CS211964B1 - Aminoglykozidové antibiotiká zo skupiny kanamycínu, neomycínu a gentamicínu značené fluorescamínom - Google Patents

Description

Vynález spadá do odboru biochemie a klinické] chemie a rieši. problém fluorescenčného značenla antibiotik kanamycínu, neomycínu a gentamicínu využitím reakcie fluorescamínu, tj. 4-fenylspiro-[fiurán-2/3H/,l’-ftaIán) 3,3’-dionu e primárnými aminoekupinami antibiotik. Reakcia prebieha v kyslej oblasti, s výhodou pH 5, čím sa dosiahne přednostně značenie na Jednej aminoskuplne molekuly. Takto značené antibiotikum si izachováva póvhdné antiímikrobiálne vlastnosti a naviac získává schopnost intenzívnej fluorescencie v ultrafialovom svetle a možnost jednoduchej identifikácie v koncentráciach 10^-9 mol/1. Z reaikčnej zmesí sa izoluje buď 'sitípcovou chromatografiou na anexe, alebo elektroforézou na celúlózovom. nosiči.

Předpokládaná hlavná možnost využitia takto značených antibiotik je v odbore analytické] biochémie, pri vypracovaní nových jednoduchších fluorescenčných iinunoanalýz aminoglykozidových antibiotik a všade tam, kde sa vyžaduje jednoduchá a vysokocitllvá identifikácla týchto látok při zachovaní* povodných biologických vlastností. Uvedeným spósobom modifikované antibiotiká prispievajú k objasneniu otázok chemickej štruktúry a biologického efektu.

Vynález sa týká aminoglykozidových antibiotik zo skupiny kanamycínu, neomycínu a gentamicínu značených pomoicou činidla 4-fenyl'Sipiro[furán 2/3H/,l’-ftalán]3,3’-dibnu, 't. j. fluOrescamíhu, pričom zostáva zachovaná ich protimlkrobiálna aktivita.

Doposiai používané metódy na idéntifikáciu aminoglykozidových antibiotik, ktorých sledovanie je dóležité z hlediska ich nežiadúcich účinkov, vychádzajú predovšetkým z ich mikrobiologického efektu, fiasť metód využívá chemické postupy, čí fyzikálně analytické metódy — vysokotlakú kvapalinovú chromatografiu a plynová chromatografiu. Kvalitativně nový přístup k analýzam antibiotik hlavně využitím imunologie vyžaduje nějakým spósobom „značené“ antibiotiká. Využívá najmá Izotopové značenie — enzýmové rádioaktívne metódy, alebo rádloimunoánalytické poistupy, menej však chemické fluorescenčně značenie. Přitom citllvosť fluorescenčných metód sa blíži citlivosti rádloaktívneho značenla, naviac je odstránená práca s rádioaktřvnym materiálom. V ro(ku 1977 bod zverejhený postup aj aparatára na imunoifluorescenčné stanovenle gentamlicíniu, priičom ako fluorofór sa využívá izotíokyanát fluorešceínu, ktorý sa vlaže na antibiotikum. Reakcia prebieha v alkalickém prostředí počás 2 hodin pri íaboratórnej teplote. Fluoreskujúci produkt je málo stály a udržuje sa pri teplote +4°C. Náročnější spósob stanovenla aminoglykozidových antibiotik využívá lumilnisceheiu Mcilerázovej reakcie s ATP v kombinácii s enzýmovou modifikáciou aminoglykozldov. V klasickom analytickom převedení je známa reakcia 4-f'enyispiTo[furán-2/3H/,l’ftalán]3,3’-dionu s primárnými amínmi za’vzniku fluoreskujúcich proiiuktov. Takto boli označené antibiotiká kanamycín, gentamycín a neomycín, pričom značenie prebtehalo v alkalickom prostředí. Vzniknuté fluorofóry umožnili identifikáciu uvedených antibiotik v koncentrácii 10'⁹ mol/ /l⁴ avšak ich biologická aktivita (trolla podstatné znížená.

Táto nevýhoda je odstránená spósobom fluorescenčného značenia aminoglykozidových antibiotik podl'a předloženého vynálezu, podstata ktorého spočívá v tom, že antibiotikum obsahujúce váčší počet aminoskupín reaguje s 4-fenylspiro[furán-2/3Hjl’-f^ltálán]3,3’-idinom v fcyslom prostředí vodného roztoku s výhodou pH 5, pričom přednostně vznlkajúci fluorofór so zachovanou biologickou aktivitou sa selektívne izoluje od příměsí istlpcovou chromatografiou na anexe alebo elektroforézou na celulózových nosičoch.

Výhoda značenia podlá vynálezu spočívá v tom, že v uvedenom prostředí z viacerých přítomných aminoskupín antibioitika, zreaguje s 4-fenyfispiro[iurán-2/3H/,r-4ita4án]3,3^diononi přednostně len jedna aminoskuplna, čím reakcia nezmění antimíkrobiálné vlastnosti analyzovaného antibiotika. Vzniklý produkt — fluorofór I vykazuje okrem dobrej chemickej stability aj vysoká fluorescenčnú účinnost To umožňuje lahko stanovit antibiotikum aiž do Ikoncentrácie 10'⁹ mol/1⁴ a nižšie. Hranice citlivosti je izrolvnatelná so stanovením pomocou Izotopových metod značenia, pri ktorom sú chemické operácle náročnejšie zo známých dóvodov škodlivosti ionizujúceho žiarenia na živý organizmus. Ďalšie podrobnosti vynálezu sú uvedené nižšie, kde je objasněná podstata vynálezu na konkrétných prípadoch, pričom sa na nich neobmedzuje.

Na připojených výkresoch je znázorněný postup fluorescenčného značenia aminoglykozidových antibiotik kanamycínu, neomycínu a gentamicínu podlá vynálezu a příklad antimikrobiálneho účinku fluorofóru I. Na obr. 1 je celková schéma přípravy a izolácie značených antibiotik, t. j. flluorofórov I. 'Na olbr. 2 je příklad antimikrobiálneho účinku fluorescenčně značeného gentamicínu na kmeň Bacillus cereus, pričom S = štandardný antíbio tikový disk (30 μξ gentamicínu), G — východizí genitamicín 50 ^g, FG = zmes fluorofórov gentamlcínu 50 ^g, I = fluorofór t přibližné 5 μζ, II—V = biologicky neaktivně vyššie fluorofóry gentamicínu.

Fluorescenčně značenie uvedených antibiotik sa roibí tak, že potřebné množstvo- antibiotika sa rozpustí v tlmivom roztoku, s výhodou pH 5.

V polovičnom objeme acetónu sa rozpustí 4-fenylspiro[furán-2/3H/l’ftalán]3,3’-dion v množstve odipovetíajlúcom 0,5 molu na jeden mol aminóskupiny antibiotika, Olbiidva roztoky sa zleji! za. intezívneho mieĎanla. Podlá koncenfcrácie reagujíúcidh aložleik vzniká bezfarebný, alebo citrónovožltý roztok so silnou fluorescenciou v ultraflalovom svetle (A_exc. = ^{390 nm}> Aem. · = = 480 nmj. Izolácia fluóru sa robí na kolohlke anexu na báze dextiranovýdh gélov staibiltoováne] tlmivým roiztokom |s výhodou pH 6,3. Po nanesení reaikčných proldufctoiv ifiluprofór I opúšťa kolonku ako prvá fluorescenční fralkcía. Ostatně primasi predlstavuijiú fluorofóry s váčšim počtom viázaných fluoTescenčných tzwyšfcov, nemajú antimikrobiálnu aktivitu. Alternativně je možné Izolovat menšie množstvo fluorofóru I elektroforézou na celulózovom nosiči v alkalickom tlmivom roztoku s výhodou pH 9,2 pri napatí 1200 V. Frakcia s najmenšou pohybllvosťou k anóde představuje fluorofór I. Ž nosiča sa eluuje čpavkovou vodou (0,250 ml/1) a lyofilizuje.

Přikladl

Příprava fluorescenčně značeného kanamycínu. V 1 mil cltrátového fclmivého- roztoku 0,2 mol.

. I⁴ S pH 5 sa rozpustí 5 mg sulfátu kánamycínu.

V 0,5 ml bezvodého acetónu sa rozpustí 3,5 mg fluorescamínu a roztok za prudkého miešania sa přidá k roztoku antibiotika. Žitý produkt so silnou fluorescenciou v ultraflalovom svetle sa zbaví prebytočného acetónu odpařením v průde dusíku. Zmes sa potom nanetele na kolonku 0,7x x3 cm anexu na báze dextranu s výhodou sdphadexu DEAE-A25 stabilizovaná tlmivým roztokom Trlis-HCl 0,05 mod. I⁴ s pH 6,3. Po vsiaknutí vzorky sa kolonka premýva rovnakým roztokom. Kolonku opustí frakcia fluorofóru I, ostatně příměsi zoistanú pevne zachytené na Istípci a vytesnia sa roztokom NaCl 2 mol.l'¹ v tlmivom roztoku.

Takto značený kanamycín tvoří 50% výťažok.

Příklad 2

Příprava fluorescenčně značeného neomycínu a gentamicínu. V 1 ml cltrátového tlmivého roztoku 0,2 mol. I'¹ s pH 5 sa rozpustí 5 mg sulfátu neomycínu alebo gentamicínu. V 0,5 ml bezvodého acetonu sa rozpustí 3 mg fluórescamínu pre neomycín a 3,3 mg fluórescamínu pře gentamicín. V ďalšom sa postupuje ako v příklade 1. Roztoky izolovaných fluorofórov sa lyofilizáciou prevedú do práškovej formy, kde leh chemická stabilita zodpovedá stabilitě pfiivodných antibiotik. Značený neomycín tvoří 75 % a značený gentamicín 48 %.

Připravený fluorofór 1 antibiotik može sa uplatnit pri studiu vztahu štruktúry a biologického efektu. Vzhtadom na vetkú chemickú příbuznost s povódnými antibiotikami a zhodné antibakteriálne vlastnosti a vysokú fluorescenciu plní íunkciu značeného antibiotika so širokou paletou využitia, predovšetkým v oblasti imunofluorescenonéhio stanovenia příslušných antibiotik. Při použití in vitro může nahradit radioaktivně značenie, pri pokusech in vivo třeba najprv preveriť jeho chovanie v makroorganizme. V případe podobného chovania ako povodně antibiotikum^ móže tento fluorofór nahradit radioaktivně značenie aj in vivo. Vlastnosti fluorofórov ukazujú, že pokial neide o meranie v intaktnom tkahive, fluorescenčně značenie by mohlo tvořit rovnocennú náhradu. Fluorofór I odvodený od aminoglykozidových antibiotik móže byť použitý aj ako model pre využitie analogických fluorofórov iných, biologicky aktívnych amínov — hormónov, enzýmov, bielkovín. Fluorofór I ako samostatná zlúčenina je tiéž novým semisyntetickým antibiotikom.

Claims (3)

1. PREDMET

   1. Aminoglykozidové antibiotiká zo skupiny kanamycínu, neomycínu a gentamycínu značené fluorescamínom na jednej aminaskupine molekuly pripravite.tné reakciou uvedených antibiotik s 4-fenyíspiroil [furán-2/3H/,,r-íta'lán]3,3’-diónom vo vodnom roztoku v kyslej oblasti s výhodou při pH 5.
2. 2. Spósob přípravy značených aminoglykozidových antibiotik podía bodu 1 vyznačujúci sa tým, že uvedené antibiotiká reagujú s. 4-fenylVYNALEZU spiro[ifu''rán-2/3H/,l’-fta.lán]3,3’-dió'nom vo vodnom roztoku v kyslej ohlásti s výhodou pH 5 a vzniklý produkt sa z reakčnej zmesi izoluje.
3. 3. Spósob podía bodu 2 vyznačujúci sa tým, že izolácia značených antibiotik Isa robí stípcavou chromatografiou na anexe na báze dextranu vo vodnom prostředí s výhodou pH 6,3, alebo elektroforézou na celulózovom nosiči v alkalickom prostředí s výhodou pH 9,2.