CS215861B1 - Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu - Google Patents
Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu Download PDFInfo
- Publication number
- CS215861B1 CS215861B1 CS294881A CS294881A CS215861B1 CS 215861 B1 CS215861 B1 CS 215861B1 CS 294881 A CS294881 A CS 294881A CS 294881 A CS294881 A CS 294881A CS 215861 B1 CS215861 B1 CS 215861B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- metabolic activity
- glucose
- suspension
- metabolic
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Vynález se týká způsobu stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu. Podstata je v tom, že intenzita metabolických pochodů se stanoví pomocí tzv. acidifikační schopnosti AS ze změn kyselosti vnějšího média po suspendování buněk v destilované vodě a po přidání glukózy k suspenzi. Výhodou je, že se pomocí jednoduchého a snadno reprodukovatelného postupu, t.j. pouhého odečtení kyselosti suspenze za popsaných podmínek, stanoví krátkodobé, i dlouhodobé změny metabolické aktivity buněk. Lze tak stanovit vliv růstových podmínek, skladování, lyofilizace, inhibitorů, mutagenů, atd., na metabolickou aktivitu kvasinek metabolizujících glukózu. Postup je velmi jednoduchý, vyžaduje pouze standardní laboratorní vybavení a může být rutinně prováděn i nezaěkolenými pracovníky. Podává okamžitou informaci o metabolickém stavu kultury.
Description
Vynález se týká způsobu stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu. Podstata je v tom, že intenzita metabolických pochodů se stanoví pomocí tzv. acidifikační schopnosti AS ze změn kyselosti vnějšího média po suspendování buněk v destilované vodě a po přidání glukózy k suspenzi. Výhodou je, že se pomocí jednoduchého a snadno reprodukovatelného postupu, t.j. pouhého odečtení kyselosti suspenze za popsaných podmínek, stanoví krátkodobé, i dlouhodobé změny metabolické aktivity buněk. Lze tak stanovit vliv růstových podmínek, skladování, lyofilizace, inhibitorů, mutagenů, atd., na metabolickou aktivitu kvasinek metabolizujících glukózu. Postup je velmi jednoduchý, vyžaduje pouze standardní laboratorní vybavení a může být rutinně prováděn i nezaěkolenými pracovníky. Podává okamžitou informaci o metabolickém stavu kultury.
215 861
215 861
Vynález se týká jednoduchého způsobu stanovení metabolické aktivity· popř. stupně autolýzy kvasničných buněk metabollzujících glukózu.
Při práci β kvasinkami jak v laboratorním, tak v průmyslovém měřítku (lihovarnický, drožďárenský, pivovarský průmysl atd.) je třeba často stanovit metabolický stav pokusných nebo produkčních kmenů. Pro stanovení se používá řady metod,(např. A.Kleinzeller, J.Málek, R.Vrba:Manometrioké metody a jejich použití v biologii a biochemii, Státní zdravotnioké nakladatelství, Praha 1954), kvasné schopnosti (viz např. J.Dyr, V.Grégr, A.Seiler: Lihovarství I, SNTL, Praha 1964) a dalších, které jsou poměrně pracné a zdlouhavé a nepodávají vždy celkový obraz intenzity životních pochodů v buňkách.
Vynález umožňuje doplnit, popř. nahradit tyto tradiční testy rychlým a jednoduchým stanovením metabolické aktivity buněk. Jeho podstatou je, že 3x promyté buňky se suspendují Při 25-30 °C ve vodě o pH 6 a poté, po 5-10 min se přidá glukóza do konečné konoentraoe 0,5-1,0 % a po dalších 10 min se odečte pH suspenze na pH-metru, načež zjištěný rozdíl mezi počátečním a konečným pH je tzv. acidifikační sohopnost AS, která je přímou měrou metabolické aktivity buněk. Metoda je použitelná pro různé druhy kvasinek metabollzujících glukózu, např. pekařské kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), pivovarské kvasinky (Saccharomyces uvarum) a další.
studium změn metabolické aktivity navozených dlouhodobým aerobním hladověním ukázalo, že buňky bohaté na zdroje energie okyselují vnější prostředí, zatímco buňky energeticky chudé (např. následkem stárnutí za nepříznivých podmínek) vnější prostředí alkalizují. Alkallzace přitom stoupá a s postupujícím ochuzováním, popř. s postupující autolýzou buněk. Tato spontánní změna kyselosti prostředí po suspendování je popisována křivkou charakteristickou pro daný druh, kmen, hustotu suspenze a pokusné podmínky.
Podobnou charakteristickou veličinou je i další změna kyselosti suspenze, která nastává po přidání glukózy k suspenzi. U energeticky bohatých buněk je tato glukózou vyvolaná změna kyselosti nižší, vzrůstá s postupujícím hladověním, a u buněk silně ochuzených (např. po cca 80 hodinách aerobního hladovění pekařských kvasinek v destilované vodě) opět klesá.
Součet obou hodnot byl nazván acodifikační schopností ASj její hodnota lineárně'klesá β postupujícím hladověním buněk. Tato lineární závislost slouží jako referenční graf pro daný kmen a získá se způsobem popsaným v příkladu 1. Změny acidifikační schopnosti jsou doprovázeny změnami v intenzitě respiračníoh pochodů v buňkách, v obsahu makroergiokých sloučenin (adenosintrifosfát, dále jen ATP) a v intenzitě glykolytických (fermentativních) pochodů (viz M.A.Jimenéz, K.Sigler, L.S.Herrera, A.KotyksBiológia 35. 167-171, 1980 - pomocí acidifikační schopnosti lze dokonce testovat kvasničná mutanty blokované v glykolýze). Změny AS tedy odrážejí citlivě a všestranně změny metabolické aktivity buněk.
Stanovení AS vyžaduje pouze standardní laboratorní vybavení (pH-metr, skleněnou a ka* lomelovou elektrodu, vodní lázeň temperovanou na 25 - 30°C, laboratorní magnetickou míchačku) a chemikálie (destilovaná voda, glukóza).
Na přiloženém výkresu jsou, na obr.l a 2 znázorněny grafy popisující stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk kmene Sacchraromyces cerevisiae K podle vynálezu. Na vodo215 861 rovné ose jsou v obou případech naneseny hodiny hladovění uvedených kvasníčných buněk} na svislé ose na obr.l jsou naneseny změny pH pozorované během této doby hladovění a u obr.2 je na levé svislé ose obsah ATP a na pravé svislé ose rychlost dýchání buněk. Na obr.l je popsán vliv doby hladovění na intenzitu spontánní aoidifikaoe (křivka a), glukózou indukované acidifikace (křivka b) a celkovou acidifikační schopnost (přímky I, II). Symboly o, ®, e u přímek I a II jsou hodnoty získané ve třech různých pokusech. Na obr.2 je popsán vliv doby hladovění na rychlost spotřeby kyslíku buňkami (hod., nmol 02 min (mg suši ny)_1) a obsah ATP (hod., nmel ATP (mg sušiny7'L) v kvasinkách Sacchraomyces cerevisiae K.
Dále je uveden příklad způsobu stanovení metabolické aktivity kvasinek metabolizujících glukózu podle vynálezu.
Překlad
Kvasinky (sušené, lisované nebo sediment buněk získaný centrifugací kvasničné suspenze) se promyjí 3 x centrifugací v destilované vodě při 2000 - 3000 násobku gravitačního zrychlení, aby se odstranily zbytky média i součástí lysovaných buněk z mezibuněčného a pe riplesmatického prostoru, a resuspendují se v 10 ml destilované vody, jejíž teplota je udr žována na 30 °C pomocí vodní lázně a jejíž kyselost je nastavena na počáteční pH = 6,0 pomocí HC1 nebo NaOH; ve vodě je ponořená skleněná a kalomelová elektroda, připojená k pH-metru. Optimální hustota suspenze je 15 - 20 g suché váhy buněk na litr a suspenze je neustále míchána magnetickou míchačkou. Po 10 min se k suspenzi přidá roztok D-glukózy do konečné koncentrace 0,5 - 1,0 % (obvykle 0,2 ml 40 % glukózy na 10 ml); po dalších 10 min se odečte hodnota pH. Rozdíl i 5·° - Pko„ež»é= ll>
Okyselení (snížení pH) suspenze se přitom bere jako kladná změna pH, alkalizace (zvýšení pH) jako záporná změna pH.
Postup je možno opakovat pro buňky hladovějící aerobně (suspendované ve vodě za míchá ní na třepačce) různou dobu. Vynesením hodnot AS proti době hladovění v hodinách se získá přímka popsaná rovnicí 2, / AS = A - Bt/ (2) kde A je počáteční hodnota AS měřená u buněk bezprostředně po růstu, B je koeficient popisující pokles AS s časem, t je doba hladovění v hodinách. Koeficienty A a B jsou charakteristické pro daný druh, kmen a pokusné podmínky, stejně jako hodnota AS. Pro laboratorní kmen Saccharameces cerevisiae K má rovnice (2) tvar (viz obr.l, přímka I) / AS = 2,47 - 0,029 t / (3)
Když AS dosáhne kodnoty blízké nule, úbytek metabolické aktivity se zrychlí a AS se řídí rovnicí 4 (přímka XI) / AS = 4,81 - 0,062 t / (4) (Stanoveno metodou nejmenších čtverců).
Buňky tohoto kmene, jejichž AS je v rozmezí 2,5 až 1,0 jsou v uspokojivém metabolickém stavu. Buňky s AS menším než nula jsou silně autolyzovány nebo jinak poškozeny a jejich metabolická aktivita je mizivá.
Postup popsaný v příkladu může sloužit pro řadu dalších stanovení:
215 861
a) Srovnání AS studované suspenze bezprostředně po oddělení růstového média s referenční AS standardní suspenze může demonstrovat vliv kultivačních podmínek na metabolickou aktivi tu.
b) Srovnání časového faktoru B v rovnicí (2), vypočteného např. jako rozdíl AS (počáteční) - AS (po 2P hod. hladovění) s obdobnou referenční hodnotou standardní suspenze demonstruje dlouhodobý vliv kultivačních podmínek, rychlost poklesu metabolické aktivity se stárnutím kultury.
c) Opakované stanovení AS např. u sušených kvasinek v různých intervalech po suspendování v destilované vodě ukazuje rychlost zotavování buněk i okamžik, kdy buňky dosáhly plné metabolické aktivity (počáteční vzrůst a následná stabilizace AS), Dobu mezi suspendováním buněk a přidáním glukózy je v tomto případě možno zkrátit na 5 minut.
d) Srovnání koeficientu A nebo koeficientu B z rovnice (2) u buněk vystavených např. vlivu inhibitorů, záření, mutagenů atd., s odpovídajícími hodnotami pro standardní intaktní buňky ukazuje stupeň poškození životních procesů.
e) Kontrolní stanovení AS (koeficientu A nebo B) prováděné v delších intervalech u téže kultury, používané např. dlouhodobě pro průmyslové účely, poskytne první informaci o případných změnách v kultuře.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu, vyznačený tím, že buňky promyté třikrát v destilované vodě se suspendují při 25 °C až 30 °C v destilované vodě o pH 6 a poté po 5 až 10 minutách se přidá glukóza do konečné koncentrace 0,5 až 1,0 % a po dalších 10 minutách ee odečte pH suspenze na pH-metru, načež zjištěný rozdíl mezi počátečním a konečným pH je tzv. aciďifikační schopnost AS, která je přímou měrou metabolické aktivity buněk.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS294881A CS215861B1 (cs) | 1981-04-17 | 1981-04-17 | Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS294881A CS215861B1 (cs) | 1981-04-17 | 1981-04-17 | Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS215861B1 true CS215861B1 (cs) | 1982-09-15 |
Family
ID=5368127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS294881A CS215861B1 (cs) | 1981-04-17 | 1981-04-17 | Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS215861B1 (cs) |
-
1981
- 1981-04-17 CS CS294881A patent/CS215861B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pampulha et al. | Activity of glycolytic enzymes of Saccharomyces cerevisiae in the presence of acetic acid | |
| Van Uden | Transport-limited fermentation and growth of Saccharomyces cerevisiae and its competitive inhibition | |
| Karube et al. | Determination of fish freshness with an enzyme sensor system | |
| Patton et al. | Phenotypes of sphingolipid-dependent strains of Saccharomyces cerevisiae | |
| Dickson et al. | Physiological studies of β-galactosidase induction in Kluyveromyces lactis | |
| Jiang et al. | An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast | |
| Mösch et al. | Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. | |
| Nabais et al. | Influence of calcium ion on ethanol tolerance of Saccharomyces bayanus and alcoholic fermentation by yeasts | |
| Munack | Optimal feeding strategy for identification of Monod-type models by fed-batch experiments | |
| Opekarová et al. | Acidification power: indicator of metabolic activity and autolytic changes in Saccharomyces cerevisiae | |
| Beauvoit et al. | Differential sensitivity of the cellular compartments of Saccharomyces cerevisiae to protonophoric uncoupler under fermentative and respiratory energy supply | |
| De Nicola et al. | Accumulation and cellular distribution of zinc by brewing yeast | |
| Quay et al. | Regulation of branched-chain amino acid transport in Escherichia coli | |
| Pereira et al. | The fermentation of sugarcane molasses by Dekkera bruxellensis and the mobilization of reserve carbohydrates | |
| Michels et al. | Pleiotropic glucose repression-resistant mutation in Saccharomyces carlesbergensis | |
| Wei et al. | Effect of sodium chloride on bakers' yeast growing in gelatin | |
| Francesca et al. | Effect of different glucose concentrations on proteome of Saccharomyces cerevisiae | |
| CS215861B1 (cs) | Způsob stanovení metabolické aktivity kvasničných buněk metabolizujících glukózu | |
| Ishmayana et al. | Preliminary evidence of inositol supplementation effect on cell growth, viability and plasma membrane fluidity of the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| Ramon-Portugal et al. | Kinetics of production and consumption of organic acids during alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisae | |
| Schweingruber et al. | Regulation of pho1-encoded acid phosphatase of Schizosaccharomyces pombe by adenine and phosphate | |
| Uribelarrea et al. | New method for measuring the cell water content by thermogravimetry | |
| Maláč et al. | Activity of yeast multidrug resistance pumps during growth is controlled by carbon source and the composition of growth-depleted medium: DiS-C3 (3) fluorescence assay | |
| Fujita et al. | Identification of a fatty acyl-CoA synthetase gene, lcf2+, which affects viability after entry into the stationary phase in Schizosaccharomyces pombe | |
| Ramon-Portugal et al. | Mixed culture of killer and sensitive Saccharomyces cerevisiae strains in batch and continuous fermentations |