CS209196B1 - Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives - Google Patents
Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- CS209196B1 CS209196B1 CS571776A CS571776A CS209196B1 CS 209196 B1 CS209196 B1 CS 209196B1 CS 571776 A CS571776 A CS 571776A CS 571776 A CS571776 A CS 571776A CS 209196 B1 CS209196 B1 CS 209196B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- ergotoxin
- culture
- extracted
- ergometrine
- aqueous
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 6-[4-[(6ar,9r,10ar)-5-bromo-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4h-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carbonyl]piperazin-1-yl]-1-methylpyridin-2-one Chemical class O=C([C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC(Br)=C(C=34)C2)C1)C)N(CC1)CCN1C1=CC=CC(=O)N1C AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 48
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- XLMJRFCCCWFQRE-SJRQCXNHSA-N ecboline Chemical group C([C@H]1[C@]2(O)O3)CCN1C(=O)CN2C(=O)[C@]3(C(C)C)NC(=O)[C@@H](CN(C)[C@@H]1C2)C=C1C1=C3C2=CNC3=CC=C1 XLMJRFCCCWFQRE-SJRQCXNHSA-N 0.000 claims description 42
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 23
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical group C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 claims description 22
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 21
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 claims description 20
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 claims description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000221751 Claviceps purpurea Species 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical class OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical class [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- -1 ethyl acetate Chemical class 0.000 claims description 7
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- FWWOWPGPERBCNJ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-4-oxobutanoic acid Chemical compound OCCOC(=O)CC(O)C(O)=O FWWOWPGPERBCNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 claims description 4
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 4
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000000908 ammonium hydroxide Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- HEEACTTWORLLPM-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-imidazol-5-yl)ethanol Chemical compound OCCC1=CNC=N1 HEEACTTWORLLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims 1
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 6
- QHZUABXEBRGBLP-LKWYKXIFSA-N (6aR,9R,10aR)-N-[(2R,4R,9aS,9bR)-4-benzyl-9b-hydroxy-3,5-dioxo-2-propan-2-yl-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide (6aR,9R,10aR)-N-[(2R,4R,9aS,9bR)-9b-hydroxy-3,5-dioxo-2,4-di(propan-2-yl)-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide (6aR,10aR)-N-[(2S,4S,9bS)-9b-hydroxy-4-(2-methylpropyl)-3,5-dioxo-2-propan-2-yl-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O.CS(O)(=O)=O.CS(O)(=O)=O.C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@]3(C(=O)C4[C@H](C(N5CCC[C@H]5[C@]4(O)O3)=O)C(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1.C1=CC([C@H]2CC(CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@@]3(C(=O)C4[C@@H](C(N5CCCC5[C@@]4(O)O3)=O)CC(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1.C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(C21)=O)(NC(=O)[C@H]1CN(C)[C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 QHZUABXEBRGBLP-LKWYKXIFSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 2
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 2
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- XJOOMMHNYOJWCZ-UHFFFAOYSA-N Agroclavine Natural products C1=CC(C2C=C(C)CN(C2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 XJOOMMHNYOJWCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221760 Claviceps Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SAHHMCVYMGARBT-UHFFFAOYSA-N Isochanoclavine I Natural products C1=CC(C(C(NC)C2)C=C(C)CO)=C3C2=CNC3=C1 SAHHMCVYMGARBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116349 dibasic ammonium phosphate Drugs 0.000 description 1
- YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N diphosphonate Chemical compound O=P(=O)OP(=O)=O YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentoxide Inorganic materials O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
(54) Způsob fermentativní výroby derivátů ergolinu(54) A method of fermentative production of ergoline derivatives
Vynález se týká způsobu průmyslového získávání derivátů ergolinu, zejména alkaloidů a 9,10-dihydroalkaloidů skupiny ergotoxinu, jakož i ergometrinu, při němž se kultivuje nový kmen Claviceps purpurea (Fr.) Tul. submersně v umělých prostředích a při tom vzniklé námelové alkaloidy se získávají z fermentaění kapaliny a popřípadě hydrogenují v poloze 9,10. Vysoká terapeutická hodnota těchto alkaloidů a 9,10-dihydroalkaloidů je známa a tyto se používají v interním lékařství, neurologii a gynekologii.The invention relates to a process for the industrial recovery of ergoline derivatives, in particular alkaloids and 9,10-dihydroalkaloids of the ergotoxin group, as well as ergometrine, in which a new strain of Claviceps purpurea (Fr.) Tul is cultivated. Submerged in artificial environments and ergot alkaloids formed therefrom are obtained from fermentation of the liquid and optionally hydrogenated at the 9,10 position. The high therapeutic value of these alkaloids and 9,10-dihydroalkaloids is known and is used in internal medicine, neurology and gynecology.
Průmyslové získávání námelových alkaloidů se ještě dnes, jak je známo, provádí ve velkém rozsahu polní kultivací skleyocií mikroorganismu Claviceps purpurea, parazitujícího na žitu, obsahujících alkaloidy. Aby se obešly s tímto spojené nevýhody, konají se již delší dobu pokusy přimět Claviceps purpurea k tvorbě alkaloidů i za neparasitárních podmínek.The industrial recovery of ergot alkaloids is still known to a large extent by field cultivation of alkaloid-containing Claviceps purpurea microorganisms, parasitic on rye, to a large extent. In order to overcome the associated disadvantages, attempts have been made for a long time to induce Claviceps purpurea to form alkaloids even under non-parasitic conditions.
Podle všeobecných zkušeností se pro takovouto biosyntézu námelových alkaloidů, prováděnou při kultivaci na umělých prostředích, hodí jen velmi málo výslovně k tomuto účelu kultivovaných kmenů Claviceps.According to general experience, very little specifically for cultivated strains of Claviceps is suitable for such ergot alkaloid biosynthesis when cultivated on artificial environments.
Vzhledem k tomu, že složení spektra alkaloidů těchto kmenů je v souladu s místem výskytu různé, tvoří opět pouze část z nich alkaloidy skupiny ergotoxinu, které se terapeuticky liší od obzvláště cenných námelových alkaloidů typu peptidů.Since the spectrum of the alkaloids of these strains varies according to their location, only part of them are ergotoxin-type alkaloids, which differ therapeutically from the particularly valuable ergot-like alkaloids of the peptide type.
Přes existenci několika takových, v podrobnostech blíže popsaných kmenů (srovnej maďarský patentový spis č. 150 380, DD patentový spis 41 967, brit. patentový spis 1 158 380, DE patentové spisy 1 806 984, 1 909 216) není však problém saprofytického získávání alkaloidů skupiny ergotoxinů samotných nebo v kombinaci s jinými námelovými alkaloidy v průmyslovém měřítku v žádném případě vyřešen. Pro kontinuální výrobu je předpokladem, že je běžně k dispozici ve velkém množství, jakož i jednoduchým a bezpečným způsobem dosažitelný, produkce schopný výchozí meteriál kmene jako inokulum pro fermentaění proces. K tomuto v technické mikrobiologii obvyklá a nejpříznivější metoda spočívá v použití speciálních ' rozmnožovacích jednotek organismu (konidiospor), které dovolí nejen udržet stálé, požadované vlastnosti kmene po mnoho roků pomocí lyofilizovaných konserv spor, bez nejvýš kompli209196 kovaného a nákladného vedení kmene, jak je to popsáno v DE patentovém spise č. 1 206 384, nýbrž především na základě jejich vysokého počtu na objemovou jednotku naočkovat malým množstvím inokula velká množství živného roztoku.Despite the existence of several such strains described in more detail (cf. Hungarian Patent Specification No. 150 380, DD Patent Specification 41 967, British Patent Specification 1 158 380, DE Patent Specifications 1 806 984, 1 909 216), there is no problem of saprophytic recovery alkaloids of the ergotoxin family alone or in combination with other ergot alkaloids on an industrial scale are by no means solved. For continuous production, it is a prerequisite that a production capable of starting the batch material as an inoculum for the fermentation process is commercially available in large quantities as well as obtainable in a simple and safe manner. To this end, the most common and favorable method in technical microbiology is the use of special 'conidiospores' which allow not only to maintain stable, desirable strain characteristics for many years using freeze-dried canned spores, without the most complicated and costly strain management as as described in DE 1 206 384, but mainly due to their high number per volume unit, to inoculate large amounts of nutrient solution with a small amount of inoculum.
Použití této metody předpokládá určitou, rovněž v dědičném materiálu fixovanou vlastnost kmene, totiž za odpovídajících podmínek vytvořit velký počet spor s vysokou potencí k biosyntéze alkalodiů, takže se naočkování živného roztoku může provádět i při velkoprovozních podmínkách suspensí konidiospor. Ale právě tato vlastnost chybí úplně nebo téměř úplně, jak je to jasně zřejmé z maďarského patentového spisu č. 150 631, jakož i u AMICI aj. (Appl. Microbiology 18 (1969), str. 464-468), popsaným kmenům Claviceps purpurea, tvořícím v saprofytické kultuře alkaloidy skupiny ergotoxinu, takže v důsledku nutného mezistupně pomnožování očkovacího materiálu na pevných živných půdách a potřebné homogenizace takto získaného mycelia za sterilních podmínek pro zařízení předkultur dochází k nepříznivým předpokladům pro objem průmyslové výroby.The use of this method presupposes a certain property of the strain, which is also fixed in the hereditary material, namely to create a large number of spores with high potency to alkaline biosynthesis under appropriate conditions, so that inoculation of the nutrient solution can be carried out under conidospore suspensions. But this characteristic is absent completely or almost completely, as is clear from Hungarian Patent Specification No. 150,631 and AMICI et al. (Appl. Microbiology 18 (1969), pp. 464-468) to the described strains of Claviceps purpurea, forming the alkaloids of the ergotoxin group in the saprophytic culture, so that due to the necessary intermediate step inoculation of the inoculum material on solid culture media and the necessary homogenization of the mycelium thus obtained under sterile conditions for preculture equipment, unfavorable prerequisites for industrial production volume occur.
Ze známých pramenů rovněž vyplývá, že u těchto tvůrců ergotoxinu přechází až do ukončení fermentačního procesu pouze malá část ergotoxinu, vznikajícího v buňkách, buněčnou stěnou do okolního vodného kultivačního prostředí.It is also apparent from known sources that in these ergotoxin generators only a small portion of the cell-derived ergotoxin passes through the cell wall into the surrounding aqueous culture medium until the fermentation process is complete.
Podle toho je pro úplné získání vytvořeného alkaloidu nezbytné oddělené zpracování jak filtrátu kultury, tak i mycelia. Vysoký podíl pigmentu a balastních látek, který je zpravidla tvořen takovými kmeny, které se hodí pro biosyntézu námelových alkaloidů v submersní kultuře, je kromě toho příčinou komplikovaného způsobu zpracování, při neuspokojivých výtěžcích látek. Tak se podle GB patent, spisu č. 1 158 380 extrahuje získaný filtrát kultury chloroformem při pH 9, získaný extrakt se extrahuje vodnou kyselinu vinnou, takto získaný vodný extrakt se extrahuje znovu chloroformem při pH 9 a tento éxtrakt se spojí s čištěným extraktem mycelia, získaným podobně komplikovaným způsobem, odpaří se a surové báze alkaloidu se vysrážejí hexanem. Ze získané sraženiny se oddělí ledovou kyselinou octovou, methanolem a kyselinou sírovou síran ergotaminu, zbytek se odpaří, jeho vodný roztok se při pH 9 znovu extrahuje chloroformem, koncentrovaný chloroformový extrakt se chromatografuje na lOOnásobném množství silikagelu a konečně se takto vyčištěný ergokryptin izoluje jako báze z benzenu. Z další chromatografické frakce se po odpaření a rozpuštění zbytku ve vodném acetonu získá další ergotamin.Accordingly, separate treatment of both the culture filtrate and the mycelium is necessary to completely recover the formed alkaloid. In addition, the high proportion of pigment and ballast substances, which is generally made up of strains which are suitable for the ergot alkaloid biosynthesis in submersible culture, is also the cause of the complicated treatment process, with unsatisfactory yields of the substances. Thus, according to GB patent 1,158,380, the culture filtrate obtained is extracted with chloroform at pH 9, the extract obtained is extracted with aqueous tartaric acid, the aqueous extract thus obtained is extracted again with chloroform at pH 9 and this extract is combined with the purified mycelium extract, obtained in a similarly complicated manner, evaporated and the crude alkaloid bases precipitated with hexane. The precipitate obtained is separated with glacial acetic acid, methanol and sulfuric acid, ergotamine sulphate, the residue is evaporated, its aqueous solution is extracted again with chloroform at pH 9, the concentrated chloroform extract is chromatographed on 100 times silica gel and finally the purified ergocryptin is isolated as a base from benzene. Further ergotamine is obtained from the next chromatographic fraction after evaporation and dissolution of the residue in aqueous acetone.
Ani další vývoj obecných způsobů, uvedených v GB patentovém spise č. 1 158 380 a US patentovém spise č. 3 485 722, pro izolaci peptidických námelových alkaloidů nevedl u kultur dole blíže popsaného nového kmene Claviceps purpurea k úspěchu. Rušivě se při tom projevil především silný sklon filtrátu kultury a extraktu mycelia k tvorbě emulse při extrakci chloroformem. Dále se nepodařilo ani převést ergotoxin v krystalickou bázi ani dosáhnout v jiných patentových spisech uvedených výtěžků u nekiystalických koncentrátů čistého a surového alkaloidu.Furthermore, the further development of the general methods disclosed in GB 1,158,380 and US 3,485,722 for the isolation of peptic ergot alkaloids did not succeed in the cultures of the new strain of Claviceps purpurea described below. Above all, the strong tendency of the culture filtrate and mycelium extract to form an emulsion during chloroform extraction was particularly disturbing. Furthermore, it has not been possible either to convert ergotoxin in a crystalline base or to achieve the above-mentioned yields in the non-crystalline concentrates of pure and crude alkaloid in other patents.
Podle DD patentu č. 41 967 se extrakt získaný o sobě známým způsobem ze suspense kultury obsahující malé koncetítrace alkaloidů, který obsahuje vedle sebe ergotoxin a erometrin, chromatografuje elučními činidly s rostoucí polaritou a jednotlivé alkaloidy se krystalují o sobě známým' způsobem. Je vsak všeobecně známo, že eluce rozpouštědly obsahujícími methanol vede k ergo-; metrinu s neuspokojivě vysokými podíly pigmentu.According to DD Patent No. 41,967, an extract obtained in a manner known per se from a culture suspension containing low concentrations of alkaloids containing ergotoxin and erometrine side by side is chromatographed with increasing polarity eluents and the individual alkaloids are crystallized in a manner known per se. However, it is well known that elution with solvents containing methanol leads to ergo-; with unsatisfactorily high pigment contents.
Tlaková hydrogenace ergotoxinu se provádí podle DE patentového spisu č. 883 153 a kanadského patentového spisu č. 470 573 vysoce aktivním paládiem, popřípadě paládiem fixovaným na nosiči. Takovýto způsob vede, zřejmě v důsledku neuspokojující selektivity, k nežádoucímu obsahu pigmenu v hydrogenaěních produktech, v důsledku čehož jsou nezbytné další čisticí kroky.The pressure hydrogenation of ergotoxin is carried out according to DE 883 153 and Canadian patent 470 573 with highly active palladium or supported palladium. Such a process, apparently due to unsatisfactory selectivity, results in an undesirable pigment content in the hydrogenation products, which necessitates further purification steps.
Účelem vynálezu je zlepšit průmyslovou výrobu derivátů ergolinu, zejména alkaloidu a 9,10-dihydroalkaloidů skupiny ergotoxinu, jakož i ergometrinu. Klade si za záklaní úlohu uvést odpovídající způsob.The purpose of the invention is to improve the industrial production of ergoline derivatives, in particular alkaloid and 9,10-dihydroalkaloids of the ergotoxin family, as well as ergometrine. It sets out to provide the appropriate method.
Bylo nalezeno, že kmen Claviceps purpurea (Fr.) Tul, který tvoří za přítomnosti umělých živných prostředí, obsahujících anorganické sloučeniny dusíku, cukr, organické kyseliny a obvyklé anorganické soli, v submersní kultuře alkaloidy skupiny ergotoxinu, ergometrům, jakož i další deriváty ergolinu, vykazuje jak pro průmyslové využití velmi příznivou syntézu alkaloidů, tak také tvoří na pevných nebo kapalných médiích za určitých podmínek množství spor s vysokou potencí pro syntézu alkaloidů, nejvýš výhodné pro fermentačně technické zájmy.It has been found that the strain Claviceps purpurea (Fr.) Tul, which forms in the presence of artificial nutrients containing inorganic nitrogen compounds, sugar, organic acids and common inorganic salts, in submersible culture of ergotoxin group alkaloids, ergometers, as well as other ergoline derivatives, shows, for industrial use, a very favorable alkaloid synthesis, and also forms spores with high potency for alkaloid synthesis, under certain conditions, under certain conditions, most advantageous for fermentation-technical interests.
Kromě toho je vytvořený ergotoxin ze značné části a ergometrin jako obvykle .prakticky úplně obsažen ve fermentačním prostředí obklopujícím mycelium.In addition, the ergotoxin formed is largely contained and, as usual, ergometrine is completely contained in the fermentation environment surrounding the mycelium.
Dále bylo nalezeno, že se filtrát kultury, získaný filtrací suspense kultury nového kmene Claviceps purpurea, bez zředění, avšak lépe po zředění stejným objemem vody, nastavený amoniakem na hodnotu pH 8 až 9, dá extrahovat nízkými estery i alkankarboxylových kyselin, jejichž složku kyseliny představuje kyselina octová a jejichž alkoholickou složku představuje alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethylacetátem, u varianty zředění však i chlorovanými uhlovodíky, s výhodou methylenchloridem, prakticky úplně a bez rušivé tvorby emulze. Při tom dochází u varianty zředění vedle požadovaného sníženi podílu balast; nich látek k překvapivě významnému zvýšení i množství ergotoxinu obsaženého ve filtrátu kul: tury.It has further been found that the culture filtrate obtained by filtration of the culture suspension of the new strain of Claviceps purpurea, without dilution, but preferably after dilution with an equal volume of water, adjusted to pH 8-9 with ammonia, can be extracted with low esters and alkanecarboxylic acids. acetic acid and the alcohol component of which is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably ethyl acetate, but in the dilution variant also chlorinated hydrocarbons, preferably methylene chloride, practically completely and without disturbing emulsion formation. In this case, in the case of the dilution variant, in addition to the desired reduction of the ballast content; these substances to a surprisingly significant increase in the amount of ergotoxin contained in the culture filtrate.
Biomasa odpadající po filtraci se může v závislosti na obsahu zbytků alkaloidů extrahovat acetoi nem, bezbarvý extrakt, získaný filtrací, se po nastavení vodnými kyselinami, s výhodou kyselinou fosforečnou, na pH 2 až 3 čistí směsí uhlovodíků, jako petroletherem nebo směsí petroletheru a xylenu, vyloučená vodná fáze se po nastavení vodným roztokem amoniaku na pH 8 až 9 extrahuje nízkými estery alkankarboxylových kyselin, s výhodou ethylacetátem, a získaný extrakt se promývá vodou.Biomass resulting from filtration can be extracted with acetone depending on the alkaloid residue content, the colorless extract obtained by filtration, after adjustment with aqueous acids, preferably phosphoric acid, to a pH of 2 to 3 with a hydrocarbon mixture such as petroleum ether or petroleum ether / xylene mixture, the aqueous phase which has been separated out is adjusted with an aqueous ammonia solution to a pH of 8-9 with low alkanecarboxylic acid esters, preferably ethyl acetate, and the extract obtained is washed with water.
Dále bylo nalezeno, že je kromě toho překvapivě a elegantním způsobem možné extrahovat námelové alkaloidy přímo z kapaliny kultury nového kmene Claviceps purpurea, zalkalizované amoniakem, bez předchozího oddělení biomasy, za přídavku síranu amonného nízkými estery alkankarboxylových kyselin, s výhodou ethylacetátem, a extrakcí kapalina-kapalina zředěnými vodnými kyselinami, β výhodou kyselinou fosforečnou, jakož i následující extrakcí kapalina-kapalina získaného vodnéhp extraktu při pH 8 až 9 nízkými estery alkankarboxylových kyselin, s výhodou ethylacetátem, je zbavit rušivých průvodních látek.Furthermore, it has been found that, in a surprisingly and elegant manner, it is possible to extract ergot alkaloids directly from the culture liquid of a new Claviceps purpurea strain, basified with ammonia without prior biomass separation, adding ammonium sulfate with low alkanecarboxylic acid esters, preferably ethyl acetate, and the liquid with dilute aqueous acids, preferably phosphoric acid, as well as the subsequent liquid-liquid extraction of the obtained aqueous extract at pH 8-9 with low alkanecarboxylic acid esters, preferably ethyl acetate, is free of interfering accompanying substances.
Extrakty alkaloidů čištěné vpředu uvedeným způsobem se mohou odpařit při teplotě 25 až 30 °C a získané koncentráty se mohou podrobit diferencovanému konečnému dočištění alkaloidů.The alkaloid extracts purified in the above manner can be evaporated at a temperature of 25-30 ° C and the concentrates obtained can be subjected to differentiated final purification of the alkaloids.
Dále bylo nalezeno, že ve srovnání s DD patentovým spisem č. 41 967 je pro získání čistých alkaloidů výhodné, když se surové koncentráty alkaloidů získané shora uvedeným způsobem rozpustí v 1 až 3 objemových dílech chloroformu, roztoky se uchovávají při teplotě 4 až 10 °C, s překvapením prakticky kvantitativně vykrystalovavší chloroformový adukt ergometrinu, obsahující jen malé množství pigmentu, se oddělí a převede v adiční soli s kyselinou, vysokého stupně čistoty, s výhodou v hydrogenmaleinan. Filtrát získaný po· Oddělení ergometrinu se může nyní nerušeně zkoncentrovat při teplotě 25 až 30 °C, výhodně adsorpcí a následující desorpcí přetržitým způsobem nebo sloupcovou chromatografií za použití kysličníku hlinitého ve výhodném poměru 1 : 20 nebo v poměru 1:5, počítáno na celkové množství alkaloidů v koncentrátu alkaloidů, za přídavku aktivního uhlí (poměr adsorpčního činidla kysličníku hlinitého : aktivnímu uhlí 5 : 1) a nízkých esterů alkankarboxylových kyselin, s výhodou ethylacetátu nebo chlorovaných uhlovodíků, s výhodou chloroformu, nebo dvousložkových směsí vpředu uvedených rozpouštědel, smíšených navzájem nebo s aromatickými uhlovodíky, s výhodou benzenem, načež se tyto po odpaření extraktů nebo eluátů při teplotě 25 až 30 °C ve směsi ergotoxinergotoxininu převedou krystalizací z aromatických uhlovodíků, jako benzenu, toluenu nebo xylenu, na vysoce čisté, krystalické adukty ergotoxinu a aromátů, prosté epimerů, a tyto adukty se popřípadě převedou v adiční soli ergotoxinu s kyselinami, s výhodou v ethansulfonát.It has further been found that, in comparison with DD-A-41 967, it is advantageous for the crude alkaloid concentrates obtained above to be dissolved in 1 to 3 parts by volume of chloroform, the solutions being stored at 4 to 10 ° C. Surprisingly, the practically quantitatively crystalline chloroform adduct of ergometrine, containing only a small amount of pigment, is separated and converted into an acid addition salt of high purity, preferably hydrogen maleate. The filtrate obtained after the separation of ergometrine can now be undisturbed at 25-30 ° C, preferably by adsorption followed by desorption in a continuous manner or by column chromatography using aluminum oxide in a preferred ratio of 1:20 or 1: 5, calculated on the total amount alkaloids in an alkaloid concentrate, with the addition of activated carbon (ratio of 5: 1 alumina: activated carbon adsorption) and low alkanecarboxylic acid esters, preferably ethyl acetate or chlorinated hydrocarbons, preferably chloroform, or two-component mixtures of the above solvents mixed with each other or with aromatic hydrocarbons, preferably benzene, after which they are converted by crystallization from aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene or xylene to highly pure, crystalline compounds after evaporation of the extracts or eluates at 25-30 ° C in the ergotoxinergotoxinin mixture. epimer-free ergotoxin and aromatic adducts, and these adducts are optionally converted into ergotoxin acid addition salts, preferably ethanesulfonate.
Dále bylo nalezeno, že se ergotoxin získaný shora uvedeným způsobem může hydrogenovat bud v přítomnosti méně aktivního Raney-ova niklu při 50 až 70 °C, s výhodou 60 °C, a při tlaku vodíku až 7 MPa, s výhodou při 5 MPa, v dioxanu, nebo i při normálním tlaku a 20 až 30 °C, s výhodou 25 °C, v přítomnosti 5 až 10% paládiového katalyzátoru ve vodném dioxanu cirkulačním způsobem na 9,10-dihydroergotoxin, prostý pigmentu. Hydrogenované báze se převedou o sobě známým způsobem v galenicky využitelné adiční soli kyselin, s výhodou hydrogenmaleinan a ethansulfonát.It has further been found that the ergotoxin obtained by the above process can be hydrogenated either in the presence of less active Raney nickel at 50 to 70 ° C, preferably 60 ° C, and at a hydrogen pressure of up to 7 MPa, preferably at 5 MPa, in dioxane, or even at normal pressure and 20 to 30 ° C, preferably 25 ° C, in the presence of 5 to 10% palladium catalyst in aqueous dioxane by circulating to a pigment-free 9,10-dihydroergotoxin. The hydrogenated bases are converted into acid addition salts, preferably hydrogen maleate and ethanesulfonate, in a manner known per se.
Nový kmen, získaný kultivací, s až dosud neznámými znaky, pro technicky a ekonomicky výhodnou průmyslovou výrobu námelových alkaloidů, zejména alkaloidů skupiny ergotoxinu a ergometrinu, byl uložen v Zentralinstitut fůr Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der Deutschen Akademie der Wissenschaften v Berlíně a nese číslo IMET PA 130.A new strain, obtained by cultivation, with hitherto unknown characteristics, for the technically and economically advantageous industrial production of ergot alkaloids, in particular ergotoxin and ergometrine alkaloids, has been deposited at the Microbiology and Experiment Therapy Centers of the Jena der Deutschen Academy of Wissenschaften in Berlin. PA 130.
1 Kmen byl selektivně oddělen z kultury, která pochází ze sklerocia z pokusné parcely, a byl mutagenně zpracován. Vykazuje v tabulce 1 shrnuté morfologické vlastnosti. 1 strain was selectively separated from a culture that derives from the sclerotia from the experimental plots and was treated with mutagenic. It shows summarized morphological properties in Table 1.
Vynález bude dále blíže vysvětlen na několika příkladech provedení.The invention will be explained in more detail below with reference to several exemplary embodiments.
Příklad 1Example 1
Pro kultivaci konidiospor se vyrobí z konservy kmene, obsahující spory usušené lyofilizací v odstředěném mléce, suspense, která se přenese na 3% agarové prostředí (pH 6,0) s 15 % pivovarské sladiny, 0,5 % kvasničného extraktu, 0,5 % hydrogenfosforečnanu amonného a 0,1 % citranu amonného a inkubuje se 14 dní při 19 °C jako kultura na šikmém agaru. Jako očkovací materiál pro submersní kultury se podle tohoto způsobu získá v 1000 ml jenských širokohrdlých lahvích 1 . 1010 spor/nádobu kultury, jimiž se v případě potřeby může očkovat až 120 1 živného roztoku.For the cultivation of conidiospores, a suspension is prepared from a canned strain containing spores dried by freeze-drying in skim milk, which is transferred to a 3% agar medium (pH 6.0) with 15% brewing wort, 0.5% yeast extract, 0.5% dibasic ammonium phosphate and 0.1% ammonium citrate and incubated for 14 days at 19 ° C as a slant agar culture. According to this method, as inoculum material for submersible cultures is obtained in 1000 ml yen wide-neck bottles 1. 10 10 spores / culture vessels, which can inoculate up to 120 l of nutrient solution if necessary.
Příklad 2Example 2
Výroba inokula se provádí suspendováním spor, kultivovaných podle příkladu 1, které se přenesou v koncentraci 1 . 105 spor/ml do kapalného prostředí, které obsahuje 15 % pivovarské sladiny a 2 % kvasničného extraktu. Kultivace se provádí při 22 °C v 500 ml kulatých baňkách se 120 ml kapalného prostředí na třepačce s kruhovým vibračním pohybem. Kultura obsahuje po 14 dnech 6.109 spor/baňku, které se používají jako očkovací maťeriál pro fermentaci alkaloidů.The production of the inoculum is carried out by suspending the spores cultivated according to Example 1, which are transferred at a concentration of 1. 10 5 spores / ml into a liquid medium containing 15% brewery wort and 2% yeast extract. Cultivation is carried out at 22 ° C in 500 ml round-bottom flasks with 120 ml of liquid medium on a shaker with circular vibration. The culture contains, after 14 days, 6.10 9 spores / flasks, which are used as inoculum material for the fermentation of alkaloids.
Příklad 3Example 3
Výroba inokula pro kultivaci spor se provádí podlé)příkladu 1. Jako živná půda se použije 3% agarové médium (pH 6,8 až 6,9), které obsahuje 3 % sacharózy, 0,3 % dusičnanu sodného, 0,1 % hydrogěnfosforečnanu draselného, 0,05 % síranu hořečnatého MgSO4.7H2O, 0,05 % chloridu draselného, 0,001 síranu železnatého FeSO4.7H2O a 1 % vody z kukuřičných klíčků.The inoculum for spore culture is prepared according to Example 1. A 3% agar medium (pH 6.8 to 6.9) containing 3% sucrose, 0.3% sodium nitrate, 0.1% hydrogen phosphate is used as the culture medium. potassium sulphate, 0,05% magnesium sulphate MgSO 4 .7H 2 O, 0,05% potassium chloride, 0,001 ferrous sulphate FeSO 4 .7H 2 O and 1% water from maize germ.
V 500 ml úzkohrdlých lahvích z průmyslového skla se v kultuře na šikmém agaru získá po 14denní inkubaci při 24 °C 3.109 spor (nádobu), kultury které se mohou používat pro submersní kultury k syntéze alkaloidů.In 500 ml narrow-necked industrial glass bottles, 3.10 9 spores (pots) are obtained in a slant agar culture after 14 days incubation at 24 ° C, which can be used for submersible cultures for alkaloid synthesis.
Příklad 4Example 4
Spory kultury očkovacího materiálu, kultivované podle příkladu 1, se suspendují a část se z nich rozdělí jako inokulum ve stejných množstvích na kulaté baňky s plochým dnem (kapacita 500 ml) s prostředím předkultury po 120 ml 10 % sacharózy, 1,5 % citranu amonného, 0,1 % dusičnanu vápenatého, 0,025 % dihydrogenfosforeěnanu draselného, 0,01 % chloridu draselného, 0,03 % síranu hořečnatého, 0,0001 % síranu železnatého, 0,0004 % síranu zinečnatého; destilovaná voda; pH 5,5; sterilizace 30 minut při 0,05 MPa. Baňky se třepají při 24 °C na třepačce s kruhovým kmitavým pohybem (175 ot/min). Po sedmi dnech se obsah baněk přeočkuje vždy po 150 mlpřestředí hlavní kultury (20 % sacharózy, 1 % citranu amonného, 0,1 % dusičnanu vápenatého, 0,025 % dihydrogenfosforeěnanu draselného, 0,01 % síranu železnatého, 0,0004 % síranu zinečnatého; destilovaná voda; pH 5,5; sterilizace 30 minut při 0,05 MPa) v poměru 1 : 10 na Erlenmayerovy baňky. Tyto baňky se třepají za stejných podmínek jako předtím.The culture spores of the seed material cultured according to Example 1 are suspended and a portion of them is distributed as inoculum in equal amounts into flat-bottomed round flasks (500 ml capacity) with a pre-culture medium of 120 ml of 10% sucrose, 1.5% ammonium citrate. 0.1% calcium nitrate, 0.025% potassium dihydrogen phosphate, 0.01% potassium chloride, 0.03% magnesium sulfate, 0.0001% ferrous sulfate, 0.0004% zinc sulfate; Distilled water; pH 5.5; sterilization for 30 minutes at 0.05 MPa. Shake the flasks at 24 ° C on a rotary shaker (175 rpm). After seven days, the flask contents were inoculated with 150 ml of the main culture medium (20% sucrose, 1% ammonium citrate, 0.1% calcium nitrate, 0.025% potassium dihydrogen phosphate, 0.01% ferrous sulfate, 0.0004% zinc sulfate; distilled water; pH 5.5; sterilization for 30 minutes at 0.05 MPa) in a ratio of 1:10 to Erlenmeyer flasks. These flasks were shaken under the same conditions as before.
Po 14 dnech se pomocí van Urkovy reakce prokáže 2470 mg alkaloidů (litr kapaliny kultury, počítáno jako ergotoxinmaleinan. Alkaloidy se extrahují metylenchloridem, analogicky jako při metodě HOHMANN a ROCHELMAYER) Arch. Pharmazie 297 (1964) s. 186/187 se dělí chromatografií na tenké vrstvě na křemelině, impregnované formamidinem, a určují UV spektrální fotometrií. Nalezne se 1280 mg ergotoxinu a 340 mg ergometrinu/litr, zbytek připadá na dva až dosud neznámé nativní peptidy alkaloidů a na jednoduché deriváty ergolinu, jako agroklavin, chanoklavin aj.After 14 days the van Urk reaction showed 2470 mg of alkaloids (liter of culture liquid, calculated as ergotoxin maleate. Alkaloids were extracted with methylene chloride, analogously to HOHMANN and ROCHELMAYER) Arch. Pharmazie 297 (1964) p. 186/187 are separated by formamidine-impregnated thin layer chromatography on diatomaceous earth and determined by UV spectral photometry. 1280 mg of ergotoxin and 340 mg of ergometrine / liter are found, the remainder being two unknown hitherto native alkaloid peptides and simple ergoline derivatives such as agroclavin, chanoclavin and the like.
K tomu souběžně provedené stanovení mycelia a filtrátu oddělených filtrací s odsáváním dokazuje, že ergometrin je obsažen ve filtrátu úplně a kromě toho je ve filtrátu obsaženo 90 % veškerého vzniklého ergotoxinu.For this purpose, a concomitant determination of the mycelium and the filtrate separated by suction filtration proves that ergometrine is completely contained in the filtrate and, in addition, 90% of the total ergotoxin produced is contained in the filtrate.
Příklad 5 skleněných fermentorů (s kapacitou 2 litry) se očkuje submersní kulturou spor, vyrobených podle příkladu 2. Fermentory obsahují po 1,3 litru živného roztoku A s 10 % sacharózy, 1,5 % citrátu amonného, 0,05 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,03 % síranu hořečnatého, 0,01 % síranu železnatého a 0,0004 % síranu zinečnatého ve vodovodní vodě (pH 5,5; sterilizace 30 minut při 0,05 MPa). Fermentace se provádí při 24 °C a míchání při 400 ot/min, popřípadě za provzdušňování 0,3 litru vzduchu/min. Po sedmi dnech se obsah fermentorů převede do 181itrového fermentoru z ušlechtilé oceli s 10 litry živného roztoku B. Živný roztok B obsahuje 10 % sacharózy, 1,4 % kyseliny citrónové, 1,0 % hydroxidu amonného (25%), 0,05 % dusičnanu vápenatého, 0,025 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,01 % chloridu draselného, 0,03 % síranu hořečnatého, 0,001 % síranu železnatého a 0,0004 % síranu zinečnatého ve vodovodní vodě; pH 5,5. Po kultivaci při 24 °C, míchání při 360 ot/min a provzdušňování 2,5 1 vzduchu/min se pátý den použije polovina obsahu fermentorů jako inokulum pro 631itrový fermentor z ušlechtilé oceli se 401 živného roztoku C. Živný roztok C obsahuje 20 % sacharózy, 1,75 % kyseliny citrónové, 0,075 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,02 % chloridu draselného, 0,03 % síranu hořečnatého, 0,003 síranu železnatého, 0,0012 % síranu zinečnatého ve vodovodní vodě; přípravek hydroxidu amonného až do pH 5,3; sterilizace 60 minut při 110 °C. Kultura se míchá 7 dní při 24 °C 300 ot/min a provzdušňuje 271 vzduchu/min, podle potřeby se přidává prostředek proti pěnění. Na konci kultivace obsahuje kapalina kultury 2640 mg veškerých alkaloidů/1. V souladu s příkladem 4 provedená analýza ukazuje, že z toho připadá 1300 mg na ergotoxin a 550 mg na ergometrin;Example 5 Glass fermenters (capacity 2 liters) are inoculated with a spore submersible culture produced according to Example 2. The fermenters contain 1.3 liters of nutrient solution A with 10% sucrose, 1.5% ammonium citrate, 0.05% potassium dihydrogen phosphate, 0.03% magnesium sulfate, 0.01% ferrous sulfate and 0.0004% zinc sulfate in tap water (pH 5.5; sterilized for 30 minutes at 0.05 MPa). The fermentation is carried out at 24 ° C and stirring at 400 rpm, optionally with aeration of 0.3 liter air / min. After seven days, the fermenters were transferred to a 181 liter stainless steel fermenter with 10 liters of nutrient solution B. Nutrient solution B contained 10% sucrose, 1.4% citric acid, 1.0% ammonium hydroxide (25%), 0.05% calcium nitrate, 0.025% potassium dihydrogen phosphate, 0.01% potassium chloride, 0.03% magnesium sulfate, 0.001% ferrous sulfate, and 0.0004% zinc sulfate in tap water; pH 5.5. After cultivation at 24 ° C, stirring at 360 rpm and aeration of 2.5 L air / min, on the fifth day half of the fermenters content is used as an inoculum for a 631 liter stainless steel fermenter with 401 nutrient solution C. Nutrient solution C contains 20% sucrose 1.75% citric acid, 0.075% potassium dihydrogen phosphate, 0.02% potassium chloride, 0.03% magnesium sulfate, 0.003 ferrous sulfate, 0.0012% zinc sulfate in tap water; ammonium hydroxide preparation up to pH 5.3; sterilization at 110 ° C for 60 minutes. The culture is stirred for 7 days at 24 ° C at 300 rpm and aerated with 271 air / min, anti-foaming agent added as necessary. At the end of the culture, the culture liquid contains 2640 mg of total alkaloids / L. In accordance with Example 4, the analysis carried out shows that of this there are 1300 mg for ergotoxin and 550 mg for ergometrine;
Příklad 6Example 6
Množství spor kultury očkovacího materiálu, kultivovaných podle příkladu 3, se rozdělí jako inokulum rovnoměrně do dvou fermentorů z ušlechtilé oceli (kapacita 18 litrů) po 101 živného roztoku A v souhlase s příkladem 5. Fermentor se míchá 7 dní při 24 °C a 360 ot/min a provzdušňuje 2,5 1 vzduchu/min. Potom se obsah 2 fermentorů převede do 250 litrového fermentorů z ušlechtilé oceli, který obsahuje 1801 živného roztoku B podle příkladu 5, a při 24 °C, míchání při 160 ot/min a provzdušňování 0,5 1 vzduchu/litr živného roztoku x min se kultivuje. Po 5 dnech se kultura přenese do 2000 litrového fermentorů z ušlechtilé oceli a 1400 1 živného roztoku C podle příkladu 5, avšak živný roztok obsahuje dodatečně 0,0005 % síranu nikelnatého. Kultivace se provádí při 24 °C, míchání při 160 ot/min a provzdušňování 0,6 1 vzduchu/ litr živného roztoku x min. V případě potřeby se do všech fermentorů přidává prostředek proti pěnění. Sedmý den se získá kultura 2430 mg veškerých alkaloidů/1 kapaliny kultury. Při analytickém stanovení podle příkladu 4 se nalezne 1150 mg ergotoxinu a 490 mg ergometrinu/1 kapaliny kultury.The amount of culture spores of the seed material cultured according to Example 3 is distributed as an inoculum evenly into two stainless steel fermenters (capacity 18 liters) of 101 nutrient solution A in accordance with Example 5. The fermenter is stirred for 7 days at 24 ° C and 360 rpm. / min and aerates 2.5 liters of air / min. Then the contents of 2 fermenters are transferred to 250 liter stainless steel fermenters containing 1801 nutrient solution B according to example 5, and at 24 ° C, stirring at 160 rpm and aeration of 0.5 l air / liter nutrient solution x min. cultivates. After 5 days, the culture was transferred to 2000 liter stainless steel fermenters and 1400 L of nutrient solution C according to Example 5, but the nutrient solution additionally contained 0.0005% nickel sulfate. Cultivation is performed at 24 ° C, stirring at 160 rpm and aeration of 0.6 L air / liter nutrient solution x min. If desired, an anti-foaming agent is added to all fermenters. On day 7, a culture of 2430 mg of total alkaloids / L culture liquid was obtained. In the analytical assay of Example 4, 1150 mg of ergotoxin and 490 mg of ergometrine / L culture fluid were found.
Příklad 7Example 7
200 1 filtrátu kultury, získaných z odpovídajícího množství kapaliny kultury vyrobené podle příkladu 6, která byla před oddělením mycelia zředěna za míchání přídavkem vody v objemovém poměru 1:1, zalkalizuje se 25% amoniakální vodou na hodnotu pH 8,5 a extrahují se alkaloidy ergotoxinu a ergometrin 50 litry ethylacetátu za použití dvoustupňového protiproudného extrakčního zařízení. Ethylacetátový extrakt se koncentruje ve vakuu při teplotě 25 až 30 °C na 1/20 výchozího objemu, odparek se doplní 2 objemovými díly chloroformu, nechá se pro vykrystalování chloro5 formového aduktu ergometrinu stát 15 hodin při +4 °C, odsaje se a získá se 35,4 g nažloutlého chloroformového aduktu ergometrinu v 75% výtěžku. „200 L of culture filtrate obtained from an appropriate amount of the culture liquid prepared according to Example 6, which was diluted with stirring by adding 1: 1 by volume of water prior to mycelium separation, basified with 25% ammonia water to pH 8.5 and extracted with ergotoxin alkaloids and ergometrine 50 liters of ethyl acetate using a two-stage countercurrent extraction device. The ethyl acetate extract is concentrated under vacuum at 25-30 ° C to 1/20 of the initial volume, the residue is filled with 2 volumes of chloroform, allowed to stand for 15 hours at +4 ° C to crystallize the chloromethyl adduct of ergometrine, aspirated and recovered 35.4 g of yellowish chloroform adduct of ergometrine in 75% yield. "
35,4 g chloroformového aduktu ergometrinu se rozpustí za přítomnosti aktivního uhlí při zahřívání v 3,1 litru acetonu, k filtrátu se přidá vypočítané množství roztoku kyseliny maleinové v acetonu, získaný krystalický biomaleinát ergometrinu se odsaje a látka se usuší při +70 °C. Získá se sůl alkaloidu ve formě podle chromatografie na tenké vrstvě čistého, bílého až nažloutlého krystalického přášku v 90% výtěžku se stupněm čistoty 98 až 100 %. Specifická otáčivost (o.)d° = +50° (c = 1 ve vodě).35.4 g of the chloroform ergometrine adduct are dissolved in the presence of activated carbon with heating in 3.1 liters of acetone, a calculated amount of a solution of maleic acid in acetone is added to the filtrate, the obtained crystalline ergometrine biomaleinate is filtered off with suction and dried at +70 ° C. The alkaloid salt is obtained in the form according to thin layer chromatography of pure, white to yellowish crystalline powder in 90% yield with a degree of purity of 98 to 100%. Specific rotation (°) d ° = + 50 ° (c = 1 in water).
Po dalším zkoncentrování získaného filtrátu, obsahujícího ergotoxin, na 0,297 1 se buď:After further concentrating the obtained ergotoxin-containing filtrate to 0.297 L, either:
^a) chromatografuje za použití 20násobného množství, počítáno na celkové množství alkaloidu v koncentrátu alkaloidu, kysličníku hlinitého akt. I. stupně, neutrál., přes sloupec s ethylacetátem a eluuje se 3,8 litry stejného rozpouštědla. Po odpaření eluátu ve vakuu při teplotě 30 °C do sucha se získaný odparek (74,2 g) převede vyjmutím do 0,212 litru benzenu a ponecháním roztoku stát po dobu 15 hodin při 4 °C na benzenový adukt ergotoxinu, vykrystalovavší produkt se odsaje, promyje benzenem a usuší ve vakuovém exikátoru. Získá se 55,2 g podle chromatografie na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického benzenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 95 %. Specifická otáčivost (α)ο° = -183° (c = 1,8 ve chloroformu), nebo se(a) chromatographs using a 20-fold amount, calculated on the total amount of alkaloid in the alkaloid concentrate, alumina act. Step I, neutral, through an ethyl acetate column, eluting with 3.8 L of the same solvent. After evaporating the eluate to 30 ° C under vacuum at 30 ° C, the residue (74.2 g) is taken up in 0.212 liter of benzene and left to stand for 15 hours at 4 ° C to form an ergotoxin benzene adduct, the crystalline product is filtered off with suction, washed benzene and dried in a vacuum desiccator. 55.2 g of pure, white, crystalline benzene adduct of ergotoxin with a degree of purity of 95% is obtained by thin layer chromatography. Specific rotation (α) ο ° = -183 ° (c = 1,8 in chloroform) or se
b) smíchá s 20násobným množstvím kysličníku hlinitého akt. stupně I, neutrálního, přepočteno na množství celkových alkaloidů, až je směs barevně homogenní. Po 15 minutách stání se extrahuje 3krát po 3,82 litru ethylacetátu, spojený extrakt se odpaří při 30 °C do sucha, v dalším zpracování se pokračuje analogickým způsobem jako sub a) a získá se 52,5 g chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického benzenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 95 %. Specifická otáčivost (α)ο’ = -183° (c = 1,8 v chloroformu); nebo seb) mix with 20 times the amount of alumina nude. degree I, neutral, calculated on the amount of total alkaloids until the mixture is homogeneous in color. After standing for 15 minutes, it is extracted 3 times with 3.82 liters of ethyl acetate, the combined extract is evaporated to dryness at 30 DEG C., further work-up is carried out in a manner analogous to sub a), yielding 52.5 g by thin layer chromatography. , a crystalline benzene adduct of ergotoxin with a degree of purity of 95%. Specific rotation (α) ο = -183 ° (c = 1.8 in chloroform); or be
c) chromatografuje za použití pětinásobného množství, přepočteno na množství celkového alkaloidu v koncentrátu alkaloidu, kysličníku hlinitého akt. stupně I neutrálního za přídavku aktivního uhlí (poměr adsorpčních prostředků kysličníku hlinitého : aktivnímu uhlí 5:1) přes sloupec s ethylacetátem a eluuje se 4 litry stejného rozpouštědla, v dalším zpracování se pokračuje analogicky jako sub a) a získá se 55 g chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického benzenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 96 %; specifická otáčivost («)d' = —183° (c = 1,8 ve chloroformu); nebo se(c) chromatographs using a fivefold amount, calculated on the basis of the total alkaloid in the alkaloid concentrate, alumina act. Step I neutral with the addition of activated carbon (ratio of adsorption agents of alumina: activated carbon 5: 1) through a column of ethyl acetate and eluting with 4 liters of the same solvent, further processing is continued analogously to sub a) and 55 g is obtained. a layer of pure, white, crystalline ergotoxin benzene adduct with a degree of purity of 96%; specific rotation (?) d '= -183 ° (c = 1.8 in chloroform); or be
d) míchá za použití pětinásobného množství, přepočteno na množství veškerého alkaloidu v koncentrátu alkaloidu, kysličníku hlinitého akt. stupně I neutrálního za přídavku aktivního uhlíd) stir using a five-fold amount, calculated on the amount of all alkaloid in the alkaloid concentrate, alumina act. degree I neutral with the addition of activated carbon
2O'»196 (poměr adsorpčních prostředků kysličníku hlinitého : aktivnímu uhlí 5 : 1) v míchacím filtračním zařízením se 3 litry ethylacetátu, extrahuje se ještě dvakrát po 2,5 litru ethylacetátu, spojené extrakty se odpaří při +30 °C do sucha, v dalším zpracování se postupuje analogicky jako sub a) a získá se 55 g chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického benzenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 96 %. Specifická otáčivost (a)f,° = —183° (c = 1,8 v CHC13).2 O ' 196 (5: 1 ratio of alumina: activated carbon adsorption agents) in a 3 liter ethyl acetate mixer, extracted twice more with 2.5 liter ethyl acetate, the combined extracts are evaporated to dryness at +30 DEG C., further work-up was carried out analogously to sub a), and 55 g was obtained by thin-layer chromatography on pure, white, crystalline benzene adduct of ergotoxin with a degree of purity of 96%. Specific rotation (α) λ = -183 ° (c = 1.8 in CHCl 3 ).
55,2 g benzenového aduktu ergotoxinu se rozpustí za mírného zahřívání v 830 ml absolutního ethanolu, přidá se vypočítané množství 0,5 molární ethanolické (abs.) ethansulfonové kyseliny a poté 4,21 bezvodého etheru, získaný krystalizát se odsaje, látka se usuší při +70 °C a v 95 % výtěžku se získá chromatograficky na čisté vrstvě čistý, bílý, krystalický ethansulfonan ergotoxinu se stupněm čistoty 98 až 100 %,55.2 g of the benzene adduct of ergotoxin are dissolved under gentle heating in 830 ml of absolute ethanol, a calculated amount of 0.5 molar ethanolic (abs.) Ethanesulfonic acid is added, followed by 4.21 of anhydrous ether, the obtained crystallizate is filtered off with suction. +70 ° C and in 95% yield pure, white, crystalline ergotoxin ethanesulfonate having a purity of 98 to 100% is obtained by chromatography on a pure layer,
Příklad 8Example 8
Extrahuje se 12,0 kg mycelia, získaného filtrací odpovídajícího množství kapaliny kultury, po dobu hodin při 20 °C 18 1 acetonu, filtrací oddělený vodně acetonický extrakt se nastaví pomocí kyseliny fosforečné na pH 2 až 3 a odmastí, čistí se dvojnásobnou extrakcí 17 litry petroletheru a 11 litry petroletheru ve směsi s xylenem (obj. pom. 1 : 1). Získaná těžká fáze, obsahující alkaloidy, se extrahuje při pH 8 až 9 (amoniaková voda) dokonale celkem 7 litry ethylacetátu, horní fáze, promytá vodou v objemovém poměru 1 : 1, se při 30 °C zahustí na 0,701, doplní se 1,40 litru chloroformu a po stání přes noc při +4 °C se oddělí vyloučená kašovitá sraženina.Extract 12.0 kg of mycelium obtained by filtering the appropriate amount of culture liquid for 18 hours at 20 ° C with 18 L of acetone, adjust the pH-adjusted aqueous acetonic extract to pH 2-3 with a phosphoric acid solution and degrease, purifying by extraction twice with 17 liters. petroleum ether and 11 liters of petroleum ether mixed with xylene (1: 1 v / v). The obtained heavy alkaloid-containing phase is extracted at pH 8-9 (ammonia water) with a total of 7 liters of ethyl acetate, the upper phase, washed with water in a 1: 1 by volume ratio, is concentrated to 0.701 at 30 [deg.] C. of chloroform and standing overnight at +4 ° C, the precipitated slurry separated.
Filtrát se koncentruje za shora uvedených podmínek na 0,180 litru, chromatografuje se na 1,100 kg kysličníku hlinitého (akt. stupeň I) pomocí 2 litrů ethylacetátu, získaný eluát se odpaří ve vakuu do sucha, odparek se rozpustí ve 100 ml toluenu (benzenu nebo xylenu). Po stání přes noc při +4 °C se oddělí vyloučená látka, usuší ve vakuovém exikátoru a získá se 14,0 bílého, krystalického toluenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 98 až 100 %.The filtrate is concentrated under the above conditions to 0.180 liters, chromatographed on 1.100 kg of alumina (active grade I) with 2 liters of ethyl acetate, the eluate obtained is evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 100 ml of toluene (benzene or xylene). . After standing overnight at +4 ° C, the precipitate was collected, dried in a vacuum desiccator to give 14.0 white crystalline toluene adduct of ergotoxin with a degree of purity of 98-100%.
Příklad 9Example 9
Za míchání a přídavku L0 % hmotnostních síranu amonného při pH 8 až 9 a 20 °C se extrahuje 10,0 litrů suspense kultury, vyrobené podle příkladu <5, 25,0 litry ethylacetátu, těžká biofáze se zahodí, organická fáze se extrahuje dvakrát po 5,0 litrech 2% kyseliny fosforečné, shromážděné vodné fáze, nastavené ammoniakovou vodou na pH 8 až 9, se extrahují dvakrát po 5,0 litrech ethylacetátu, nashromážděné organické fáze se odpaří při teplotě 25 až 30 °C na 200 ml, odparek se doplní 400 ml chloroformu, po stání přes noc za chladu při °C vykrystalovavší látka se odsaje a usuší ve vakuovém exikátoru a získá se 4,20 g (71,2% teor.) chloroformového aduktu ergometrinu se stupněm čistoty 90,7 %. Filtrát, obsahující ergoto6 xin, zkoncentrovaný za shora uvedených podmínek na 120 ml, se chromatografuje na 300 g kysličníku hlinitého (akt. stupeň I) ethylacetátem, eluát se odpaří ve vakuu do sucha, odparek se rozpustí ve 30 ml benzenu, nechá se stát přes noc za chladu při teplotě 4 až 10 °C, vyloučená látka se odsaje, usuší ve vakuovém exikátoru a získá se 7,95 g (= 73,6 % teor.) bílého, krystalického benzenového aduktu ergotoxinu se stupněm čistoty 91,6 %.With stirring and addition of 10% by weight ammonium sulfate at pH 8-9 and 20 ° C, 10.0 liters of culture suspension prepared according to Example <5, 25.0 liters of ethyl acetate are extracted, the heavy biophase is discarded, the organic phase is extracted twice after 5.0 liters of 2% phosphoric acid, collected aqueous phase, adjusted to pH 8-9 with ammonia water, are extracted twice with 5.0 liters of ethyl acetate each, the collected organic phases are evaporated at 25-30 ° C to 200 ml, 100 ml of chloroform are added, after standing overnight at 0 DEG C., the crystalline substance is suctioned off and dried in a vacuum desiccator to give 4.20 g (71.2% of theoretical) of the chloroform adduct of ergometrine with a degree of purity of 90.7%. The filtrate containing ergotoxin, concentrated to 120 ml under the above conditions, is chromatographed on 300 g of alumina (active grade I) with ethyl acetate, the eluate is evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 30 ml of benzene, allowed to stand over The mixture is filtered and dried in a vacuum desiccator to obtain 7.95 g (= 73.6% of theory) of a white, crystalline benzene adduct of ergotoxin with a degree of purity of 91.6%.
Příklad 10Example 10
50,0 g benzenového aduktu ergotoxinu, vyrobeného podle příkladu 7, se hydrogenuje v 0,7 litru dioxanu při 60 °C při tlaku vodíku 5 MPa ve vytápěném třepacím nebo mísícím autoklávu v přítomnosti Raneyova niklu po dobu 2 hodin na 9,10-dihydroergotoxin, katalyzátor se odfiltruje a čirý filtrát se odpaří ve vakuu do sucha, hydrogenovaná báze se nechá vykrystalovat při 4°C v ethylacetátu, krystalizát se odsaje a usuší při 60 °C. Získá se 47,5 g (= 90 % teor.) chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického produktu báze dihydroergotoxinu se stupněm čistoty 90 %. Specifická otáčivost (α)θ° = 45,6° (c = 2 v pyridinu).50.0 g of the benzene adduct of ergotoxin, prepared according to Example 7, is hydrogenated in 0.7 liter of dioxane at 60 ° C under a hydrogen pressure of 5 MPa in a heated shaking or mixing autoclave in the presence of Raney nickel for 2 hours to 9,10-dihydroergotoxin The catalyst was filtered off and the clear filtrate was evaporated to dryness in vacuo, the hydrogenated base was crystallized at 4 ° C in ethyl acetate, the crystallizate was filtered off with suction and dried at 60 ° C. 47.5 g (= 90% of theory) are obtained by thin layer chromatography of pure, white, crystalline dihydroergotoxin base with a degree of purity of 90%. Specific rotation (α) θ ° = 45.6 ° (c = 2 in pyridine).
Získaná krystalická báze dihydroergotoxinu se vnese za míchání do 200 ml methanolu a vypočítaného množství 1 molárního methanolického roztoku kyseliny ethansulfonové, přičemž se po krátké době vyloučí sůl alkaloidu ve formě krystalů.The obtained dihydroergotoxin crystalline base is added with stirring to 200 ml of methanol and a calculated amount of 1 molar methanolic ethanesulfonic acid solution, after which the alkaloid salt precipitates in the form of crystals after a short time.
Po odsátí a usušení produktu se získá 48,5 g (95 % teor.) chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického dihydroergotoxinethansulfonanu se stupněm čistoty 98 až 100 %.After aspiration and drying of the product, 48.5 g (95% of theory) are obtained by thin-layer chromatography on pure, white, crystalline dihydroergotoxin ethanesulfonate having a purity degree of 98-100%.
Příklad 11Example 11
7,20 g benzenového aduktu ergotoxinu, získaného podle příkladu 9, se hydrogenuje ve 200 ml 90% vodného dioxanu při 20 až 25 °Cza vyloučení světla na 2,9 g 5% paládia na uhlí, ve speciální cirkulační aparatuře, skládající se z hydrogenační nádoby s napájecím vedením a cirkulačním vedením, teploměru, ejektoru, zásobní nádrže plynu a laboratorního hadicového čerpadla, při počtu otáček 138,5 h_I, podtlaku ejektoru 120 mm sloupce kyseliny sírové a průměru trysek ejektoru 2 mm po dobu 4 hodin na 9,10-dihydroergotoxin, katalyzátor se odfiltruje, čirý filtrát se odpaří ve vakuovém rotačním odpařováku při teplotě 25 až 30 °C do sucha, odparek se rozpustí ve 35 ml chloroformu, doplní se 35 ml diethyletheru a za intenzivního míchání se dokonale vysráži 70 ml nasyceného etherického roztoku kyseliny maleinové dihydroergotoxinmaleinát. Odsaje se, promyje 30 ml diethyleteru a ihned se usuší nad kysličníkem fosforečným ve vakuovém exikátoru. Získá se 6,55 g (93,5 % teor.) chromatograficky na tenké vrstvě čistého, bílého, krystalického dihydroergotoxinmaleinátu se stupněm čistoty 97,9 %.7.20 g of the benzene adduct of ergotoxin, obtained according to Example 9, is hydrogenated in 200 ml of 90% aqueous dioxane at 20-25 ° C and the light excluded to 2.9 g of 5% palladium on carbon, in a special circulation apparatus consisting of a hydrogenation vessels with supply line and circulation line, thermometer, ejector, gas storage tank and laboratory hose pump, at 138.5 h _I , ejector vacuum of 120 mm sulfuric acid column and 2 mm ejector nozzle diameter at 9.10 -dihydroergotoxin, the catalyst is filtered off, the clear filtrate is evaporated to dryness in a vacuum rotary evaporator at 25-30 ° C, the residue is dissolved in 35 ml of chloroform, made up to 35 ml of diethyl ether and 70 ml of saturated ether solution is precipitated with vigorous stirring. maleic acid dihydroergotoxin maleate. It is filtered off with suction, washed with 30 ml of diethyl ether and immediately dried over phosphorus pentoxide in a vacuum desiccator. 6.55 g (93.5% of theory) were obtained by thin layer chromatography of pure, white, crystalline dihydroergotoxin maleate having a degree of purity of 97.9%.
Tabulka 1: Morfologické vlastnosti Claviceps purpurea, kmen IMET PA 130, na různých agarových prostředích po 14denní inkubaci na Petriho miskách při 24 °C.Table 1: Morphological properties of Claviceps purpurea, strain IMET PA 130, on various agar media after 14 days incubation in Petri dishes at 24 ° C.
Médium 1 (3 % sacharózy, , 0,001 % FeSO4 · 7H2O, 0,3 % NaNO3, 1 % kukuřičné vodyMedium 1 (3% sucrose, 0.001% FeSO 4 · 7H 2 O, 0.3% NaNO 3 , 1% corn water
0,1 % K2HPO4, 3 % agaru;0.1% K 2 HPO 4 , 3% agar;
0,05 % MgSO4 · 7H2O pH 6,8 - 6,9)0.05% MgSO 4 · 7H 2 O pH 6.8 - 6.9)
Tvar kolonií: Vypouklé, kompaktní, nepravidelné a silně svraštělé kolonie; spodní strana hladká, neoddělující se ode dna desky.Colony shape: Convex, compact, irregular and strongly puckered colonies; underside smooth, not separating from the bottom plate.
Průměr kolonií: 1,0—1,5 cm,Colony diameter: 1.0 - 1.5 cm,
Barva kolonií: Vrchní strana světlehnědá až fialová, bílý okraj; spodní strana hnědá, okraj světle hnědý.Color of colonies: Upper side light brown to violet, white border; underside brown, rim light brown.
Průměrná tvorba spor: 46,3 x 106 konidií/kolonií.Average spore formation: 46.3 x 10 6 conidia / colonies.
Médium 2 (15% pivovarské sladiny 0,1% citranu amonného 0,5 % kvasničného 3% agaru;Medium 2 (15% brewery wort 0.1% ammonium citrate 0.5% yeast 3% agar;
extraktu, pH 6,0)extract, pH 6.0)
0,5% (NH4)2HPO4, i0.5% (NH 4 ) 2 HPO 4 , i
Tvar kolonií: Střed vypouklý, s vyhloubeninou ve tvaru kráteru; okraj radiálně zvlněn: agar prorostlý, kolonie oddělující se ode dna desky.Colony shape: Center convex, with crater-shaped recess; edge radially undulating: agar streaky, colony separating from the bottom of the plate.
Průměr kolonií: 2—3 cm.Colony diameter: 2-3 cm.
Barva kolonií: Vrchní a spodní strana světle šedá.Color of colonies: Top and bottom light gray.
' Průměrná tvorba spor: 34,1 X 106 konidií/kolonií.Average spore formation: 34.1 X 10 6 conidia / colonies.
Médium 3 (2 % glukózy, % vodného extraktu brambor, % agaru;Medium 3 (2% glucose,% potato aqueous extract,% agar;
pH 6,0)pH 6,0)
Tvar kolonií: Střed vypouklý s vyhloubeninou tvaru kráteru; agar prorostlý, kolonie oddělitelné ode dna baňky.Colony shape: Center convex with crater-shaped recess; streaky agar, colonies separable from the bottom of the flask.
Průměr kolonií: 1,5 až 2,0 cm.Colony diameter: 1.5 to 2.0 cm.
Barva kolonií: Vrchní strana šedofialová; spodní strana šedohnědá.Color of colonies: Upper side gray-violet; underside gray-brown.
Průměrná tvorba spor: 3,3 x 106 konidií/koloniíAverage spore formation: 3.3 x 10 6 conidia / colonies
Mikroskopická charakteristika konidií a hyfů:Microscopic characteristics of conidia and hyphae:
Konidie vykazují ve všech případech elipsovitou formu s rozměry 6 až 10 μιη (velká osa) popřípadě až 8 pm (malá osa). Hyfy substrátu jsou dlouhé až 200 pm a mají průměr 8 až 16 pm. Objevují se vzdušné hyfy, jejichž délka činí přes 200 pm průměr pouze 2 až 4 pm.In all cases, conidia have an elliptical form with dimensions of 6 to 10 μιη (large axis) or up to 8 µm (small axis). The substrate hyphae are up to 200 µm long and have a diameter of 8 to 16 µm. There are air hyphae whose length is over 200 pm and the diameter is only 2 to 4 pm.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS571776A CS209196B1 (en) | 1976-09-02 | 1976-09-02 | Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS571776A CS209196B1 (en) | 1976-09-02 | 1976-09-02 | Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS209196B1 true CS209196B1 (en) | 1981-11-30 |
Family
ID=5402566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS571776A CS209196B1 (en) | 1976-09-02 | 1976-09-02 | Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS209196B1 (en) |
-
1976
- 1976-09-02 CS CS571776A patent/CS209196B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4342767A (en) | Hypocholesteremic fermentation products | |
| US4319039A (en) | Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product | |
| US4576961A (en) | Antibiotic heterocyclic oxygen compounds and use | |
| EP0182522B1 (en) | Preparation of clavulanic acid and its salts and esters | |
| JP2002535977A5 (en) | ||
| AU732293B2 (en) | A process for the preparation of cyclic depsipeptide compounds and a novel cyclic depsipeptide | |
| JP2792629B2 (en) | Novel 10-membered lactone and method for producing the same | |
| US7241601B2 (en) | Process for the preparation of Fexofenadine | |
| US20030186394A1 (en) | Process to prepare and isolate geldanamycin | |
| CS209196B1 (en) | Method of fermentative manufacture of ergoline derivatives | |
| US4086141A (en) | Process for the fermentation production of ergoline derivatives | |
| US5254727A (en) | Acyclic tricarboxylic acid compounds | |
| JP2873894B2 (en) | Cyclic depsipeptide and method for producing the same | |
| FI58514B (en) | SAMTIDIG FRAMSTAELLNING AV ERGOKORNIN ERGOKRYPTIN OCH ERGOMETRIN MED HOEGT UTBYTE MED TILLHJAELP AV ETT FERMENTATIVT FOERFARANDE | |
| SU845827A1 (en) | Method of obtaining ergot alkaloids | |
| JP2695225B2 (en) | New substance UCT-1003 | |
| HU176462B (en) | Processnfor producing ergoline derivatives by fermentation | |
| US4207314A (en) | Isofortimicin | |
| JPS6232892A (en) | Microbiological hydroxylation of horse choline and its derivative by neurospora crasa | |
| US3453276A (en) | Triazinoindole compounds | |
| HU204575B (en) | Process for producing 1-methyl-1,4-androstadiene-3,17-dion | |
| EP0330334B1 (en) | A new antimicrobial compound,wf11605,derivatives therof and processes for preparing the same | |
| US4529734A (en) | 2-Formyloxymethyl-clavam | |
| JPH0459316B2 (en) | ||
| IL23600A (en) | 1,6-dimethyl-delta8(9)-ergolene 8-carboxylic acid amides and a process for their production |