CS209162B1

CS209162B1 - Method of removal of iron toxic influence at biological synthesis of penicilline

Info

Publication number: CS209162B1
Application number: CS920679A
Authority: CS
Inventors: Vlasta Matelova; Karel Culik; Michal Bucko; Boris Okanik; Dana Wagnerova; Stanislav Ulbert
Original assignee: Vlasta Matelova; Karel Culik; Michal Bucko; Boris Okanik; Dana Wagnerova; Stanislav Ulbert
Priority date: 1979-12-21
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1981-11-30

Description

Vynález se týká způsobu výroby penicilinu v železné aparatuře, při kterém je odstraněn toxický vliv železa přídavky specifického Titriplexu.The invention relates to a process for the production of penicillin in an iron apparatus, wherein the toxic effect of iron by the addition of a specific Titriplex is eliminated.

Toxicita železa pro enzymy účastnící se vlastní biosyntézy je notoricky známa. Chelatony lze tento vliv teoreticky odstranit, bohužel detoxifikační látky zpravidla inhibují růst, tím se stávají nepoužitelné, nebo jejich účinnost in vivo není dostatečná. Železo inhibuje pouze biosyntézu penicilinu, nikoliv růst. Toto tvrzení lze demonstrovat následujícími výsledky získanými s kmene Penicillium chrysogenum 65/41 (při všech modelových pokusech bylo železo přidáváno ve formě síranu železnatého).*Iron toxicity for enzymes involved in self-biosynthesis is notorious. Chelatones can theoretically eliminate this effect; unfortunately, detoxifying agents usually inhibit growth, making them unusable, or their in vivo efficacy is insufficient. Iron only inhibits penicillin biosynthesis, not growth. This claim can be demonstrated by the following results obtained with Penicillium chrysogenum 65/41 (in all model experiments, iron was added in the form of ferrous sulphate). *

Intenzita inhibice biosyntézy penicilinu závisí na koncentraci železa ve fermentaění půdě. Do koncentrace železa 50 gama/ml fermentaění půdy je vztah mezi koncentrací železa a inhibicí biosyntézy lineární, nad tuto koncentraci je již pokles produkce pomalejší. Koncentrace železa 50 gama/ml je však právě to množství, které se vyloučí při fermentacích penicilinu v železných tancích za cca 120 hod. U půd sterilizovaných ve skle (zdroj dusíku Pharmamedia nebo sojová mouka — viz příklady) nepřekročí obsah železa 5 gama/ml. S kmenem 65/41 je inhibice penicilinu následující:The intensity of penicillin biosynthesis inhibition depends on the iron concentration in the soil fermentation. Up to an iron concentration of 50 gamma / ml soil fermentation, the relationship between iron concentration and inhibition of biosynthesis is linear, above this concentration the decrease in production is slower. However, an iron concentration of 50 gamma / ml is precisely the amount that is eliminated in penicillin fermentations in iron tanks in about 120 hours. With strain 65/41 the inhibition of penicillin is as follows:

dny fermen- tace days fermen- tace růst — sediment v % obsah železa gama/ml growth - sediment in% iron content gamma / ml penicilín j/ml penicillin j / ml 0 0 50 50 0 0 50 50 3 ' 3 ' 36 36 40 40 7100 7100 3200 3200 5 5 38 38 40 40 14800 14800 5000 5000 7 7 38 38 38 38 23500 23500 7100 7100 9 9 38 38 38 38 27200 27200 9200 9200 10 10 32 32 36 36 26000 26000 8400 8400 11 11 26 26 26 26 24800 24800 6100 6100

⁺^Mocenství železa neovlivňuje intenzitu inhibice. ⁺ ^ Iron strength does not affect the intensity of inhibition.

množství přidaného železa do půdy gama/ml amount of iron added to the soil gamma / ml % inhibice biosynL^, penicilinu % inhibition of biosynL1, penicillin 0 0 0 0 12,5 12.5 42 42 25,0 25.0 58 58 50,0 50.0 70 70 100,0 100.0 74 74 300,0 300.0 95 95

Citlivost produkčních kmenů na železo je různá, u většiny kmenů však inhibice nepřesahuje při 50 ‘ gama železa na ml fermentační půdy 30%, u vysokoprodukčního kmene Penicillium chrysogenum ; 65/41 je inhibice 70%.The sensitivity of the production strains to iron varies, but in most strains the inhibition does not exceed 30% at 50 .mu.g of iron per ml of fermentation broth, in the high-production strain Penicillium chrysogenum; 65/41 inhibition is 70%.

kmen strain produkce penicilinu v j/ml penicillin production in j / ml % inhibice % inhibition železo do ferm. půdy nebylo přidáno iron into ferm. soil was not added do ferm. půdy přidáno 50 gama železa na ml do ferm. soil added 50 gamma iron per ml Q 176 Q 176 1400 1400 1000 1000 30 30 NG/L NG / L 3900 3900 2900 2900 25 25 NMG IV/47 NMG IV / 47 13100 13100 9400 9400 28 28 UVXXVII/74 UVXXVII / 74 21000 21000 15300 15300 27 27 Mar: Cu 7/8-PFP- Cu 7/8-PFP- -10 -10 22000 22000 15000 15000 32 ' 32 ' 65/41 65/41 27000 27000 9000 9000 , 67 , 67

Železo proniká buněčnou blanou a ukládá se do mycelia. Čím je koncentrace železa v půdě vyšší, tím se jej v myceliu nahromadí více.Iron penetrates the cell membrane and is deposited in the mycelium. The higher the concentration of iron in the soil, the more it accumulates in the mycelium.

koncentrace železa přidaného do půdy v 0. hodině gama/ml concentration of iron added to soil at 0 hour gamma / ml koncentrace železa v myceliu v době max. růstu gama/mg concentration of iron in the mycelium at the time of maximum gamma / mg growth 0 0 0 0 12,5 12.5 12,0 12.0 25,0 25.0 22,0 22.0 50,0 50.0 49,0 49.0 100,0 100.0 98,0 98.0 300,0 300.0 270,0 270.0

Koncentrace železa v myceliu se jeho stářím nemění, teprve s nastupující autolýzou je železo z mycelia opět uvolňováno do kultivačního prostředí.The concentration of iron in the mycelium does not change by its age, only with the onset of autolysis the iron is released from the mycelium again into the culture medium.

Jelikož se jedná při inhibičním působení železa o poškození enzymů syntetizujících penicilín, je vliv železa výraznější v době, kdy se tvoří syntetizující aparát:Since the inhibitory action of iron is a damage to penicillin synthesizing enzymes, the effect of iron is more pronounced at the time the synthesizing apparatus is formed:

přidávané železo gama/ml v hodinách fermentace added iron gamma / ml in fermentation hours produkce penicilinu j/ml production penicillin j / ml 0 0 24 24 48 48 72 72 96 96 120 120 144 144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27 000 27 000 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 0 0 0 0 8 600 8 600 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 0 0 7 200 7 200 0 0 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 4 600 4 600 0 0 0 0 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 3 400 3 400

Jako potenciální detoxifikační látky přicházejí v úvahu komplexony a titriplexy. Výsledky s použitými látkami v optimálních účinných koncentracích jsou následující:Possible detoxifying agents are complexons and titriplexes. The results with the substances used in optimal effective concentrations are as follows:

detoxificans detoxificans optimální konc. v% optimal conc. in% produkce penicilinu v j/ml penicillin production in j / ml železo v půdě 50 gama/ml iron in soil 50 g / ml železo v půdě 0 iron in soil 0 Syntron A Syntron A 0,1 0.1 7 100 7 100 29 000 29 000 Syntron B Syntron B 0,5 0.5 17 100 17 100 27 800 27 800 Kompleχοη III Kompleχοη III 0,1 0.1 16 100 16 100 25 300 25 300 TIT I TIT I 0,075 0,075 25 800 25 800 26 700 26 700 TITIV TITIV 0,05 0.05 11 900 11 900 26 700 26 700 TIT V TIT V 0,05 0.05 27 800 27 800 26 700 26 700 TIT VI TIT VI 0,05 0.05 . 10 400 . 10 400 26 700 26 700

Chemické složení použitých látek:Chemical composition of used substances:

prodej- ný název sale- ný name chemický název chemical name sumární vzorec summary formula moleku- lová hmot. moleku- lová wt. Syntron A Syntron A nitrilotrioctová kyselina nitrilotriactová acid c₆h₉no₆ c ₆ h ₉ no ₆ 191,14 191.14 Syn- Son- ethylendiami- ethylenediami- C₁₀Hi4N2O8C ₁₀ Hi4N2O8 372,24 372.24 tron B Kom- plexon III (p.a.) TITI tron B Kom- plexon III (Bye.) TITI notetraoctová kys. dvojsod. sůl totožný se Syntronem B totožný se Syntronem A notetraacetic acid disodium. salt identical to Syntron B identical to Syntron A Na₂. 2H₂OOn ₂ . 2H ₂ O TITIV TITIV cyklohexylen(l,2)-dinitrilotetraoctová kys. (monohydrát) cyclohexylene (1,2) -dinitrilotetraacetic acid (monohydrate) c₁₄h₂₂n₂o₈ h₂oc ₁₄ h ₂₂ o ₂ o ₈ h ₂ o 364,36 364.36 TIT V TIT V dietylentriaminpentaoctová kys. diethylenetriaminepentaacetic acid CbvH^HjOio CbvH2O3O10 393,35 393.35 TIT VI TIT VI bis-(aminoethylen)-glykolether-N, N, Ν', N' -tetraoctová kys. bis- (aminoethylene) -glycol ether-N, N, Ν ', N '-tetraacetic acid Cj4H₂4N₂OioC ₁₄ H ₂₄ N ₂ O ₁₀ 380,35 380.35

Zdrojem železa při fermentacích v tancích však není jen nevhodný konstrukční materiál, ale i suroviny, zejména arašídová mouka, síran amonný atd. Navrhovaný způsob eliminace toxického vlivu železa odstraňuje i nepříznivý vliv nekvalitních surovin.However, the source of iron during fermentations in tanks is not only unsuitable construction material, but also raw materials, especially peanut flour, ammonium sulphate, etc. The proposed method of eliminating the toxic influence of iron removes also the unfavorable effect of poor quality raw materials.

Příklad 1Example 1

Fermentace v laboratorním měřítku byla provedena kultivací produkčního mikroorganismu Penicillium chrysogenum 65/41 ve varných baňkách obsahu 500 ml se 40 ml fermentační půdy na rotačním třepacím stroji. Půda obsahovala jako zdroj dusíku Pharmamedii enzymatický hydrolyzát bavlníkové mouky) a síran amonný, zdrojem uhlíku byla laktóza a sojový olej, zdrojem síry síran sodný, prekurzorem byla fenoxyoctová kyselina, ústojnou látkou byl uhličitan vápenatý a fosfát. Výchozí pH bylo cca 7,0. Inokulace fermentačních půd byla provedena 5% vegetativního inokula I připraveného v inokulační půdě obsahující jako i' zdroj dusíku kukuřičný extrakt a síran amonný, i zdrojem uhlíku byla glukóza a laktóza, dále půda obsahovala ústojné látky uhličitan vápenatý a fos fát, výchozí pH bylo cca 6,7. Teplota při kultivacích byla 25 °C, doba fermentace 10 dní. Při tomto j standardním postupu bylo do fermentační půdy i přidáno 50 gama/ml železa ve formě síranu železnatého a dále železo v tomtéž množství a současně Titriplex V nebo Titriplex I.Laboratory fermentation was performed by culturing the production microorganism Penicillium chrysogenum 65/41 in 500 ml beakers with 40 ml of fermentation broth on a rotary shaker. The soil contained an enzymatic hydrolyzate of cotton flour) and ammonium sulfate as the source of nitrogen (Pharmamedii), the source of carbon was lactose and soybean oil, the source of sulfur was sodium sulfate, the precursor was phenoxyacetic acid, and calcium carbonate and phosphate. The initial pH was about 7.0. Inoculation of the fermentation broths was carried out with 5% of vegetative inoculum I prepared in inoculation broth containing corn extract and ammonium sulphate as the nitrogen source, glucose and lactose as the carbon source, calcium carbonate and phosphate as buffer substances, the initial pH was about 6 , 7. The culture temperature was 25 ° C, the fermentation time was 10 days. In this standard procedure, 50 g / ml of iron in the form of ferrous sulfate was added to the fermentation broth, as well as iron in the same amount and simultaneously Titriplex V or Titriplex I.

koncentrace concentration koncentrace concentration produkce penicilinu j/ml penicillin production j / ml přidaného železa gama/ml of added iron gamma / ml Titriplexu % Titriplex % 0 0 0 0 26 700 26 700 50 50 0 0 9 900 9 900 50 50 TIT V 0,05 TIT V 0.05 27 800 27 800 50 50 TITI 0,075 TITI 0,075 25 800 25 800

Příklad 2Example 2

Fermentace v laboratorním měřítku byla provedena kultivací produkčních mikroorganismů Pěni- I cillium chrysogenum Q 176, NG/L, NMGIV/47, U V XXVII/74 za stejných podmínek jako u příkladu 1 s tím rozdílem, že zdrojem dusíku ve fermentační půdě byla sojová mouka, zdrojem uhlíku sacharóza, která byla přidávána v průběhu fermentace, zdrojem síry byl simatan sodný, ústojnou funkci zastával uhličitan vápenatý. Fermentace dalším kmenem Cu 7/8 PFP-10 byla provedena rovněž shodným postupem s příkladem 1 s tím rozdílem, že zdrojem dusíku byla sojová mouka, zdrojem uhlíku byla rovněž laktóza a sojový olej, ostatní ingredience byly shodné s uvedenými u tohoto příkladu 2 výše. Inokulace fermentačních půd byla provedena 10% vegetativního inokula připraveného v půdě obsahující jako zdroj dusíku kukuřičný extrakt a síran amonný, zdrojem uhlíku byla sacharóza. Doba fermentace byla různá, podle vlastností kmene od 6. do 11. dnů fermentace. Železo bylo ke kontrolní půdě přidáno v koncentraci 50 gama/ml jako síran železnatý, a dále železo v tomtéž množství při současném přidání Titriplexu V.Laboratory-scale fermentation was performed by culturing the production microorganisms of Penicillium chrysogenum Q 176, NG / L, NMGIV / 47, UV XXVII / 74 under the same conditions as in Example 1 except that the nitrogen source in the fermentation broth was soya flour, the source of carbon was sucrose, which was added during the fermentation, the source of sulfur was sodium simatan, and calcium carbonate was the dominant function. Fermentation with another strain of Cu 7/8 PFP-10 was also carried out according to the same procedure as in Example 1 except that the nitrogen source was soy flour, the carbon source was also lactose and soybean oil, the other ingredients being the same as in Example 2 above. Inoculation of the fermentation broths was performed with a 10% vegetative inoculum prepared in the soil containing corn extract and ammonium sulfate as the nitrogen source, and the carbon source was sucrose. The fermentation time varied, depending on strain characteristics, from 6 to 11 days of fermentation. Iron was added to the control broth at a concentration of 50 g / ml as ferrous sulfate, and iron in the same amount while Titriplex V was added.

kmen strain koncentrace přidaného železa gama/ml concentration of added iron gamma / ml koncen- trace TIT V v % koncen- trace TIT V% produkce penicilinu j/ml production penicillin j / ml Q 176 Q 176 0 0 0 0 1400 1400 50 50 0 0 1000 1000 50 50 0,05 0.05 1470 1470 NG/L NG / L 0 0 0 0 3900 3900 50 50 0 0 2900 2900 50 50 0,05 0.05 3900 3900 NMG NMG IV/47 IV / 47 0 0 0 0 13100 13100 50 50 0 0 9400 9400 50 50 0,05 0.05 13900 13900 uv uv XXVII/74 XXVII / 74 0 0 0 0 21000 21000 ' 50 '50 0 0 15300 15300 50 50 0,05 0.05 21900 21900 Cu 7/8- Cu 7 / 8- -PFP-10 -PFP-10 0 0 0 0 22000 22000 50 50 0 0 15000 15000 50 50 0,05 0.05 21800 21800

Příklad 3Example 3

Fermentace byla provedena shodně s příkladem 1 s tím rozdílem, že železo bylo do fermentační půdy v průběhu fermentace dávkováno a Titriplex byl v půdě v 0. hodině nebo byl rovněž dávkován. Dávkování železa v gama/ml ve formě síranu železnatého bylo provedeno dle následujícího · schématu:Fermentation was carried out in accordance with Example 1 except that iron was dosed into the fermentation broth during fermentation and Titriplex was in the soil at 0 o'clock or was also dosed. Iron dosing in gamma / ml in the form of ferrous sulfate was performed according to the following scheme:

alternativa č. alternative no. hodniny fermentace fermentation values 0 0 24 24 48 48 72 72 96 96 120 120 144 144 I AND 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 0 0 0 0 II II 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 0 0 III III 0 0 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 0 0 IV IV 0 0 0 0 0 0 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5 12,5 12.5

Dávkování Titriplexu V v % bylo provedeno dle následujícího schématu:Dosing of Titriplex V in% was performed according to the following scheme:

alternativa č. alternative no. hodiny fermentace hours of fermentation 0 0 24 24 48 48 72 72 96 96 120 120 144 144 V IN 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0 0 0 0 0 0 VI VI 0 0 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0 0 0 0 VII VII 0 0 0 0 0,10125 0.10125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0 0 VIII VIII 0 0 0 0 0 0 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125 0,0125 0.0125

' železo — č. alternativy Iron - No Alternatives Titriplex — ě. alternativy Titriplex. alternatives produkce penicilinu ýml Penicillin production 0 0 »0 »0 26 700 26 700 50 gama/ml 50 g / ml 0 0 9 900 9 900 v půdě in the ground I AND 0 0 5 600 5 600 II II 0 0 7 200 7 200 III III 0 0 4 600 4 600 IV IV 0 0 3 400 3 400 I AND 0,05 % v půdě 0.05% in soil 26 500 26 500 II II 0,05 % v půdě 0.05% in soil 26 100 26 100 III III 0,05 % v půdě 0.05% in soil 26 500 26 500 IV IV 0,05 % v půdě 0.05% in soil 25 300 25 300 I AND V IN 25 600 25 600 II II VI VI 26 900 26 900 III III VII VII 27 000 27 000 IV IV VIII VIII 25 400 25 400

Íp^edmět vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Claims

A method for removing the toxic effect of iron in penicillin biosynthesis by culturing the production microorganism Penicillium chrysogenum in a liquid nutrient medium comprising assimilable carbon and nitrogen, mineral nutrient salts and a precursor under submerged conditions, characterized in that the production microorganism is cultivated with an additive of 0.050 to 75% weight / volume of nitrilotriacetic acid or diethylenetriaminepentaacetic acid in the culture medium.

Printed by Moravian Printing Works, plant 12, Leninova 21, Olomouc

Price: 2,40 Kčs