fermentační medium stejného složení jako v příkladu 1, jen s tím rozdílem, že se jako komplexního zdroje dusíku použije hydrolyzátu lněného šrotu v množství 20 % obj. Za fermentačních podmínek jako v příkladu 1 ae po 96 až 120 h kultivace dosáhne produkce L-lysinu 40 až 45 g/litr media; při aplikaci produkčních kmenů Corynebacterium glutsmicum ae dosáhne produkce L-lysinu 42 sž 4> g/litr media.As in Example 1, the inoculum of the production strain of Brevibacterium flavum is inoculated with a fermentation medium of the same composition as in Example 1, except that 20% by volume of flax meal hydrolyzate is used as the complex nitrogen source. after 96 to 120 hours of culture, L-lysine production reaches 40 to 45 g / liter of medium; with the production strains of Corynebacterium glutsmicum ae, L-lysine production reaches 42 to 4 > g / liter of medium.

Příklad 4Example 4

Stejné jako v přikladu 1 se inokulem produkčního kmene Brevibacterium flavum zaočkuje fermentační medium stejného složení jsko v příkladu 1, jen s tím rozdílem, že jeko komplexního zdroje dusíku se použije hydrolyzátu odtučněného sušeného mléks v množství 20 % obj. Za fermentačních podmínek jako v příkladu 1 ae po 96 h kultivace dosáhne produkce L-lysinu kolem 27 g/litr media; u kmene Corynebacterium glutamicum činí produkce 28 ež 30 g L-lysinu/litr media. Přiklad 5 o tejně jako v příkladu 1 se inokulem produkčního kmene Brevibacterium flavum zaočkuje fermentační medium stejného složení jBko v příkladu 1 s tím rozdílem, že se jsko komplexního zdroje dusíku použije hydrolyzátu krmného droždí v množství 20 % obj. Za fermentačních podmínek jeko v příkladu 1 se po 96 h kultivace dosáhne produkce L-lysinu kolem 20 g/litr media; u produkčníc kmenů Corynebacterium glutamicum se produkce L-lysinu pohybuje mezi 40 až 44 g/litr media za stejnou dobu.As in Example 1, inoculum of the production strain of Brevibacterium flavum is inoculated with a fermentation medium of the same composition as in Example 1, except that the hydrolyzate of the defatted milk powder at 20% by volume is used as a complex nitrogen source. and after 96 hours of cultivation, L-lysine production reaches about 27 g / liter of medium; in the Corynebacterium glutamicum strain, the production is 28 to 30 g L-lysine / liter medium. Example 5, as in Example 1, inoculate a Brevibacterium flavum production strain with a fermentation medium of the same composition as Example 1 except that a feed yeast hydrolyzate of 20% by volume is used as a complex nitrogen source. after 96 hours of cultivation, L-lysine production of about 20 g / liter of medium is achieved; in the production of Corynebacterium glutamicum strains, the production of L-lysine is between 40 and 44 g / liter of medium in the same time.

Claims

Process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing production microorganisms of the strains Brevibacterium flavum or Corynebacterium glutamicum in a liquid culture medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrient salts, vitamins and other biofactors under submerged conditions, characterized in that the cultivation is carried out in the culture medium containing, as a source of essential amino acids necessary for the growth of a microorganism, an acid hydrolyzate of waste agricultural raw materials of vegetable origin, such as oilseed meal, in particular rapeseed, cotton or linseed meal, or food products, in particular skimmed milk powder or feed yeast, % By weight of total nitrogen, in an amount of 10 to 30% by volume, based on the volume of the nutrient medium.