CS216295B1 - Method of high-effective isolation of the lipophie substances from bilogical materials - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKÁ SOCIALISTICKÁ POPIS VYNÁLEZU 216295 R E P U B L 1(19) K A K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU (11) (Bl) Igj (22) Přihlášené 02 02 81(21) (PV 726-81) (51) Int. Cl.3 B 01 D 11/00 (40) Zverejnené 15 09 81 ÚŘAD PRO VYNÁLEZY AOBJEVY (45) Vydané 15 05 84

Autor vynálezu ZEMEK JURAJ ing. CSc., LEHNICE, KUNIAK EUDOVlT ing. CSc.,STRAKOVÁ ANNA RNDr., VOLMUT JURAJ ing., BRATISLAVA (54) Spósob vysokoúčinnej izolácie lipofilných látok z biologických mate-riálov

Vynález sa týká spósobu vysokoúčinnej izo-lácie lipofilných látok z biologických rozto-kov, ako z krvi, moču a pod., pomooou ex-trakcie v koloně za využitia polysacharidovejnáplně.

Izolácia lipofilných látok z biologickýchroztokov je dóležitým etupňom tak z hladiskaanalytického ako aj preparatívneho. Klasickýspósob izolácie lipofilných látok spočívá v nie-kofkonásobnej extrakcii vytrepávaním biolo-gických roztokov do organických rozpúšťadielv deliacom lieviku. Uvedený spósob je všaknáročný na čas, spotřebu biologického ma-teriálu, ako aj extrakčných roztokov, pričomposkytuje nízký výtažek extrahovaných lá-tek a nízku čistotu eluátu. Ύ ýUvůnsj šííu R9S Wvm ýaví postup kva- palinovo-kvapalinovej extrakcie za využitia 216295 náplní ako .zrnité živočišné uhlie, živicaKAD-2, alebo'zrnitá kremelina, využívanáv kolonách na báze silikagélu alebo kreme-liny (NSR pat. 2 410 033, Breiter J.: J. Clin.Chem. Biochem. 14, 46, 1976, Breiter J., Hel-ger R., Z. Klín. Chem. Biochem. 13, 254,1975, Breiter J., Helger R., Lang H.: ForencisScience 7, 131, 1976.). Uvedená úprava riešivšak len otázku časovej náročnosti klasickejextrakcie, nakofko umožňuje spracovanie de-siatok vzoriek v sérii súčasne jedným pra-covníkom. Vážným nedostatkem uvádzanýchelučných metod je, že neumožňujú vzhladomk neinertnému charakteru povrchu použitých nosičov kvantitativný priebeh extrakcie. Po-užívané nosiče sú znečistěné predovšetkýmťažkými kovmi (železo, nikel a pod.), ktoréspósobujú katalytický rozklad niektorých te- 2 rapeutík, predovšetkým psychofarmák (Diag-nostica Merck: ExtrelutR — Neues Verfahrenzom Extraktion lipophiler Stoffe, 1979).

Uvedené nedostatky rieši postup podlá vy-nálezu, ktorý zaručuje kvantitativný priebehextrakcie a dobrá stabilitu extrahovanýchterapeutík.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že akopevná fáza do elučnej kolony sa použije mo-difikovaná mikrokryštalická celulóza s vel-kosťou častíc 0,1 až 0,5 mm, sypnou hmot-nosťou 0,2 až 0,25 g/ml a napúčacím obje-mom vo vodě 4,0 až 5,0 ml/g, pričommnožstvo vodnej fázy extrahovanej biologic-kej tekutiny upravenej na optimálně pH preextrahovaná látku zakotvenej na celulózo-vom nosiči nepřesahuje 1 až 1,2 násobokhmotnosti suchej celulózovej náplně kolony,pričom obsah ťažkých kovov v celulózovomnosiči nepřesahuje 5 ppm a obsah extraho-vatefných natívnych látok nepřesahuje 10ppm. Výhodou navrhovaného postupu je, žeumožňuje izolovat lipofilné látky pre prepa-ratívne ako aj analytické účely, pričom sadosahuje úspora času pre jednu analýzu až50 %, pre dve analýzy až 65 % a pre 10 ana-lýz v sérii až 75 %. Spotřeba chemikáliíoproti klasickej extrakcii a postupom využí-vajúcim kremelinovú náplň je až 50 %. Vý-hodou je tiež podstatné vyššia výťažnosť ex-trahovaných látok a to tak v porovnaní s kla-sickou extrakciou, ako aj voči doteraz zná-mým postupom extrakcie v kolóne na bázesilikagélu a kremeliny a to o 20 až 30%v případe extrakcie kyslých látok, o 40 až50 % v případe bázických látok. Vyššia čis-tota náplně v kolóne umožňuje extrahovatbezo zvyšku všetky typy farmák, ako aj pře-chovávat biologické roztoky na náplni bezobáv z katalytického rozkladu lipofilných lá-tok. Vyššia čistota eluátu umožňuje využitiefyzikálno-chemických metod, ako plynulejohromatografie, kvapalinovej chromatografieza zvýšeného tlaku a spektrálných metodk analýze lipofilných látok. Dosiahne sai úspora biologického materiálu, k jednej ex-trakcii postačuje 1/5 množstva krvi resp. dal-·šieho biologického roztoku, potřebné ku kla-sickej extrakcii a 1/2 množstva potřebnéhok extrakcii na kremelinovýoh kolonách. Ďal-šia výhoda spočívá v možnosti postupnej reak-cie kyslých a potom bázických látok a naopakz tej istej vzorky biologického materiálu. Úplné postačujúce množstvo krvi pre ex-trakciu je 2 ml, ktorá sa zriedi 8 ml vody.Zriedený roztok krvi sa naleje na kolonu(priémer 25 až 30 mm) s náplňou modifiko-vanej celulózy (10 až 12 g) s velkosťou častíc0,1 až 0,5 mm a nechá sa 15 minut nasako-vať do celulózového gélu. Potom sa na ko-lonu naleje potřebné extrakčné organickérozpúšťadlo (chloroform, éter, a i) a chytá saeluát v množstve 40 až 60 ml, kedy je extra-hovaná látka kvantitativné z kolony izolova-ná. Rýchlosť elúcie sa móže ak je potřebnéspomaliť nasadením injekčnej ihly na výtok kolony resp. změnou výšky hydrostatickéhotlaku. Optimálna rýchlosť elúcie je taká, priktorej objem vytečeného eluátu 40 až 60 mlsa dosiahne za 20 až 30 minút. Zvyšovánímrýchloisti nad uvedené optimum stúpa objemeluátu pre dosiahnutie kvantitatívnej extrak-cie.

Ak sa extrakcia prevádza z moču, tak sa•neriedi a nanáša sa na kolonu v množstve10 ml. K spracovaniu eluátu, připadne k vyhodno-teniu koncentrácie jednotlivých látok možnovyužiť spektrometrické, enzýmové chromato-grafické a iné metody a to aj také, ktoré súnáročné na stupeň prečistenia analyzovanejvzorky (plynová chromatografia, kvapalinováohromatografia a pod.). Příklad 1

Extrakčná kolona o vnútornom priemere25 mm a výške 14 cm sa naplní mikrokryšta-lickou celulózou (12 g) o zrnitosti 0,1 až 0,4mm a dotlačí sa piestom s vložkou zo skle-nenej vaty. Na kolonu sa potom nanesie vzor-ka krvi, připravená tak, že 2 ml krvi, obsa-hujúcej 0,1 mg fenobarbitalu sa zriedi 8 mlvody okyslenej 0,5 ml 1 N HC1. Vodná fázasa nechá vsiaknuť do polysacharidového ma-teriálu (15 minút) a extrakčná kolona sa ža-le je nato 60 ml dietyléteru. Extrakcia feno-barbitalu prebehne v priebehu dalších 20minutách. Extrakt sa zahustí a použije k sta-novému koncentrácie fenobarbitalu. Výťažokfenobarbitalu (stanovenie převedené plyno-vou chromatografiou) je 0,098 mg, t. j. 98 %. Příklad 2

Tak ako je uvedené v příklade 1, s týmrozdielom, že na extrakčnú kolonu sa apliku-je 10 ml moču, upraveného na pH 2 s 1 N HCl,ktorý obsahuje 0,1 mg fenobarbitalu. Výťažokfenobarbitalu pri extrakcii je- 0,099 mg, t. j.99 %. Příklad 3

Tak ako je uvedené v příklade 1, s týmrozdielom, že na náplň extrakčnej kolony saaplikuje 10 ml. zriedenej krvi, tak ako je uve-dené v příklade 1, obsahu júcej 0,1 mg feno-barbitalu a 0,1 mg kodeínu. Po převedeníkyslej extrakcie, tak ako je uvedené v příkla-de 1 sa stacionáma fáza na náplni adjustujeprefúknutím plynného čpavku na pH 10 (čpa-vok sa nechá prefukovať cez extrakčnú ko-lonu zhora dole, až kým fcnolftaleinóvý indi-kátor pri dolnom výstupe z kolony signalizujepH 9 až 10). Potom sa prevedie extrakciaibázickej zložky pomoeou 60 ml zrnesi dichlór-metánu a izopropanolu (85 :15 objemových%). Výťažok fenobarbitalu bol 0,0098 mg t. j.98% a výťažok kodeínu bol 0,099 mg t. j,99 % (stanovenie převedené spektrofotome-tricky).

Claims (2)

1. 3 Příklad 4 Tak ako je uvedené v příklade 1, s tým -rozdielom, že na náplň extrakčnej kolony saaplikuje 10 ml zriedenej krvi (2 ml 'krvi a8 ml vody Obsahuj úcej 0,5 ml 1 N NC1, obsá-hujúcej ďalej 0,02 mg fenobarbitalu, 0,02 mgtiobarbitalu, 0,02 mg allobarbitalu a 0,02 mgmorfínu, 0,02 mg kodeínu a 0,02 mg amitryp-tilínu). Po převedení postupné kyslej a potombázidkej extrakcie, tak ako je uvedené v pří-klade 3 a chromatografickej analýze eluátovsa získalo 0,02 mg fenobarbitalu, 0,019 mgtiobarbitalu, 0,02 mg allobarbitalu, 0,19 mgmorfínu, 0,02 mg kodeínu a 0,02 mg amitryp-tilínu, čo zodpovedá výfažku jednotlivých zlo-žiek 95 až 100 %. Příklad 5 10 ml zriedeného roztoku krvi (2 ml krvi, 8 ml 0,05 M pufru, ohsahujúceho čpavok a•chlorid amonný o pH 9 a 0,02 mg kodeínua 0,02 mg morfínu) sa nanieslo na celulózovúnáplň extrakčnej kolony a po vytvoření sta-cionárnej fázy (15 min.) sa kolona zaliiala 60 ml zmesi dietyléter — izopropanol (85 :15objemových %). Výťažok kodeínu v eluátebol 0,019 mg a výťažok morfínu 0,02 mg, t. j.95 až 100%. Příklad 6 0,5 ml zriedeného roztoku krvi (0,1 ml krvia 0,4 ml vody) olbsahujúcej 0,005 mg choleste-rolu sa nanieslo na 0,6 g náplně pripravenejzo zemiakového škrobu. Po 10 minutách sa vytvořila stacionámavodná fáza a extrakcia sa previedla 4 mlchloroformu. Výťažok cholesterolu bol 0,005mg, t. j. 100%. Postup podl’a vynálezu je Vhodný k izoláciilipofilných látok z hladiska preparatívnehoa analytického a to predovšetkým pre: - farmakobiochemické účely, sledovanie hla-din a metabolitov lieciv, pre sledovanie hladiny cholesterolu, ste-roidných hormónov a dalších látok, důleži-tých z hladiska prevencie srdcovo cievnychochorení, ochrana matky a dieťaťa a pod., apre toxifcologické účely. PREDMET VYNÁLEZU

   1. Spósob vysokoúčinnej izolácie lipofilnýchlátok z biologických materiálov na principekvapalino-kvapalinovej extrakcie zo zakot-venej fázy biologickej tekutiny na pevnomnosiči vyznačený tým, že ako pevná fázado elučnej kolony sa použije modifikovanýpolysacharid s výhodou celulóza alebo škrobis velkostou častíc 0,1 až 0,5 mm, sypnouhmotnosťou 0,2 až 0,25 g/ml a napúčacímolbjemom vo vodě 4,0 až 5,0 ml/g, pričommnožstvo vodnej fázy extrahovanej ibiolo- gickej tekutiny upravenej na optimálně pHpre extrahovaná látku zakotvené na poly-sacharid ový nosič nepřesahuje 1 až 1,2 ná-sObok hmotnosti suchej celulózovej náplněkolony.
2. 2. Spósob podlá bodu 1 vyznačený tým, žemodifikovaný polysacharid neobsahuje viacťažkých kovov ako 5 ppm a množstvo na-tívnych extraktívnych látok viac ako 10-ppm.