CS210897B1 - Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům imunoglobulinům tříd IgG skotu a prasat - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům tříd IgG skotu a prasat použitelných ve veterinární medicíně a imunodiagnostice. Účelem vynálezu je stanovení účinného a poměrně jednoduchého způsobu přípravy komplexní řady třídově specifických antisér, která dosud nejsou v tomto rozsahu v zemích RVHP vyráběna ani dostupná a přitom jsou velmi nutná ve výzkumu i při rozvoji nových moderních imunodiagnostiokých metod. Uvedeného účelu se dosáhne tím, ie při přípravě antisér je použita vhodná forma antigenu - těžké řetězce imunoglobulinových molekul, v kombinaci s účinným imunizačním postupem, který zajištuje stálý vzestup precipitační aktivity antisér. Třídová specifita těchto antisér je dosažena jejich jednoduchým vysycením, např. pomocí imunosorbentů s navázanými imunoglobuliny jiných tříd. Vynálezu může být využito také pro komerční účely v podnicích zabývajících se výrobou biopreparátů a imunodiagnostik.

Description

Předmětem vynálezu je způsob přípravy vysoce avidních precipitačnich antisér proti imunoglobulinům tříd IgG skotu a prasat.

Při přípravě monospec if ických antisér proti jednotlivým třídám imunoglobulinů je nutné zvířata imunizovat ideálně čistými proteiny, k jejichž izolaci je používána gelová filtrace, iontoměničová chromatografie, isoelektrická fokusace, ultracentrifugace, preparativní elektroforéza, imunoelektroforéza a řada jiných metod. Ani použití těchto postupů však většinou nezaručuje absolutní čistotu izolovaných imunoglobulinů.

Stopy příměsí vyvolávají tvorbu protilátek s nežádoucí specifitou a vyrobená antiséra vytvářejí precipitačni linie nejen s požadovaným, ale i s jinými třídami imunoglobulinů a dalšími vysoce antigenními proteiny, jako jsou například lipoprotein, alfa-2-makroglobulin nebo transferrin. U řady zvířat používaných k produkci antisér, zejména u králíků, je třeba počítat i s tím, že vytvořené protilátky reaguji nejen s třídově specifickými antigenními determinantami těžkých řetězců, ale i s determinantami lehkých řětězců, které jsou pro všechny třídy imunoglobulinů společné. Příprava třídově specifických a dostatečně avidních antisér je proto značně náročná po odborné i materiální stránce.

Potřeba třídově specifických antisér ve veterinární medicíně stále vzrůstá s rozvojem nejrůznějších metod, které jsou používány nejen v imunologickém, bakteriologickém, virologickém, parazitologickém, popřípadě i jiném výzkumu, ale i při praktické diagnostice nejrůznějších patofyziologických stavů. Tím citelněji se projevuje nedostatek jednoduchého způsobu získávání třídově specifických antisér pro zmíněné účely.

Obtíže spojené se získáváním třídově specifických a avidních antisér proti imunoglobulinovým třídám skotu a prasat, zahrnujícím přípravu ideálně čistých tříd imunoglobulinů jako antigenů k imunizaci zvířat a vlastní imunizaci zvířat, odstraňuje způsob přípravy antisér podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že zvolená zvířata - s výhodou králíci - se podrobí imunizaci specifickými, tj. těžkými řetězci imunoglobulinových molekul tříd IgG nejdříve intradermálně, antigenem v kompletním Freundově adjuvans, a teprve po vytvoření imunitní paměti se imunizují intramuskulárně nebo subkutánně antigenem v inkompletním adjuvans a v solubilní formě. Antiséra získaná vykrvením zvířat 6. až 7. den po poslední imunizaci se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem jiné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul.

Způsob přípravy antisér podle vynálezu je vhodný k přípravě třídově specifických antisér proti jednotlivým třídám a zejména podtřídám IgG imunoglobulinů, které dosud známým způsobem nelze jednoduše připravit.

Hovězí a prasečí imunoglobuliny tříd IgG k provedení imunizace podle vynálezu se získávají z krevních sér nebo z kolostrální syrovátky. Krevní sérum je zdrojem prasečích imunoglobulinů IgG a hovězích imunoglobulinů IgG2, z kolostrální syrovátky se získávají hovězí imunoglobuliny IgG1. Z těchto médií se imunoglobuliny tříd IgG izolují gelovou filtrací na kolonách Sephadexu G 200 a iontoměničovou chromatografii na DEAE Sephadexu A 50.

Získané roztoky jednotlivých tříd imunoglobulinů se pak podrobí štěpení a postupem podle Franěk, F., Zikán. J. (Collect. Czech. Chem. Commun. 1964, 29, s. 1401) získané těžké řetězce uvedených imunoglobulinů se přímo použijí k imunizaci modifikovaným postupem podle Metzger. J. J., Houdayer, M. (Eur. J. Immunol. 1972, 2, s. 127). Po vysycení antisér lehkými řetězci imunoglobulinových molekul se získají antiséra reagující specificky pouze s imunoglobuliny požadované třídy.

Příklad provedení přípravy antisér

Při přípravě antisér se používají purifikované prasečí a hovězí IgG imunoglobuliny co nejvyšší čistoty, které nesmí obsahovat žádné stopy přítomnosti imunoglobulinů IgA a IgM.

Čistota hovězích IgG2 a praseěích IgG imunoglobulinů, hodnocené jednoduchou radiální imunodifúzí podle Manciniové, se vyžaduje vyěěí než 99,9 %· U hovězích IgG1 imunoglobulinů se vyžaduje čistota vyšší než 93 % s oo nejnižším obsahem IgG2. Připravené imunoglobuliny nesmí obsahovat žádné stopy přítomnosti imunoglobulinů IgA a IgM. Z těchto praseěích a hovězích imunoglobulinů se připraví těžké řetězce imunoglobulinových molekul..

Při přípravě jednotlivých třídově specifických antisér se dodržuje následující jednotná imunizaění schéma, podle následujícího příkladu přípravy králičího třídově specifického antiséra proti hovězímu imunoglobulinů IgG1. Při postupu je třeba dodržet požadavek, aby koncentrace antigenu (těžké řetězce hovězího IgGI) v roztocích použitých při přípravě emulzí pro 2 a 3 imunizaci (0,5 až 1,0 mg/ml) byla několikanásobně vyšší než při prvé imunizaci (0,05 až 0,1 mg/ml).

Při prvé imunizaci těžkými řštězoi hovězího IgGI se králík intradermálně injikuje emulzí připravenou smíšením i objemu roztoku antigenu o koncentraci 0,05 až 0,1 mg/ml a 2 objemů kompletního Freundova adjuvans (á 0,2 ml emulze i. d. na 6 míst na hřbetě). Za 1 měsíc následují v desetidenním intervalu 2 a 3 intramuskulárnJ? injekce emulze, připravené smíšením 1 objemu roztoku antigenu o koncentraci*0,5 až 1,0 mg/ml)a 2 objemů ihkompletního adjuvans (á 0,5 ml emulze i. m. na 6 míst). 10 až 12 den po 3 imunizaci následují ve třech dnech 4 až 6 injekce roztoků antigenu (2,5, 2,5 a 10 mg IgGI). Z úsporných důvodů je možno pro 4 až 6 imunizaci použít i nerozštěpený IgGI.

Tyto poslední injekce ještě dále zvyšují precipitačni aktivitu králičího antiséra. Po vykrvení králíka, které následuje 6 až 7 den po poslední injekci antigenu, se z krve izoluje krevní sérum. Získané antisérum není zatím třídově specifické a reaguje nejen s IgGI, ale také s lehkými řetězci ostatních tříd imunoglobulinů. K odstranění třídově nespecifických protilátek se provede vysycení antiséra pomocí imunosorbentu (CNBr Sepharose 4B, Sevatest-Insolmer), na který je navázán imunoglobulin jiné třídy (např. IgG2, IgM) nebo lehké řetězce Ig molekul. Vysycování se podle potřeby opakuje. Antisérum po vysycení je třídově specifické, reagujíoí pouze se specifickým, tj. těžkým řetězcem molekuly hovězího IgGI.

Podle stejného postupu a při dodržení stejných zásad se provádí příprava třídově specifického králičího antiséra proti prasečímu IgG (hovězímu IgG2). K odstranění třídově nespecifických protilátek se v tomto případě použije imunosorbent s navázaným prasečím IgM nebo lehkými řetězci prasečích Ig molekul (hovězí IgG1, IgM nebo lehké řetězce hovězích Ig).

Předmět vynálezu řeší dílčím způsobem přípravu třídově specifických antisér proti imunoglobulinovým třídám IgG skotu a prasat. Problém byl řešen komplexně a přípravu antisér proti třídám IgM a IgA skotu a prasat řeší čs. AO 210 898.

Požadované vlastnosti třídově specifických antisér proti prasečím a hovězím třídám imonoglobulinů získaných podle vynálezu se dokazují imunoprecipitačnlmi testy v agaru: dvojitou radiální imunodifúzl (Ouchterlony) a imunoelektroforázou. Třídově specifické antisérum proti hovězímu imunoglobulinů IgGI (IgG2) smí vytvářet precipitačni linii pouze s IgGI (IgG2), ale ne s IgG2 (IgG1), IgM a IgA imunoglobuliny. Při imunoelektroforéze smí toto antisérum vytvářet pouze jedinou precipitačni linii, odpovídající svou polohou danému imunoglobulinů. Stejně tak třídově specifické antisérum proti prasečímu IgG smí vytvářet precipitačni linii pouze s IgG, ale ne s IgM a IgA.

Claims (1)

1. VYNÁLEZU

   Způsob přípravy třídově specifických vysoce avidnich precipitačních antisér proti imunoglobulinovým třídám IgG skotu a prasat, vyznačující se tím, že se produkční zvířata - s vý hodou králíci - nejprve intradermálně imunizují těžkými řetězci imunoglobulinových molekul zvolené třídy IgG o koncentraci antigenu 0,05 až 0,1 mg/ml v kompletním Freundově adjuvans, po vytvořeni imunitní paměti se dvakrát intramuskulárně imunizují těžkými řetězci imunoglobulinových molekul zvolené třídy XgG o koncentraci antigenu 0,5 až 1,0 mg/ml v inkompletnim adjuvans, potom se parenterálně imunizují těžkými řetězci imunoglobulinových molekul zvolené třídy IgG v dávce antigenu 2 až 10 rag v jedné injekční dévce v solubilní formě, potom se produkční zvířata vykrví 6 až 7 den po poslední injekci antigenu a získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.