CS210899B1

CS210899B1 - Method of obtaining specific anti-immunoglobulin antibodies with unchanged avidity from hyperimmunal serum

Info

Publication number: CS210899B1
Application number: CS770179A
Authority: CS
Inventors: Ladislav Rodak
Original assignee: Ladislav Rodak
Priority date: 1979-11-12
Filing date: 1979-11-12
Publication date: 1982-01-29

Abstract

Účelem vynálezu je způsob získávání specifických antiimunoglobulinových protilátek s nezměněnou aviditou z hyperimunního sěra vhodných po ozáření radioaktivním izotopem nebo enzymem k použití při radioimunoanalýze a enzymimunoanalýze. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že celý izolační postup probíhá v roztocích o nízké iontové síle 0,001 až 0,01. Za těchto podmínek je vazba protilátek na antigen slabá a Šetrné je i uvolnění této vazby při eluci protilátek. Takto izolované protilátky se velmi osvědčují při-rádioimunologických a enzymimunologických metodách.The purpose of the invention is a method for obtaining specific anti-immunoglobulin antibodies with unchanged avidity from hyperimmune sulfur suitable after irradiation with a radioactive isotope or enzyme for use in radioimmunoassay and enzyme immunoassay. The stated purpose is achieved by the fact that the entire isolation procedure takes place in solutions with a low ionic strength of 0.001 to 0.01. Under these conditions, the binding of antibodies to the antigen is weak and the release of this bond during elution of antibodies is also gentle. The antibodies isolated in this way are very useful in radioimmunological and enzymeimmunological methods.

Description

Vynález se týká způsobu získávání specifických antiimunoglobulinových protilátek s nezměněnou aviditou, které jsou vhodné k použití zejména pro nejcitlivější radioimunologické a enzymimunologické metody v humánní a veterinární diagnostice, z hyperimunních sér.The invention relates to a method for obtaining specific anti-immunoglobulin antibodies with unchanged avidity, which are suitable for use in particular for the most sensitive radioimmunological and enzymatic immunological methods in human and veterinary diagnostics, from hyperimmune sera.

V humánní i veterinární diagnostice řady infekčních onemocnění a patologických stavů jsou stále častěji používány nové techniky založené na vysoce citlivé a specifické reakci antigenu s protilátkou. V souSasné době jsou používány imunofluorescenční, radioimunologické a enzymimunologické techniky, u nichž je použito protilátek nebo antigenů označených fluorescenčním barvivém, radioizotopem nebo enzymem.In human and veterinary diagnosis of many infectious diseases and pathological conditions, new techniques based on highly sensitive and specific reaction of antigen with antibody are increasingly used. Immunofluorescent, radioimmunological and enzyme immunological techniques are currently used in which antibodies or antigens labeled with a fluorescent dye, radioisotope or enzyme are used.

Imunofluorescenční metoda je poměrně málo citlivá a obtížně hodnotitelná kvantitativně. Využívá-li označené protilátky, pak fluorescenčním barvivém bývá označena hrubě izolovaná imunoglobulinová frakce antiséra. V těchto preparátech je obsah specifických protilátek vykazujících požadovanou imunoreaktivitu nízký a velká většina označených proteinů vykazuje imunoreaktivitu mulovou nebo i nespecifickou. Radioimunologické a enzymimunologické techniky jsou extrémně citlivé a reakce se dají hodnotit kvantitativně. Na kvalitu indikátorů antigen-protilétkových reakcí, tj. na značené protilátky používané při těchto metodách, jsou však kladeny velmi přísné požadavky, protože jejich kvalita je přímo úměrná citli vosti metody i počtu vyšetření, která je možno provést.The immunofluorescence method is relatively insensitive and difficult to quantify. When using labeled antibodies, the coarse isolated immunoglobulin fraction of the antiserum is labeled with a fluorescent dye. In these preparations, the content of specific antibodies exhibiting the desired immunoreactivity is low and the vast majority of the labeled proteins exhibit mull or even non-specific immunoreactivity. Radioimmunological and enzymatic immunological techniques are extremely sensitive and the reactions can be quantitated. However, very stringent requirements are placed on the quality of the antigen-antibody response indicators, ie labeled antibodies used in these methods, as their quality is directly proportional to the sensitivity of the method and the number of tests that can be performed.

Dosavadní postup izolace specifických protilátek navázaných na imunosorbent v roztocích o vyšší iontové síle spočívá v jejich elucí, např. pomocí 0,2 M glycinového pufru o pH 2,8 (Affinity Chromatography, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden, 1974). Nevýhodou tohoto postupu je, že v důsledku příliš pevné vazby mezi protilátkou a antigenem navázaným na imunosorbent, dochází při izolaci k poškození molekuly protilátek a tím i k poklesu její avidity. Při dalším zpracování vypadávají dále izolované protilátky snadno z roztoku, což se projeví sníženým výtěžkem.The prior art procedure for the isolation of specific antibodies bound to immunosorbent in higher ionic strength solutions involves their elution, for example using 0.2 M glycine buffer at pH 2.8 (Affinity Chromatography, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden, 1974). The disadvantage of this procedure is that due to the too strong binding between the antibody and the antigen bound to the immunosorbent, isolation causes damage to the antibody molecule and thus decreases its avidity. In further processing, further isolated antibodies fall off easily from solution, resulting in reduced yield.

K odstranění shora uvedeného nedostatku směřuje způsob získávání třídově specifických antiimunoglobulinových protilátek s nezměněnou aviditou z hyperimunního séra podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že imunoglobulinová frakce, získaná z hyperimunního séra některým ze známých izolačních postupů, např. precipitací síranem amonným nebo iontoměničovou chromatografií, se dialysou nebo gelovou filtrací převede na roztok o iontové síle v rozmezí 0,001 až 0,01 a hodnotě pH v rozmezí 7,0 až 8,0, který se uvede do styku s imunosorbentem, na němž je navázán antigen, protilátky slabě vázané na antigen se z nosiče šetrně eluují roztokem o iontové síle v rozmezí 0,001 až 0,010 a hodnotě pH v rozmezí 2,5 až 3,5, nejvýhodněji 2,8 až 2,9, a získaný bílkovinný eluát se po úpravě pH na fyziologickou hodnotu převede do skladovatelné formy, např. zahuštěním nebo/a lyofilizací.A method for obtaining class-specific anti-immunoglobulin antibodies with unchanged avidity from the hyperimmune serum of the present invention is to eliminate the above drawback, characterized in that the immunoglobulin fraction obtained from hyperimmune serum by any of the known isolation methods, e.g. ammonium sulfate precipitation or ion exchange chromatography, is converted by dialysis or gel filtration to a solution with an ionic strength in the range of 0.001 to 0.01 and a pH in the range of 7.0 to 8.0, which is contacted with an antigen-bound immunosorbent, antibodies weakly bound to the antigen are eluted gently from the support with a solution having an ionic strength in the range of 0.001 to 0.010 and a pH in the range of 2.5 to 3.5, most preferably 2.8 to 2.9, and the resulting protein eluate is converted to a physiological value after pH adjustment forms, e.g., by concentration and / or lyophilization.

Získané protilátky rozdělené v ampulích á 0,5 až 1,0 mg je možno v lyofilizovaném stavu používat několik let. Protilátky jsou přímo použitelné k označení radioizotopem, např.The obtained antibodies, dispensed in ampoules of 0.5 to 1.0 mg, can be used in the lyophilized state for several years. The antibodies are directly useful for radioisotope labeling, e.g.

125125

J, nebo enzymem, např. peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou.J, or by an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase.

Uvedený způsob izolace je založen na výsledcích autorů Hardie, G. a Van Segenmortel,This isolation method is based on the results of Hardie, G. and Van Segenmortel,

Μ. Η. V., kteří v J. Immun. Meth. 5, 1977: 305 až 314 popsali izolaci specifických protilátek pomocí roztoků o nízké iontové síle z antisér proti viru tabákové mozaiky, hovězímu albuminu a lidskému gamoglobulinu. Vhodnost této metody byla v našich podmínkách ověřena a rozšířena o použití imunosorbentů CNBr Sepharose 4B (Pharmacia, Švédsko) a Ihsolmer (Sevac, ČSSR), o její využití k izolaci specifických protilátek proti jednotlivým třídám imunoglobulinú a o zjištění, že takto izolované specifické protilátky jsou mimořádně výhodné ke značení a použití při radioimunoanalýze a enzymimunoanalýze.Μ. Η. V., who in J. Immun. Meth. 5, 1977: 305 to 314 described the isolation of specific antibodies using low ionic strength solutions from antisera against tobacco mosaic virus, bovine albumin, and human gamoglobulin. The suitability of this method has been verified and extended in our conditions by the use of CNBr Sepharose 4B (Pharmacia, Sweden) and Ihsolmer (Sevac, Czechoslovakia) immunosorbents, its use for isolation of specific antibodies against particular classes of immunoglobulins and preferred for labeling and use in radioimmunoassay and enzyme immunoassay.

Příklad provedeníExemplary embodiment

Výchozím substrátem pro přípravu specifických antiimunoglobulinových'protilátek podle vynálezu je hyperimunní sérum imunizovaných zvířat, např. králíků.The starting substrate for the preparation of the specific anti-immunoglobulin antibodies of the invention is hyperimmune serum of immunized animals, e.g. rabbits.

Příprava substrátuPreparation of substrate

Králíci jsou imunizováni intradermálnš na šesti místech na hřbetě emulsí ve Freundově adjuvans. Celkový objem emulse 1,2 ml, dávka antigenu 1 až 3 mg. Po uplynutí jednoho měsíce jsou podány v desetidenním intervalu 2 intramuskulární injekce antigenu v adjuvans. Následují 3 každodenní subkutánní injekce antigenu v solubilní formě. Vykrvení se provede 5· den po poslední injekci.Rabbits are immunized intradermally at six sites on the back of emulsions in Freund's adjuvant. Total emulsion volume 1.2 ml, antigen dose 1 to 3 mg. After one month, 2 intramuscular injections of the antigen in the adjuvant are given every 10 days. This is followed by 3 daily subcutaneous injections of the antigen in soluble form. Bleeding is performed 5 days after the last injection.

Zpracování substrátuSubstrate processing

Ze 20 ml antisára se iontoměniiovou chromatografii nebo srážením síranem amonným izoluje imunoglobulinová frakce, která se zahustí na objem 10 až 20 ml a důkladně dialysuje proti deionizované vodě, jejíž pH bylo předem upraveno na 0,1 M NaOH na hodnotu 7 až 8.The immunoglobulin fraction is isolated from 20 ml of antisera by ion-exchange chromatography or ammonium sulfate precipitation, which is concentrated to a volume of 10 to 20 ml and thoroughly dialysed against deionized water, the pH of which has been previously adjusted to 0.1 M NaOH to 7-8.

Kolonka CNBr Sepharozy 4B s navázaným antigenem (2 x 10 cm) se promyje 100 až 200 ml deionizované vody o pH 7 až 8. Na kolonku se pak nanese připravený roztok imunoglobulinové frakce antiséra a nechá se protékat rychlostí 10 ml za hodinu. Po důkladném promytí kolonky cca 150 až 200 ml vody o pH 7 až 8 sé protilátky navázané na antigén eluují vodou, jejíž pH bylo předem upraveno 0,1 M HC1 na hodnotu 2,8.The antigen-bound CNBr Sepharozy 4B column (2 x 10 cm) was washed with 100-200 ml of deionized water at pH 7-8. The prepared immunoglobulin fraction of the antiserum was then applied to the column and allowed to flow at a rate of 10 ml per hour. After thoroughly washing the column with about 150 to 200 ml of water at pH 7-8, the antibody bound to the antigen elutes with water whose pH has been pre-adjusted with 0.1 M HCl to 2.8.

Získaný bílkovinný eluét je tvořen specifickými protilátkami proti použitému antigenu. Výtšžek je vyšší než 1 mg protilátek z 1 ml antiséra.The obtained protein eluate is composed of specific antibodies against the antigen used. The yield is greater than 1 mg of antibody per ml antiserum.

Eluovaný roztok se upraví na hodnotu pH 7 až 8, zahustí na potřebnou koncentraci, nadávkuje do ampuli a lyofilizuje.The eluted solution is adjusted to pH 7-8, concentrated to the desired concentration, dispensed into an ampoule and lyophilized.

125125

Při oznaSenl takto získaných protilátek pomocí J se běžné získává roztok, v němž je na 0,5 mg protilátek navázána aktivita 10 x 10θ „mp/min. Z tohoto čerstvého základního roztoku se připraví až 20 000 ml inkubačního roztoku, který postačuje pro radioimunologické vyšetření ve 400 000 mikrozkumavkách.Labeling of the antibodies thus obtained with J generally yields a solution in which the activity of 0.5 mg of antibodies is coupled to 10 x 10θ mp / min. From this fresh stock solution, prepare up to 20 000 ml of incubation solution, which is sufficient for radioimmunoassay in 400 000 microtubes.

Při hodnocení avidity takto izolovaných specifických protilátek se používá několik metod. Při hrubé orientaci se srovnává precipitační aktivita roztoků izolovaných protilátek s aktivitou antiséra. Již roztok specifických protilátek o koncentraci 0,5 mg protilátky v 1 ml použitý při imunoelektroforéze k precipitaci antigenu vytváří dobře viditelné precipitační linie a roztok o koncentraci 1 až 2 mg protilátek v 1 ml je srovnatelný s dobrým až velmi dobrým antiséřem.Several methods are used to assess the avidity of such specific antibodies. In a coarse orientation, the precipitation activity of isolated antibody solutions is compared to that of an antiserum. Even a solution of specific antibodies of 0.5 mg antibody per ml used in immunoelectrophoresis to precipitate the antigen forms well visible precipitation lines and a solution of 1 to 2 mg antibodies per ml is comparable to a good to very good antiserum.

i 25i 25

Označení specifických protilátek radioaktivním izotopem, např, J, poskytuje řadu možností jednoduchého a přesného kvantitativního hodnocení jejich avidity. Např. při inkubaci roztoku označených specifických protilátek s antigenem navázaným na imunosorbent dochází k reakci antigen-protilátka a tím k vymizení radioaktivity z roztoku. Po oddělení imunosorbentu ůd roztoku a určení jejich aktivit je možno přesně určit aviditu protilátek, tj. kolik procent protilátek reagovalo specificky s antigenem. Nespecifické vazbě protilátek na imunosorbent se přitom Spolehlivě zabrání přidáním neaktivní bílkoviny - albuminu.Labeling specific antibodies with a radioactive isotope, e.g., J, provides a number of options for a simple and accurate quantitative evaluation of their avidity. E.g. incubation of a solution of labeled specific antibodies with an antigen bound to an immunosorbent results in an antigen-antibody reaction and thus disappears from the solution. After separating the immunosorbents from the solution and determining their activities, the avidity of the antibodies can be accurately determined, i.e. how many percent of the antibodies reacted specifically with the antigen. Non-specific binding of antibodies to the immunosorbent is reliably prevented by the addition of an inactive protein, albumin.

Z dosahovaných výsledků vyplývá, že zmíněný způsob izolace protilátek téměř neovlivňuje jejich aviditu. čerstvě připravené roztoky označených protilátek dosahují aviditu až 90 %. Po 2 měsících je avidita ještě vyšší než 50 %.The results obtained show that this method of antibody isolation hardly affects their avidity. freshly prepared solutions of labeled antibodies achieve avidity of up to 90%. After 2 months the avidity is still higher than 50%.

V našich pokusech se roztoky ¹²^J-protilátek používají běžně déle než 6 měsíců po označení, což je s přihlédnutím na postupující radiační a chemické poškození protilátek velmi uspokojivé. V té době je jejich imunoreaktivita stále ještě vysoká a 26,6 % z celkové radioaktivity obsahuje označené protilátky precipitující s daným antigenem.In our experiments, ¹² µg-antibody solutions are commonly used for more than 6 months after labeling, which is very satisfactory considering the progressive radiation and chemical damage to the antibodies. At that time, their immunoreactivity is still high and 26.6% of the total radioactivity contains labeled antibodies precipitating with the antigen.

Obdobně 2 mg specifických protilátek označených peroxidázou postačují k provedení vyšetření nejméně v 50 000 mikrozkumavkách. Doba použitelnosti protilátek označených enzymemSimilarly, 2 mg of peroxidase-labeled specific antibodies are sufficient to perform the assay in at least 50,000 microtubes. Shelf life of enzyme-labeled antibodies

125 je několik let. Kontrola třídové monospecifioity těchto protilátek označených <1 se provádí radioimunoelektroforeticky. Při této metodě je počáteční postup stejný jako při běžné imunoelektroforéze. Krevní sérum nebo kolostrum nanesené do jamek (startů) v agaru je po elektroforetickém rozdělení precipitováno antisérem proti sérovým a kolostrálním bílkovinám125 is several years old. Class monospecificity of these <1-labeled antibodies is checked by radioimmunoelectrophoresis. In this method, the initial procedure is the same as in conventional immunoelectrophoresis. Blood serum or colostrum deposited in the agar wells is precipitated by antisera against serum and colostral proteins after electrophoretic separation.

Antisérum nanesené do žlábků vytváří s jednotlivými sérovými bílkovinami precipitační linie. Kvalitní antiséra vytvářejí 15 až 20 precipitačních linií se všemi třídami imunoglobulinů i řadou dalších proteinů od makroglobulinů po albuminy. Při radioimunoelektroforéze 125 jsou k antiséru nanášenému do jednotlivých žlábků přidána nepatrná množství J specifických protilátek. Tyto označené protilátky se pak spoluúčastnf tvorby precipitačních linií.Antiserum deposited in the grooves forms precipitation lines with individual serum proteins. High-quality antisera form 15 to 20 precipitation lines with all classes of immunoglobulins as well as many other proteins from macroglobulins to albumins. In radioimmunoelectrophoresis 125, tiny amounts of J specific antibodies are added to the individual antiserum. These labeled antibodies are then involved in the formation of precipitation lines.

Jsou-li použité označené protilátky monospecifické, účastní se tvorby pouze jediné, přesně určené precipitační linie a s jinými proteinovými antigeny nereagují. To značí, že po vyprání je radioaktivita obsažena pouze v dané precipitační linii. Na vypraný imunoelektroforeogram je pak přiložen rtg film na dobu 2 až 3 dny. Linie exponované na rtg filmu přesné ukazují, se kterými proteiny označené protilátky reagují. Touto metodou byly testovány specifické protilátky proti hovězím i prasečím imunoglobulinům XgG, IgA a IgM a byla prokázána jejich vysoká monospecificita.When the labeled antibodies used are monospecific, they only participate in the formation of a single, well-defined precipitate line and do not react with other protein antigens. This indicates that after washing, the radioactivity is contained only in a given precipitation line. The washed immunoelectropherogram is then coated with an X-ray film for 2 to 3 days. The lines exposed to the X-ray film accurately indicate with which the proteins labeled with the antibody react. Specific antibodies against bovine and porcine immunoglobulins XgG, IgA and IgM were tested and demonstrated their high monospecificity.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method for obtaining class-specific anti-immunoglobulin antibodies with unchanged viscosity from hyperimmune serum, comprising isolating the immunoglobulin fraction from the hyperimmune serum by any of the known isolation methods, e.g. ammonium sulfate precipitation or ion exchange chromatography, characterized in that the immunoglobulin fraction is dialysed or gel filtered having an ionic strength in the range of 0.001 to 0.010 and a pH in the range of 7.0 to 8.0 which is contacted with the immunosorbent to which the antigen is bound, the antigen-bound antibodies are eluted from the support with an ionic strength in the range of 0.001 to about 0.010 and a pH in the range of from about 2.5 to about 3.5, preferably about 2.8, and the obtained protein eluate is converted into a storable form, for example by concentration and / or lyophilization, after adjusting the pH to physiological value.