CS207916B1

CS207916B1 - Činidlo ke stanovení aktivity alfa-amylásy

Info

Publication number: CS207916B1
Application number: CS879A
Authority: CS
Inventors: Jiri Fischer; Jiri Medek; Richard Machat; Karel Jurak; Eva Keprtova; Vladimir Partl; Josef Kvasnicka; Karel Pulkrabek; Ivan Vermousek; Vladimir Balac; Jaromir Liska
Original assignee: Jiri Fischer; Jiri Medek; Richard Machat; Karel Jurak; Eva Keprtova; Vladimir Partl; Josef Kvasnicka; Karel Pulkrabek; Ivan Vermousek; Vladimir Balac; Jaromir Liska
Priority date: 1979-01-02
Filing date: 1979-01-02
Publication date: 1981-08-31

Abstract

Činidlo ke stanovení aktivity alfa-amylásy, V klinické biochemii slouží zvýšená aktivita k diagnostice akutních příhod podjaterní krajiny, hlavné pankreatid a k diagnostice paratitid. Stanovení aktivity alfa-amylásy má význam nejen v humánní ale i ve veterinární medicíně. Činidlo pro stanovení aktivity alfa-amylázy ve formě tablety nebo vodné suspenze sestává z daných množství upraveného škrobu, stabilizátoru pH činidla, aktivátorů reakčního systému, chloridů alkalických kovů, albuminu, polyvinylpyrrolidonu v určitých poměrech.

Description

(⁵⁴) Činidlo ke stanovení aktivity alfa-amylásy

Činidlo ke stanovení aktivity alfa-amylásy,

V klinické biochemii slouží zvýšená aktivita k diagnostice akutních příhod podjaterní krajiny, hlavné pankreatid a k diagnostice paratitid. Stanovení aktivity alfa-amylásy má význam nejen v humánní ale i ve veterinární medicíně. Činidlo pro stanovení aktivity alfa-amylázy ve formě tablety nebo vodné suspenze sestává z daných množství upraveného škrobu, stabilizátoru pH činidla, aktivátorů reakčního systému, chloridů alkalických kovů, albuminu, polyvinylpyrrolidonu v určitých poměrech.

207 916

Předmětem vynálezu je činidlo ke stanovení aktivity alfa-amylásy.

Pro stanovení aktivity alfa-amylásy (alfa-1,4-glukan-4-glukanohydrolásy E.C.3.3.1.1.) byla navržena celá řada postupů založených na schopnosti alfa-amylásy štěpit Škrob a jeho složky amylásu a amylopektin.

Přihlédneme-li k způsobu využití průběhu lytické reakce pro analytické účely, lze rozdělit postupy do ětyř skupin.

Do první skupiny patří metody sacharometrieké, určující aktivitu z přírůstků redukujících skupin. Vzhledem k tomu, že aktivita enzymů se určuje jako množství rozětěpených vazeb substrátu za sekundu, je její sacharometrieké určení, oproti postupům zbylých tří skupin, poměrně jednoduché.

Do druhé skupiny patří postupy amyloklastické, určující aktivitu z poklesu koncentrace toho podílu substrátu, který je schopen vytvořit s jodem modře zbarvený komplex. Do této skupiny je třeba zařadit metody viskozimetrické a nefelometrické, všechny jsou v podstatě funkcí molekulové váhy substrátu.

Třetí skupinu metod, rozvíjejících se v současné době, představuje postupy chromolytlcké, u nichž se určuje aktivita z přírůstků štěpných průduktů vzniklých působením enzymu na kovalentně obarvený škrob. Při vhodné úpravě postupu lze pak docílit toho, že se sleduje vznik nízkomolekulárních štěpných produktů, čímž se modeluje pseudosaoharometrický charakter postupu.

Do čtvrté skupiny lze zařadit metody, které nemají určený profil jednoznačně. Patří sem postupy enzymatické, založené v podstatě na enzymatickém stanovení maltÓzy. Maltosa se stanoví pomocí vhodné enzymatické reakce na glukosu. Hexokináaa, glukoaodehydrogenása.

Současný metodický rozvoj je spojen se stále rostoucím významem stanovení alfa-amylásy. Tak v klinické biochemii zvýšená aktivita slouží k diagnostice akutních příhod podjaterní krajiny, hlavně pankreatid a k diagnostice paratitid. Stanovení aktivity alfa-amylásy má význam nejen v humánní, ale i ve veterinární medicíně. S nástupem využívání moderních bioinženýrskýeh postupů jako kotvené enzymy apodobně se tento vývoj promítá v běžné biochemické praxi. Pro rutinní provoz se nejčastěji užívá metod druhé a třetí skupiny, které umožňují velmi jednoduchá provedení postupu. Jejich nevýhodou, společnou i pro metody čtvrté skupiny je, že není možné přímé zjištění aktivity analyzovaného produktu, že je nutná kalibrace. V současné době se rozvíjí'metody třetí skupiny a v souladu s rozvojem automatických analyzátorů i speciální enzymové postupy čtvrté skupiny. Z ekonomického, analytického i praktického hlediska pro běžnou praxi se jeví nejúčelnšjší využívání metod třetí skupiny. Spřežené enzymové metody jsou ekonomicky značně náročnějěí, a to jak z hlediska složení reakčni směsi, tak z hlediska provedení, neboť počáteční průběh reakce je nelineární. Jsou využívány pouze u některých druhů automatických analyzátorů.

Z výše uvedených důvodů vyplývá, že u ohromolytických metod pro stanovení alfa-amylásy se soustřeďuje pozornost nejvíce na jednoduchost a správnost postupů a provedení. Z těchto důvodů se rozšiřuje užití komerčních přípravků v podobě roztoků nebo tablet. Takto upravená činidla jsou zvlášt výhodná, protože umožňují pohodlné startování enzymové reakce substrátem dle mezinárodních doporučení.

Činidla v podobě tablety se musí dostatečně rychle rozpadnout a musí zajistit pro vlastní reakci snadné oddělení supernatantu od nerozpustných zbytků tablety. U některých stávajících tablet se váak setkáváme s tím, že se právě tyto zbytky těžko odstraňují a zvyšuje se tím pracnost a jsou i příčinou chyb při vlastním měření.

Výěe uvedené nevýhody podstatně omezuje složení činidla podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že činidle pro stanovení aktivity alfa-amylásy sestává z 25 až 95 % hmotnost nich upraveného škrobu, 4 až 20 % hmotnostních stabilizátoru pH činidla v rozmezí hodnot

6,5 až 7,5, 1 až 55 % hmotnostních aktivátorů reakčního systému, například kyseliny oholové nebo jejích derivátů, chloridů alkalických kovů, například sodného nebo draselného, albuminu, polyvinylpyrrolidonu nebo jejich směsí, například směs kyseliny cholové, chloridu sodného a albuminu v hmotnostním poměru 1 ku 5 ku 20 až 1 ku 25 ku 100 nebo směs kyseliny desoxycholové, chloridu sodného a albuminu v poměru 1 ku 4 ku 20 až 1 ku 30 ku 100 nebo směs kyseliny cholové, chloridu draselného a polyvinylpyrrolidonu v poměru 1 ku 8 ku 10 až 1 ku 20 ku 50. Činidlo s výhodou obsahuje 20 až 30 % hmotnostních stabilizátoru vodné suspenze, například bentonitu, talku, mikrokrystalické celulosy, koloidního kysličníku křemičitého, kysličníku titaničitého, křemeliny nebo jejich směsí, například směs koloidního kysličníku křemičitého, mikrokrystalické celulosy a křemeliny v hmotnostním poměru 1 ku 5 ku 10 až 1 ku 20 ku 100 nebo směs koloidního kysličníku křemičitého, bentonitu, mikrokrystalické celulosy a křemeliny v hmotnostním poměru 1 ku 1 ku 3 ku 6 až 1 ku 2 ku 10 ku 50 nebo směs koloidního kysličníku křemičitého, bentonitu, talku, mikrokrystalické celulosy a křemiliny v hmotnostním poměru 1 ku 2 ku2 ku5ku5až1ku3ku5ku10ku 50. Upravený škrob je s výhodou frakcionovaně přesrážený obarvený škrob, jeho složky nebo jeho frakce. Jako stabilizátoru pH v. rozmezí hodnot 6,5 až 7,5 se s výhodou použije fosfátový tlumič, tris(hydroxymethyl)-aminoraethanový tlumič nebo tlumič na bázi derivátů kyseliny barviturové

Touto úpravou činidla se získá snadno odstranitelný zbytek i čirý supernatant. Složení činidla je voleno tak, aby po přidání do inkubačního roztoku se vytvořila stabilní suspenze. Použité pomocné látky jaou volené tak, aby po zastavení reakce strhly zbytky substrátu a tím vyčeřily supernatant.

Pro praktické použití jsou níže uvedeny tyto příklady možného složení činidla:

Příklad!

Barvený škrobový substrát 40 %

Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát 6 %

Dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 %

Albumin hovězí lyofilisovaný 5 %

Kyselina cholová 0,1 %

Chlorid sodný 0,9 %

Křemelina 27,5 %

Celulosa mikrokrystalické 15 %

Koloidní kysličník křemičitý 2,5 %

Bentonit (upravovaný přírodní materiál na bázi křemičitanu hlinitého) 1,5 %

Váha tablety v rozmezí 0,1 až 0,2 g·

Příklad 2

Barevný Škrobový substrát 35 %

Tris (hydroxymet}iyl)-aminomethan 1 %

Tris (hydroxymethyl)-aminomethan hydrochlorid 7 %

Albumin hovězí lyofilizovaný __ 4 %

Kyselina cholová 0,2 %

Křemelina 38,3 %

Celulosa mikrokrystáická 12 %

Koloidní kysličník křemičitý 2,5 %

Váha tablety v rozmezí 0,1 až 0,2 g.

Příklad 3

Barevný škrobový substrát 76,3 %

Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát 8 %

Dihydrogenfosforeěnan draselný 1,5 %

Chlorid draselný 4 %

PolyvinyIpyrrolidon 10 %

Váha tablety v rozmezí 0,1 až 0,2 g.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Činidlo pro stanovení aktivity alfa-amylásy ve formě tablety nebo vodné suspenze vyznačené tím, že sestává z 25 až 95 % hmotnostních upraveného škrobu, 4 až 20 % hmotnostních stabilizátoru pH činidla v rozmezí hodnot 6,5 až 7,5, 1 až 55 % hmotnostních aktivátorů reakčního systému například kyseliny oholové nebo jejích derivátů, chloridů alkalických kovů například sodného nebo draselného, albuminu, polyvinylpyrrolidonu nebo jejich směsí například směsi kyseliny cholové, chloridu sodného a albuminu v hmot nostním poměru 1 ku 5 ku 20 až 1 ku 25 ku 100 nebo směsi kyseliny desoxycholové, chloridu sodného a albuminu v poměru 1 ku 4 ku 20 až 1 ku 30 ku 100 nebo směsi kyseliny cholové, chloridu draselného a polyvinylpyrrolidonu v poměru 1 ku 8 ku 10 až 1 ku 20 ku 50 a popřípadě 20 až 30 % hmotnostních stabilizátoru vodné suspenze například bentonitu, talku, mikrokrystalické eelulosy, koloidního kysličníku křemičitého, kysličníku titaničitého, křemeliny nebo jejich směsí například směsi koloidního kysličníku křemičitého, mikrokrystalické eelulosy a křemeliny v hmotnostním poměru 1 ku 5 ku 10 až 1 ku 20 ku 100 nebo směs koloidního kysličníku křemičitého, bentonitu, mikrokrystalioké oelulosy a křemeliny v hmotnostním poměru 1 ku 1 ku 3 ku 6 až 1 ku 2 ku 10 ku 50 nebo směs koloidního kysličníku křemičtého, bentonitu, talku, mikrokrystalioké oelulosy a křemeliny v hmotnostním poměru 1 ku 2 ku 2 ku 5 ku 5 až 1 ku 3 ku 5 ku 10 ku 20.
2. Činidlo podle bodu 1 vyznačené tím, že upraveným Škrobem je frakoionovaně přesrážený obarvený ákrob, jeho složky nebo jeho frakoe.
3. Činidlo podle bodu 1 nebo 2 vyznačené tím, že stabilizátorem pH v rozmezí hodnot 6,5 až 7,5 je fosfátový tlumič tris(hydroxymethyl)-aminomethanový tlumič nebo tlumič na bázi derivátů kyseliny barbiturové.