CS207669B2

CS207669B2 - Means for determination of the effectiveness of the hydride isoenzyme kreatinkinazy-mb

Info

Publication number: CS207669B2
Application number: CS785980A
Authority: CS
Inventors: Uwe Wuerzburg; Norbert Hennrich; Hans-Dieter Orth; Hermann Lang
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1978-09-15
Publication date: 1981-08-31

Description

Vynález se týká prostředku ke stanovení účinnosti hybridního isoenzymu kreatinkinézy-MB.The invention relates to a composition for determining the activity of the creatine kinase-MB hybrid isoenzyme.

Stanovení účinnosti kreatinkinázy (ATP: kreatin-fosfotransferáza, E. C. 2.7.3.2, zkratka CK) v séru je citlivou laboratorní metodou při diagnostice onemocněni kostních svalů a srdečního svalu, zejména u infarktu myokardu. Rozlišení při poranění kosterních svalů a srdečního svalu, svláětě při diferenciální diagnóze infarktu myokardu je však obtížné. Stanoveni celkové účinnosti CK není možno s jistotou toto odlišení provést. Řada pokusů proto vedla k tomu, zvýšit jistotu diferenciální diagnostiky při stanovení účinnosti CK, a to tak, že se stanoví účinnost dalších enzymů v séru a zjištěné výsledky se uvádějí do korelace, například vytvořením kvocientu CK/glutamát-oxalacetát-transamináza. Kvocienty tohoto typu však nedovoluji rozlišení mezi srdečním a plicním Infarktem nebo rozlišení mezi srdečním infarktem a důsledky šoku z jiných příčin.Determination of creatine kinase activity (ATP: creatine phosphotransferase, E. C. 2.7.3.2, abbreviation CK) in serum is a sensitive laboratory method in the diagnosis of diseases of bone muscles and heart muscle, especially in myocardial infarction. However, it is difficult to distinguish between skeletal muscle and cardiac muscle injuries, particularly in the differential diagnosis of myocardial infarction. The determination of the overall CK efficiency cannot be made with certainty. Many attempts have therefore been made to increase the confidence of differential diagnosis in determining the efficacy of CK by determining the efficacy of other serum enzymes and correlating the results with, for example, the formation of a CK / glutamate-oxalacetate-transaminase quotient. However, quotients of this type do not allow a distinction between a heart attack and a pulmonary infarction or a distinction between a heart attack and the consequences of shock from other causes.

CK se vyskytuje v organismu ve formě tří isoenzymů, a to CK-HM, například ve svalu, CK-BB, například v mozkové tkáni a jako hybrid CK-MB, který sestává z podjednotky M a podjednotky B, například v srdečním svalu. Účinnost CK, tak jak se stanoví v krevním séru, je vztažena obvykle na isoenzym CK-MM, protože CK-BB neprochází hematoencefalickou bariérou a CK-MB je omezen na určité orgány, například na srdeční sval. Při poškození srdeční svaloviny, například při srdečním infarktu se však CK-MB uvolňuje do krevního séra, kde je možno provést příslušné stanoveni.CK occurs in the body in the form of three isoenzymes, namely CK-HM, for example in muscle, CK-BB, for example in brain tissue, and as a hybrid of CK-MB, which consists of the M subunit and B subunit, for example heart. The efficacy of CK, as determined in blood serum, is usually related to the CK-MM isoenzyme because CK-BB does not cross the blood-brain barrier and CK-MB is restricted to certain organs, such as the heart muscle. However, in the case of cardiac muscle damage, for example, in a heart attack, CK-MB is released into the blood serum where an appropriate assay can be performed.

Kvantitativní stanovení tohoto isoenzymu vedle CK-MM v krevním séru je nejcltllvějšf a pro diferenciální diagnostiky nejprokazatelnější laboratorní metodou pro stanovení srdečního infarktu. Kromě srdečního svalu obsahují CK-MB ještě některé další orgány, například slinivka břišní, bránice, aorta, plíce a děloha, avšak účinnost těchto orgánů je přibližně 100x nižší než v srdečním svalu, takže účinnost CK-MB, popřípadě uvolněná v uvedených orgánech leží pod hranicí stanovení.The quantitative determination of this isoenzyme in addition to CK-MM in blood serum is the most comprehensive and most demonstrable laboratory method for the determination of heart attack for differential diagnostics. In addition to the heart muscle, CK-MB also contains some other organs, such as the pancreas, diaphragm, aorta, lungs and uterus, but the efficacy of these organs is approximately 100 times lower than in the heart muscle, so that limit of determination.

Až dosud se stanovení účinnosti CK-MB provádělo v podstatě třemi způsoby: .?·,Until now, the determination of the efficacy of CK-MB has been carried out in essentially three ways:.

1. Elektroforézou na různých nosičích. Takto získané výsledky si často odporují a často dochází k výskytu většího počtu pruhů, protože se současně stanoví i isoenzymy (Artefakty).1. Electrophoresis on various supports. The results obtained are often contradictory and often occur with a greater number of bands, as isoenzymes (artifacts) are also determined.

2. Chromatografií na sloupcích různých materiálů. Tato metoda je zdlouhavá, trvá několik hodin a nehodí se pro běžné stanovení. Výsledky zpráv jednotlivých pracovníků si částečně odporují.2. Chromatography on columns of various materials. This method is lengthy, takes several hours and is not suitable for routine determinations. The results of individual workers' reports are partly contradictory.

3. Imunologické stanovení pomocí precipitujicích protilátek. Tento způsob byl popsán v DE přihláškách P 21 28 670 a P 22 58 822 a dává dobré výsledky, například při kvantitativním stanovení isoenzymů aldolázy a alkalické fosfatázy. Ke stanovení poměrně nízká účinnosti CK a zejména CK-MB se citlivost této metody nehodí.3. Immunological assay using precipitating antibodies. This method has been described in DE applications P 21 28 670 and P 22 58 822 and gives good results, for example in the quantitative determination of aldolase and alkaline phosphatase isoenzymes. The sensitivity of this method is not suitable for determining the relatively low efficacy of CK and especially CK-MB.

Všechny tyto způsoby vyžadují ke svému provedení dlouhou dobu a již z tohoto důvodu se nehodí k rychlé diagnóze srdečního infarktu.All of these methods require a long time to execute and are therefore not suitable for a rapid diagnosis of a heart attack.

Vynález si klade za úkol navrhnout prostředek ke stanovení účinnosti CK-MB ve vzorku tělesných tekutin.It is an object of the present invention to provide a means for determining the efficacy of CK-MB in a body fluid sample.

Předmětem vynálezu je tedy prostředek ke stanoveni účinnosti isoenzymů kreatinkinézy MB za přítomnosti kreatinkinézy MM ve vzorku tělesné tekutiny, vyznačující se tím, že obsahuje 0,01 až 1,0 mg protilátek pro inhibici až 2 500 jednotek na litr podjednotky MM a MB ve vzorku tělesné tekutiny.Accordingly, the present invention provides a composition for determining the efficacy of creatine kinase MB isenzymes in the presence of creatine kinase MM in a body fluid sample, comprising 0.01 to 1.0 mg antibodies to inhibit up to 2,500 units per liter of MM and MB subunit in a body sample. fluid.

S výhodou se postupuje tak, že se vzorek tělesné tekutiny a protilátky lnkubuje za přítomnosti substrátu pro kreatinklnázu, s výhodou kreatinu, kreatinfosfátu, adenosinfosfátu, adenosintrifosfátu a hořečnatých iontů. Příslušné protilátky se získají očkováním zvířat, s výhodou koz, kreatinkinázou MM, které byla předem inaktivována přidáním N-acetylcysteinu, merkaptoetanolu, glutathionu, dithioerythritu, dithiothreitu a/nebo S-(2-aminoetyl)isothiouroniumbromidhydrobromidu jako látek stabilizujících a aktivujících thioskupinu.Preferably, the sample of body fluid and antibody is incubated in the presence of a substrate for creatine synthesis, preferably creatine, creatine phosphate, adenosine phosphate, adenosine triphosphate, and magnesium ions. Appropriate antibodies are obtained by inoculating animals, preferably goats, with creatine kinase MM which has been previously inactivated by the addition of N-acetylcysteine, mercaptoethanol, glutathione, dithioerythrite, dithiothreite and / or S- (2-aminoethyl) isothiouronium bromide hydrobromide stabilizing and activating agents.

Tělesnou tekutinou se při provádění způsobu s použitím prostředku podle vynálezu rozumí především lidské krevní sérum. Je však možno provádět stanovení i v jiných tělesných tekutinách, jako je plná krev, plazma, moč, sputum apod., stanoveni je rovněž možno provádět v obdobném vyšetřovacím materiálu ze zvířat. CK-BB ruší prováděni způsobu podle vynálezu a z tohoto důvodu nesmí být přítomen v krevních tekutinách, v nichž má být stanovení provedeno.By bodily fluid is meant, in particular, human blood serum in the method of the invention. However, other body fluids such as whole blood, plasma, urine, sputum and the like may also be used, and may also be performed in a similar animal test material. CK-BB interferes with the method of the invention and must therefore not be present in the blood fluids in which the assay is to be performed.

Protilátky pro prostředek podle vynálezu je možno získat očkováním zvířat CK-MM-antigeny. Jako antigen se užije především lidský CK-MM. Je možno užít také CK-MM ze zvířat, a to v případě, že takto získaná antiséra jsou schopna úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v lidském CK-MM a CK-MB za případné přítomnosti CK-substrátů, aniž by přitom došlo k inaktivaci enzymatické účinnosti podjednotky B v přítomném CK-MB. Dárcem antigenu CK-MM jsou především různé druhy opic, především rhesus a šimpanz, dále domácí zvířata jako vepř, kůň, skot, králík a morče a další zvířata jako krysy, myši a ptáci, například husy, kachny a slepice.Antibodies for the composition of the invention can be obtained by inoculating animals with CK-MM-antigens. The antigen used is primarily human CK-MM. CK-MM can also be used from animals, provided that the antisera thus obtained are able to completely block the enzymatic activity of the M subunit in human CK-MM and CK-MB in the presence of CK-substrates without inactivating the enzymatic activity of subunit B in the present CK-MB. The donor of CK-MM antigen is primarily various species of monkeys, especially rhesus and chimpanzees, as well as domestic animals such as pig, horse, cattle, rabbit and guinea pigs and other animals such as rats, mice and birds such as geese, ducks and chickens.

Antigen CK-MM, užitý k'výrobě protilátek podle vynálezu má být prostý CK-MB a CK-BB. Citlivým kritériem tohoto požadavku na čistotu je imunologická analýza, která se s výhodou provádí difúzí nebo elektroforézou. Mimoto je možno využít i analytické elektroforézy a elektrofoku8aee při použití polyakrylamidového gelu. Při použití těchto metod je možno provést dobré· stanovení na čistotu oproti GK-MB a CK-BB. Mimoto je možno stanovit absolutní čistotu proti jiným bílkovinám, kterou je možno provést například dvěma posledními.způsoby, což je věak méně důležité. Mikroheterogenita CK-isoenzymatických typů, která spočívá v malých rozdílech složení aminokyselin u jednotlivých isoenzymů, nehraje při stanovení čistoty zpravidla žádnou úlohu.The CK-MM antigen used to produce the antibodies of the invention should be free of CK-MB and CK-BB. A sensitive criterion of this purity requirement is immunological analysis, which is preferably performed by diffusion or electrophoresis. In addition, analytical electrophoresis and electrofocusing using a polyacrylamide gel may also be utilized. Using these methods, a good purity determination against GK-MB and CK-BB can be performed. In addition, absolute purity against other proteins can be determined by, for example, the last two methods, which is less important. The micro-heterogeneity of CK-isoenzymatic types, which consists of small differences in the amino acid composition of the individual isoenzymes, usually has no role in determining the purity.

K imunizaci se užívá takových zvířat, která po očkování aktivovaným CK-MM tvoří protilátky, které jsou schopné úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v kreatinkinázách MU a MB, aniž by přitom došlo k blokováni enzymatické účinnosti podjednotky B v přítomném CK-MB. Zvláště vhodné jsou kozy. Je však možno užít i jiných zvířat, zejména obratlovců, při jejichž použití je možno rovněž získat žádané protilátky. Jde například o různé druhy opic, koně, skot a podobná zvířata, ovce, psa, vepře, králíka, ptáky, například slepice, krocany, husy a kachny, dál® krysy, myši a morčata. Pro indukci protilátek jsou zvláště vhodné kozy, které za přítomnosti CK-substrátu vytváří protilátky, které účinně brzdí podjednotku M v CK-MM i v GK-MB.For immunization, animals are used which, upon inoculation with activated CK-MM, produce antibodies which are capable of completely blocking the enzymatic activity of the M subunit in the MU and MB creatine kinases without blocking the enzymatic activity of the B subunit in the present CK-MB. Goats are particularly suitable. However, other animals, particularly vertebrates, may also be used to obtain the desired antibodies. Examples include monkeys, horses, cattle and the like, sheep, dog, pig, rabbit, birds, such as hens, turkeys, geese and ducks, rats, mice and guinea pigs. Especially suitable for the induction of antibodies are goats which, in the presence of a CK-substrate, produce antibodies that effectively inhibit the M subunit in both CK-MM and GK-MB.

Imunizage pokusných zvířat se provádí aktivovaným lidským nebo zvířecím CK-MM. Aktivace CK-MM se provádí známými reakčními složkami, které stabilizují a aktivují skupiny SH- a/nebo dvojvaznými kovovými ionty, s výhodou kombinací svrchu uvedených činidel a kovových iontů. Reakčními činidly’, schopnými stabilizovat a aktivovat SH-skupiny, jsou například N-acetylcystein, merkaptoetanol a dithioerythrit, dále glutathion, cystein, dithiothreit, S-(2-aminoetyl)isothiouroniumbromid-hydrobromid (AET) a/nebo kyselina thiogly kolová. V případě dvojvazných kovových iontů padají v úvahu odpovídající ve vodě rozpustné soli, například chloridy nebo acetáty, s výhodou hořčíku, mimoto manganu, vápníku a/nebo kobaltu. Uvedená aktivace je zásadně známá z jiných oborů.Immunizage of the test animals is performed by activated human or animal CK-MM. Activation of CK-MM is carried out by known reactants which stabilize and activate SH- and / or divalent metal ions groups, preferably by a combination of the above agents and metal ions. Examples of reagents capable of stabilizing and activating SH-groups are N-acetylcysteine, mercaptoethanol and dithioerythrites, as well as glutathione, cysteine, dithiothreite, S- (2-aminoethyl) isothiouronium bromide hydrobromide (AET) and / or thioglycic acid. In the case of divalent metal ions, the corresponding water-soluble salts, for example chlorides or acetates, preferably magnesium, in addition manganese, calcium and / or cobalt, are suitable. This activation is generally known from other fields.

Další imunizace a zpracování získaného materiálu na antiséra a protilátky se provádí známým způsobem. Také další zpracování a uchovávání antisér a protilátek se provádí způsoby, které jsou z imunologie známé.Further immunization and processing of the obtained material into antisera and antibodies is carried out in a known manner. Further processing and storage of antisera and antibodies is also carried out by methods known in immunology.

Protilátky, jichž se užívá v prostředku podle vynálezu,spadají do skupiny IgG-imunoglobulinů (bivalentní protilátky). Jejich molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 130 až 210 000, β výhodou 160 000. Jejich předběžná sedimentační konstanta je v rozmezí 6 S až 8 S, s výhodou 7 S. Obsah uhlohydrátů je přibližně 3 hmotnostní %. Kromě Jg6-protilátek lze užít také monovalentních Jg6-fragnentů (= Fab) a JgM-protilátek.Antibodies used in the composition of the invention belong to the class of IgG-immunoglobulins (bivalent antibodies). Their molecular weight is in the range of 130 to 210,000, preferably 160,000. Their preliminary sedimentation constant is in the range of 6S to 8S, preferably 7S. The carbohydrate content is approximately 3% by weight. In addition to Jg6-antibodies, monovalent Jg6-fragments (= Fab) and JgM-antibodies can also be used.

Protilátky podle vynálezu mají úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v kreatinkináze. Pod pojmem úplně blokovat se rozumí průměrný zůstatek nejvýše 5 jednotek/litr, avšak β výhodou méně než 3 jednotky/litr enzymatické účinnosti podjednotky M v CK-MM a CK-MB po uvedení vzorku do styku s protilátkou.The antibodies of the invention are intended to completely block the enzymatic activity of the M subunit in creatine kinase. By totally blocking is meant an average balance of not more than 5 units / liter, but preferably less than 3 units / liter of the enzymatic activity of the M subunit in CK-MM and CK-MB after contacting the sample with the antibody.

Mimoto nemají protilátky ovlivňovat enzymatickou účinnost podjednotky B v CK-MB. To znamená, že nemají blokovat více než 10 jednotek/litr_; s výhodou však méně než 5 jednotek na litr enzymatické účinnosti podjednotky B v CK-MB ve zpracovávaném vzorku.In addition, antibodies should not affect the enzymatic activity of subunit B in CK-MB. This means they should not block more than 10 units / liter _; preferably, however, less than 5 units per liter of enzymatic activity of subunit B in CK-MB in the sample being processed.

Výhodné provedení způsobu s použitím prostředku podle vynálezu spočívá v tom, že se ke vzorku tělesné tekutiny a protilátky za přítomnosti CK-substrátu při inkubaci přidají protilátky podle vynálezu, které mají mimoto mít tu vlastnost, že se jich blokující účinnost na enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB má plně rozvíjet i za přítomnosti CK-substrátu, aniž by přitom došlo k ovlivnění enzymatické účinnosti podjednotky B v přítomném CK-MB. Tuto vlastnost je možno zajistit zejména u protilátek, které byly získány z koz imunizací plně aktivním CK-MM, a to navíc k ostatním svrchu uvedeným vlastnostem. Tato vlastnost však není bezprostředně nutná k normálnímu provádění způsobu, při němž se nejprve provádí inkubace protilátky, pak se přidá CK-substrát a provádí se fotometrické měření.A preferred embodiment of the method using the composition according to the invention consists in adding to the sample of body fluid and antibody in the presence of CK-substrate incubation antibodies of the invention which have the property of blocking their activity on the enzymatic activity of the M subunit. CK-MM and CK-MB should be fully developed even in the presence of CK-substrate, without affecting the enzymatic activity of the B-subunit in the present CK-MB. In particular, this property can be assured for antibodies obtained from goats by immunization with fully active CK-MM, in addition to the other properties listed above. However, this property is not immediately necessary for the normal operation of the method, in which the antibody is first incubated, then the CK-substrate is added and photometric measurement is performed.

Jako CK-substrátu je možno užít všech běžných substrátů, popřípadě efektořů. Jde především o kreatln, kreatinfosfát, adenoslndifosfát, adenosintrifosfát a hořečnaté ionty.All conventional substrates or effectors may be used as CK substrates. These are mainly creatine, creatine phosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate and magnesium ions.

Stanovení účinnosti, resp. zbytkové účinnosti CK a jeho isoenzymů je možno provádět zásadně všemi rychlými a přesnými způsoby. Vhodné jsou například ty známé způsoby, které dovolují měřit účinnost CK po přidání CK-substrátů pomocí fotometrického stanovení, které navazuje na pomocnou reakci. Jde například o kolorimetrické metody, popsané například v Methoden dar enzymatischen Analýze, vyd. Η. V. Bergmeyer, 3. vydání (1974), sv. 1, str. 145 ff. Výhodné jsou kinetické metody, u nichž se stanoví enzymatická účinnost měřením v ultrafialovém světle při 334, 340 nebo 366 nm. Výhodná je například standardní metoda, při níž se stanoví CK při použití kreatinfosfátu a adenosindifosfátu., (Z. Kliň.Determination of efficiency, respectively. the residual efficacy of CK and its isoenzymes can basically be carried out in all fast and accurate ways. Suitable methods are, for example, those known methods which allow the measurement of CK efficiency after addition of CK-substrates by means of a photometric assay which follows the auxiliary reaction. For example, colorimetric methods are described, for example, in Methoden dar enzymatischen Analysis, ed. V. Bergmeyer, 3rd edition (1974), vol. 1, page 145 ff. Kinetic methods are preferred in which enzymatic activity is determined by measurement in ultraviolet light at 334, 340 or 366 nm. For example, a standard method in which CK is determined using creatine phosphate and adenosine diphosphate is preferred (Z. Klin.

Chem, Kliň. Biochem, sv. 8, str. 658 ff /1970/ a sv. 10, str. 182 /1972/). Testovací balíčky ke stanovení účinnosti CK tímto způsobem se běžně dodávají.Chem, Klin. Biochem, Vol. 8, pp. 658 (1970) and Vol. 10, p. 182 (1972)). Test kits to determine the efficacy of CK in this manner are commercially available.

Podle dalšího známého způsobu stanovení lze CK stanovit fluorometričky. Pomocí CK je možno uvolnit z kreatin-fosfátu kreatln, který ae pak měří fluorometricky po reakci s anhydrlnem v silně alkalických roztocích způsobem podle publikace R. B.Conn (Clin. Chem., sv. 6, str. 537 f /1960/ a Sax a další, Clin. Chem., sv. 11, str. 951 f /1965/).In another known assay method, CK can be determined by fluorometers. CK can be used to release creatine from creatine phosphate, which is then measured fluorometrically after reaction with anhydrine in strongly alkaline solutions as described by RBConn (Clin. Chem., Vol. 6, p. 537 (1960) and Sax et al.). Chem., Vol. 11, p. 951 (1965).

Dále bude uvedeno typické provedení způsobu s použitím prostředku podle vynálezu:Hereinafter, a typical embodiment of the method using the composition according to the invention will be described:

Vzorek tělesné tekutiny, v němž má být stanovení provedeno, s výhodou vzorek lidského séra, se smlsl s takovým množstvím CK-MM protilátek podle vynálezu, které je dostatečné k tomu, aby úplně blokovalo až 2 500 jednotek/litr podjednotky M v CK-MM a CK-MB, s výhodou 1 000 jednotek/litr. V tělesných tekutinách s vyšší celkovou účinností CK je účelné před vlastním stanovením provést předběžné ředění na účinnost přibližně 1 000 jednotek/litr. Toto předběžné ředění je pak nutno vzít v úvahu při výpočtech. Po smísení se vzorek inkubuje 1 až 30, s výhodou 5 minut při teplotě +10 až 40 °C, s výhodou při teplotě místnosti, zejména při teplotě 25 až 30 °C. Pak se stanov! zbývající enzymatická účinnost reakční směsi známým způsobem, 8 výhodou svrchu popsanou metodou při použití ultrafialového světla. Směs séra a protilátek se přidá ke známé směsi enzymu, koenzymu a substrátu, která obsahuje všechny enzymy, koenzymy a substráty, nutné k provedení uvedené metody, načež se přidá dostatečné množství roztoku pufru o pH 7. Vhodné přípravky obsahují například jako směs enzymu a koenzymu hexokinázu, glukózo-6-fosfátdehydrogenázu, adenosindifosfát a nikotinamidadenindinukleotidfosfét a jako substráty kreatinfosfát a glukózu.The body fluid sample in which the assay is to be performed, preferably a human serum sample, is mixed with an amount of CK-MM antibodies of the invention sufficient to completely block up to 2500 units / liter of M subunit in CK-MM and CK-MB, preferably 1000 units / liter. In body fluids with higher overall CK efficacy, it is advisable to pre-dilute to about 1,000 units / liter prior to assay. This preliminary dilution must then be taken into account in the calculations. After mixing, the sample is incubated for 1 to 30, preferably 5 minutes at + 10 to 40 ° C, preferably at room temperature, especially at 25 to 30 ° C. Then lay down! the remaining enzymatic activity of the reaction mixture in a known manner, preferably by the method described above using ultraviolet light. The serum / antibody mixture is added to a known enzyme, coenzyme / substrate mixture containing all the enzymes, coenzymes and substrates required to carry out the method, followed by the addition of a sufficient pH 7 buffer solution. hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, adenosine diphosphate and nicotinamide adenine dinucleotide phosphates and as substrates creatine phosphate and glucose.

Je také možné přidat směs séra a protilátek ke směsi koenzymu a enzymu nebo obráceně a pak teprve přidat směs pufru a substrátu. Vhodným pufrem je například neutrální pufr, který obsahuje s výhodou triethanolamin nebo imidazolacetát, popřípadě kyselinu morfolinpropansulfonovou nebo morfolinetansulfonovou. Po smísení se vzniklá směs inkubuje 1 až 10, s výhodou 5 minut při teplotě 15 až 40 °C, s výhodou 25 až 30 °C, načež se stanoví při teplotě místnosti změna extinkce. Z této změny se pak vypočítá účinnost podjednotky B v CK-MB.It is also possible to add a mixture of serum and antibodies to the mixture of coenzyme and enzyme, or vice versa, and then to add the mixture of buffer and substrate. A suitable buffer is, for example, a neutral buffer, which preferably contains triethanolamine or imidazole acetate, or morpholine propane sulphonic acid or morpholinetane sulphonic acid. After mixing, the resulting mixture is incubated for 1 to 10, preferably 5 minutes at a temperature of 15 to 40 ° C, preferably 25 to 30 ° C, after which the extinction change at room temperature is determined. From this change, the efficacy of subunit B in CK-MB is then calculated.

Tento způsob je možno obměnit tak, že 3e vzorek analyzované tělesné tekutiny Inkubuje s protilátkami podle vynálezu a CK-substráty za přítomnosti pufru a látek, nutných ke stanovení bez předběžné inkubace vzorku z protilátek. Při tomto provedení je nutné, aby protilátky, přítomné v prostředku podle vynálezu měly ještě tu vlastnost, že jsou schopné brzdit úplně enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB i za přítomnosti CX-substrátu. Tuto vlastnost mají například protilátky podle vynálezu, získané při použití plně účinného CK-MM z koz. Tyto protilátky umožňují provádět způsob jednoduchým a rychlým způsobem.This method may be varied by incubating a sample of the body fluid analyzed with the antibodies of the invention and CK-substrates in the presence of buffer and substances necessary for the assay without preincubating the sample of antibodies. In this embodiment, the antibodies present in the composition of the invention still have the property of being able to inhibit completely the enzymatic activity of the M subunit in CK-MM and CK-MB even in the presence of a CX-substrate. For example, antibodies of the invention obtained using fully active goat CK-MM have this property. These antibodies allow the method to be carried out in a simple and rapid manner.

Je například možno protilátky podle vynálezu předem uvedené do lyofilizované formy spolu se směsí koenzymu, enzymu a substrátu, nutnou k provádění dalšího stanovení, smísit s určitým množstvím roztoku pufru na roztok, který se přidá ke stanovovanému vzorku tělesná tekutiny, například séra, načež se stanoví účinnost podílu B v CK-MM. £ři obměně tohoto postupu je možno přidat protilátky také se směsí, která sestává z koenzymu a enzymu ve formě lyofilizátu, v tomto případě se zvlášt přidává do roztoku pufr a substrát.For example, the antibodies of the invention pre-lyophilized together with a mixture of coenzyme, enzyme, and substrate required to carry out the further assay may be mixed with a certain amount of buffer solution per solution to be added to a sample of body fluid such as serum. the efficacy of B in CK-MM. In a variation of this procedure, antibodies can also be added with a mixture consisting of a coenzyme and an enzyme in the form of a lyophilisate, in which case a buffer and a substrate are added separately to the solution.

Podle dalšího výhodného provedení je možno provádět současné stanovení celkové účinnosti CK a účinnosti CK-MB pomocí svrchu uvedeného výhodného provedení způsobu podle vynálezu v jediném vzorku. Je možno postupovat například tak, že se nejprve stanoví celková účinnost CK fotometricky známým způsobem, načež se přidá do téhož vzorku ve vodě rozpuštěný lyofilizovaný materiál, sestávající z CK-MM protilátky. Směs se inkubuje 1 až 10, s výhodou 5 minut a pak se stanoví zbytková účinnost vzorku fotometricky. Také při tomto provedení platí požadavek, aby protilátky úplně blokovaly enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB i za přítomnosti CK-substrátu.According to another preferred embodiment, the total CK activity and the CK-MB activity can be determined simultaneously by the above preferred embodiment of the method according to the invention in a single sample. For example, the total CK activity can be determined by a photometric method known in the art, followed by the addition of a lyophilized lyophilized material consisting of a CK-MM antibody to the same sample. The mixture is incubated for 1 to 10, preferably 5 minutes, and then the residual activity of the sample is determined photometrically. Also in this embodiment, the requirement is that the antibodies completely block the enzymatic activity of the M subunit in CK-MM and CK-MB even in the presence of the CK-substrate.

Je možno nastavit kapacitu protilátek v antiséru při výhodném provedení tak, aby antisérum úplně blokovalo 2 500 jednotek/litr, s výhodou 1 000 jednotek/litr podjednotky M v CK-MM a CK-MB. V případš, že celková účinnost CK ve stanovovanému vzorku je při této kapa citě protilátek příliš vysoká, je nutno také v tomto případě provádět předběžné ředění, například na účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB přibližně 1 000 jednotek/litr.It is possible to adjust the capacity of the antibodies in the antiserum in a preferred embodiment so that the antiserum completely blocks 2500 units / liter, preferably 1000 units / liter of the M subunit in CK-MM and CK-MB. If the total CK activity in the assay sample is too high for this antibody capacity, a preliminary dilution also needs to be performed in this case, for example, for an M subunit in CK-MM and CK-MB of approximately 1,000 units / liter.

Způsob s použitím prostředku podle vynálezu má oproti dříve známému stavu techniky podstatné výhody, jde zejména o vysokou přesnost výsledků a o rychlost a jednoduchost provedení.The method using the composition according to the invention has significant advantages over the prior art, in particular the high accuracy of the results and the speed and simplicity of execution.

Přesnost způsobu s použitím prostředku podle vynálezu je založena na tom, že protilátky jsou specifické proti podjednotce M v CK-MM a CK-MB a proto dovolují stanovit účinnost CK-MB v tělesných tekutinách, například lidském séru přímým způsobem.The accuracy of the method using the composition of the invention is based on the fact that the antibodies are specific for the M subunit in CK-MM and CK-MB and therefore allow to determine the efficacy of CK-MB in body fluids, for example human serum, directly.

V DE přihláškách P 21 28 670 a P 22 58 822 se naproti tomu popisuje imunologická metoda pro kvantitativní stanovení isoenzymu, která mé řadu nevýhod. Podle tohoto způsobu se sráží isoenzymy CK pro isoenzym specifickými precipitujícími protilátkami a pak se stanoví zbytková účinnost, která zůstává v supernatantu nad sraženinou. Bez ohledu na příliš velkou dobu provádění tohoto způsobu, zejména pro nutnost výroby většího množství specifických antisér je ještě v každém případě nutno užít alespoň dvou různých zkušebních vzorků, a to zejména stanovení celkové účinnosti CK a stanovení zbytkové účinnosti CK po vysrážení. To znamená, že účinnost CK je možno stanovit pouze na základě rozdílů měření. Proto také je výsledek této metody zpravidla zatížen běžnými chybami z obou měření. Při provádění způsobu podle vynálezu však se provádí jedno měření, čímž se podstatně snižuje příslušná chyba.DE applications P 21 28 670 and P 22 58 822, on the other hand, describe an immunological method for the quantitative determination of an isoenzyme which has a number of disadvantages. According to this method, CK isoenzymes are precipitated for isoenzyme-specific precipitating antibodies and the residual activity remaining in the supernatant above the precipitate is then determined. In spite of the excessive duration of the process, in particular because of the need to produce a plurality of specific antisera, at least two different test specimens still have to be used, in particular the determination of total CK activity and the determination of residual CK activity after precipitation. This means that CK efficacy can only be determined based on measurement differences. Therefore, the result of this method is usually burdened by common errors from both measurements. In carrying out the method according to the invention, however, one measurement is made, whereby the corresponding error is substantially reduced.

Při srážení je další nevýhodou, že imunologické srážení vyžaduje jako sekundární reakce dlouhou dobu, obvykle 60 minut i několik hodin, takže se pro rychlé stanovení nehodí.In clotting, another disadvantage is that immuno-clotting requires a long time, usually 60 minutes or several hours, as a secondary reaction, so that it is not suitable for rapid determination.

V Clin. Chim. Acta, sv. 58, str. 223 až 232 (1975) jsou popsány protilátky proti CK-isoenzymům. Tyto protilátky způsobují kromě 100% blokování účinnosti CK-MM také 80% blokádu CK-MB. To znamená, že kromě M podjednotky z CK-MB je blokována také převážná část B podjednotky, přičemž účinnost podjednotek M a B v CK-MB k celkové účinnosti tohoto isoenzymu je obvykle v poměru 50:100. Protože při použití těchto protilátek je zbytková účinnost přibližně 20 %, i při reprodukovatelnosti se získané hodnoty pro přesné měření CK-MB pro svou nízkost nehodí, protože celková účinnost CK v séru je i tak velmi nízká. Z uvedených důvodů se popsané protilátky nehodí pro stanovení CK-isoenzymů blokádou. Při provádění způsobu s použitím prostředku podle vynálezu zbývá ještě 50 % celkové účinnosti CK-MB, to znamená téměř veškerá účinnost podjednotky B, což je pro měření dostatečné. Z tohoto hlediska znamená způsob podle vynálezu podstatný pokrok.In Clin. Chim. Acta, Vol. 58, pp. 223-232 (1975) discloses antibodies against CK-isoenzymes. These antibodies cause, in addition to 100% blocking of CK-MM activity, 80% blockade of CK-MB. That is, in addition to the M subunit of CK-MB, the bulk of the B subunit is also blocked, with the efficacy of the M and B subunits in CK-MB generally being 50: 100 in relation to the overall efficacy of this isoenzyme. Since using these antibodies, the residual efficacy is approximately 20%, even with reproducibility, the values obtained for accurate measurement of CK-MB are not suitable because of their low level because the overall efficacy of serum CK is still very low. For these reasons, the described antibodies are not suitable for the determination of CK-isoenzymes by blockade. When carrying out the method using the composition according to the invention, 50% of the total activity of CK-MB remains, i.e. almost all of the activity of subunit B, which is sufficient for the measurement. In this respect, the process according to the invention represents a significant advance.

Rychlá proveditelnost je podstatnou výhodou. Platí to zejména pro výhodné provedení, při němž se blokáda podjednotky M v CK-MM a CK-MB a stanovení zbytkové účinnosti provádí současně. Při tomto provedení je možno v nejkratší době, například 5 až 30 minut s výhodou až 15 minut dojít k přesnému výsledku, na němž je možno stanovit diagnózu· Významnou výhodou způsobu s použitím prostředku podle vynálezu je také jednoduché provedení. Způsob podle vynálezu je možno ve velkých ústavech nebo klinikách provádět i při použití běžných mechanizovaných zařízení pro stanovení enzymatické účinnosti, je vSak možno jej provádět i v malých ústavech a lékařských laboratořích pomoci fotometru.Fast feasibility is an essential advantage. This is particularly true for a preferred embodiment wherein blockade of the M subunit in CK-MM and CK-MB and the determination of residual efficacy are performed simultaneously. In this embodiment, an accurate result can be obtained in the shortest time, for example 5 to 30 minutes, preferably up to 15 minutes. A significant advantage of the method using the composition according to the invention is also the simple implementation. The method according to the invention can be carried out in large institutes or clinics using conventional mechanized enzymatic activity devices, but can also be carried out in small institutes and medical laboratories by means of a photometer.

Pro jednotlivá stanovení jsou vhodné testovací balíčky, které obsahují věechny reakční složky, nutné pro prováděni způsobu s použitím prostředku podle vynálezu, a to vhodnou směs koenzymu, enzymu a substrátu, protilátky CK-MM podle vynálezu a roztok pufru. Testová cí balíček tohoto nebo podobného složení umožní stanovit v krátké době účinnost CK-MB.Test kits containing all the reagents necessary for carrying out the method using the composition of the invention, a suitable mixture of coenzyme, enzyme and substrate, the CK-MM antibody of the invention, and buffer solution are suitable for the individual assays. A test kit of this or similar composition will allow the CK-MB to be determined in a short time.

Podle známého stavu techniky nebylo možno očekávat, že lze vyřeSit stanovení CK-MB tak jednoduchým a rychlým způsobem, jako je tomu v případě způsobu s použitím prostředku podle vynálezu. Nebylo možno předvídat, že lze získat specifická antiséra, která budou úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB, nebudou však ovlivňovat enzymatickou účinnost podjednotky B v CK-MB. Teprve použití protilátek s těmito dosud neznámými vlastnostmi umožnilo provedení tohoto způsobu.According to the prior art, it was not expected that the determination of CK-MB could be solved in a simple and rapid manner as with the method using the composition of the invention. It was not predictable that specific antisera could be obtained that completely blocked the enzymatic activity of the M subunit in CK-MM and CK-MB, but would not affect the enzymatic activity of the B subunit in CK-MB. Only the use of antibodies with these hitherto unknown properties enabled the method to be carried out.

Je také překvapující, že protilátky podle vynálezu si podržují svůj plný blokující účinek i za přítomnosti substrátů. Tento jev zdaleka není samozřejmý. V literatuře jsou popsány protilátky, které za přítomnosti CK-substrátů již neinaktivují CK-MM na 100 % (Ann. N. Y. Acad. Sci., sv. 103, etr. 858 až 889 /1963/). Protilátky s těmito vlastnostmi by byly pro výhodné provedení způsobu, při němž se provádí blokování protilátkami za přítomnosti CK-substrátů, současně zcela nepoužitelné. Neblokovaný podíl účinnosti podjednotky M by mylně zvyšoval hodnoty měření pro CK-MB, popřípadě by omylem došlo k naměření účinnosti CK-MB v případě, že tento isoenzym by ve skutečnosti vůbec nebyl přítomen, čímž by došlo k omylu v diagnóze.It is also surprising that the antibodies of the invention retain their full blocking effect even in the presence of substrates. This phenomenon is far from self-evident. In the literature, antibodies are described which no longer inactivate CK-MM to 100% in the presence of CK-substrates (Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 103, pp. 858-889 (1963)). Antibodies with these properties would be completely useless at the same time for a preferred embodiment of the method of blocking antibodies in the presence of CK-substrates. An unlocked fraction of the efficacy of the M subunit would erroneously increase the measurement values for CK-MB, or would erroneously measure the efficacy of CK-MB if this isoenzyme was not actually present, thereby misinterpreting the diagnosis.

Překvapující vlastnost protilátek podle vynálezu, tj. úplné blokování enzymatické účinnosti podjednotky M v CK-MM a CK-MB bez ovlivnění enzymatické účinnosti substrátů; umožňuje dosud při imunologickém stanovení nedosažitelnou rychlost a přesnost stanovení účinnosti CK-MB. Tyto protilátky umožňují v praxi rychlé stanovení této účinnosti.The surprising property of the antibodies of the invention, ie, total blocking of the enzymatic activity of the M subunit in CK-MM and CK-MB without affecting the enzymatic activity of the substrates; allows the unreachable speed and accuracy of the CK-MB efficacy to be determined in immunoassays. These antibodies allow for a rapid determination of this activity in practice.

Je nyní možné stanovit laboratorní zkouškou zvýšení účinnosti CK u nemocných tak, že lze odlišit, zda běží o onemocnění nebo poranění kosterního svalu nebo svalu srdečního. Uvedeným způsobem je možno získat důležité údaje pro diferenciální diagnózu srdečního infarktu, například od plicního infarktu a/nebo od následků šoku a o jiných onemocněni, například poškození srdce.It is now possible to determine by laboratory test an increase in CK efficacy in patients so that it can be distinguished whether it is a skeletal or cardiac muscle disease or injury. In this way, important data can be obtained for the differential diagnosis of a heart attack, for example from a pulmonary infarction and / or from the consequences of shock and other diseases, for example heart damage.

Specifickým a přesným stanovením účinnosti CK-MB je možno zjistit srdeční poškození při jiných extrakardiálních onemocněních, například otravách a neštěstích, při terapeutických zákrocích, například oživovacích pokusech nebo při diagnostických zkouškách, například srdeční katetrizaci nebo koronární angiografii.By specifically and accurately determining the efficacy of CK-MB, cardiac damage can be detected in other extracardial diseases, such as poisoning and disasters, in therapeutic interventions, such as recovery experiments, or in diagnostic tests, such as cardiac catheterization or coronary angiography.

V následujících příkladech znamenají zkratky M a mM koncentrace v molech a milimolech.In the following examples, the abbreviations M and mM mean concentrations in moles and millimoles.

Příklad 1Example 1

Blokováni CK-MM, CK-MB a CK-BB protilátkou proti lidskému CK-MMBlocked by CK-MM, CK-MB and CK-BB antibody against human CK-MM

K lidskému séru, jehož vlastní účinnost CK byla potlačena,se přidá čistý CK-MM, CK-MB nebo CK-BB a měří se aktivita jednotlivých vzorků. Pak se 0,1 ml vzorků smísí s 0,1 ml roz· toku s obsahem protilátky proti CK-MM, připravené podle přikladu Ba a po důkladném promise· ní se směs inkubuje 35 minut při teplotě 25 °C. Pak se stanoví známým způsobem zbytková účinnost. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:Pure CK-MM, CK-MB or CK-BB is added to human serum whose intrinsic CK activity has been suppressed and the activity of each sample is measured. 0.1 ml of samples are mixed with 0.1 ml of a solution containing the anti-CK-MM antibody prepared according to Example Ba and incubated for 35 minutes at 25 ° C after thorough mixing. The residual activity is then determined in a known manner. The results are shown in the following table:

V tabulce je udána zbytková účinnost CK-isoenzymu po inkubaci s protilátkami proti lidskému CK-MM, a to jako střední hodnota i 1 .s vždy v 5 stanovení, přičemž .s znamená standardní odchylku.The following table shows the residual potency of the CK-isoenzyme after incubation with anti-human CK-MM antibodies as the mean value of 1 s in 5 assays, where s is the standard deviation.

TabulkaTable

Isoenzym Isoenzym Účinnost přidaného isoenzymu (jednotky/litr) Efficacy of added isoenzyme (units / liter) Zbytková účinnost po inkubaci s protilátkou proti CK-MM (jednotky/litr) Residual efficacy after incubation with anti - CK-MM (units / liter) CK-MM CK-MM 98 í 1,9 98 i 1.9 0,3 í 2,1 0.3 to 2.1 1 043 í 22 1,043 and 22 0,5 i 2,5 0.5 and 2.5 CK-MB CK-MB 103 í 2,0 103 2,0 2,0 53 í 1,7 53 í 1,7 410 + 7,8 410 + 7.8 206 t 6,2 206 t 6.2 CK-BB CK-BB 197 í 3,8 197 and 3.8 199 í 4,1 199 4,1 4,1

V mezích přesnosti měření je inhibována účinnost CK-MM na 100 %, CK-BB na 0 % a CK-MB na 50 % (odpovídají podílu 50 % podjednotky M). Výsledky jsou konstantní v širokém rozmezí účinnosti přidávaného isoenzymu.Within the limits of measurement accuracy, the efficacy of CK-MM is inhibited by 100%, CK-BB by 0% and CK-MB by 50% (corresponding to a ratio of 50% of the M subunit). The results are constant over a wide range of activity of the added isoenzyme.

Příklad 2Example 2

Test I ke kvantitativnímu stanovení účinnosti CK-MB v tělesných tekutináchTest I to quantify the efficacy of CK-MB in body fluids

a) Složení zkušebního balíčku(a) Composition of the test package

Baliček stačí na 10 stanovení účinnosti. Obsahuje 1 láhev pufru na 10 stanovení, 10 nádobek se směsí koenzymu, enzymu a substrátu a 1 nádobku s obsahem antiséra proti CK-MM, získaného podle příkladu Ba.Packages are enough for 10 efficiency determinations. It contains 1 bottle of 10 assay buffer, 10 flasks containing a mixture of coenzyme, enzyme and substrate, and 1 flask containing anti-CK-MM antisera obtained according to example Ba.

Nádoba se směsí koenzymu, enzymu a substrátu obsahuje tyto složky:Container containing a mixture of coenzyme, enzyme and substrate contains the following components:

disodnou sůl kreatinfosfátu ve formě hexehydrétu creatine phosphate disodium salt in the form of hexahydrate 27,24 mg 27.24 mg redukovaný glutathion reduced glutathione 6,4 , mg 6.4, mg (nebo místo předchozí složky N-acetylcystein) (or instead of the previous N-acetylcysteine component) 3,4 mg 3.4 mg disodná sůl adenosindifosfétu ve formě hexahydrátu adenosine diphosphate disodium salt in the form of hexahydrate 1,25 mg 1.25 mg nikotinamidadenindinukleotidfosfát ve formě disodné soli nicotinamide adenine dinucleotide phosphate in the form of its disodium salt 1 ,7 mg 1.7 mg adenosinmonofosfát ve formě disodné soli adenosine monophosphate in the form of its disodium salt 8,47 mg 8.47 mg hexokináza hexokinase 5 jednotek 5 units glukózo-6-fosfátdehydrogenáza glucose-6-phosphate dehydrogenase 3 jednotky 3 units glukóza glucose 8,32 mg 8.32 mg octan hořečnatý magnesium acetate 4,52 mg 4,52 mg

Nádobka s obsahem roztoku pufru obsahuje:Container containing buffer solution contains:

trietanolaminacetét ve vodětriethanolamine acetate in water

105 mmolů105 mmol

Lyofilizované protilátky se rozpustí ve 2 ml destilované vody. Vzniklý roztok protilátky se nastaví tak, aby byl schopen úplně blokovat až 1 000 jednotek/litr kreatinkinázy MU. U sér s velmi vysokým obsahem kreatinkinázy je proto nutno tato séra ředit na účinnost přibližně 1 000 jednotek/litr. Roztok protilátky je možno skladovat při teplotě +4 °C alespoň 7 dní.The lyophilized antibodies are dissolved in 2 ml of distilled water. The resulting antibody solution is adjusted to completely block up to 1000 units / liter of creatine kinase MU. Therefore, for sera with a very high creatine kinase content, these sera should be diluted to approximately 1,000 units / liter. The antibody solution may be stored at +4 ° C for at least 7 days.

b) Vlastní stanovení účinnosti CK-MB bl) Provedeníb) Determination of CK-MB efficacy b) Execution

Do reakční nádoby se napipetujePipette into the reaction vessel

0,1 ml séra +0,1 ml roztoku protilátky.0.1 ml serum + 0.1 ml antibody solution.

Po dobrém promísení se směs inkubuje 5 minut při teplotě 25 °C. Pak se 0,1 ml této reakční směsi nanese spolu s 2,0 ml roztoku pufru do nádobky, které obsahuje směs koenzymu, enzymu a substrátu.After mixing well, the mixture is incubated at 25 ° C for 5 minutes. Then, 0.1 ml of this reaction mixture, together with 2.0 ml of buffer solution, is dispensed into a vial containing a mixture of coenzyme, enzyme and substrate.

Po promísení se výsledná směs inkubuje 5 minut při teplotě 25 °C, načež se vlije do kyvety, a stanoví se extinkce při 25 °C a pak změna extinkce za minutu při vlnové délce 334, 340 nebo 366 nm při tloušlce vrstvy 1 cm.After mixing, the resulting mixture is incubated for 5 minutes at 25 ° C, then poured into a cuvette, and the extinction at 25 ° C is determined and then the change in extinction per minute at 334, 340 or 366 nm at a layer thickness of 1 cm.

b2) Výpočetb2) Calculation

Zjištěné účinnost CK vzorku se násobíThe observed CK potency of the sample is multiplied

a) zřeňovacím faktorem 2 adilution factor 2; and

b) faktorem pro CK-M-hybrid 2 z toho důvodu, že při prováděni zkoušky se měří pouze podjednotka B z CK-MB.(b) a factor for CK-M-hybrid 2 because only the B subunit of CK-MB is measured in the assay.

Z rozdílu extinkce za minutu AE/minuta se vypočítá střední hodnota a dosadí se Ao vzorce pro výpočet:From the extinction difference per minute AE / minute, the mean value is calculated and the Ao formula is used to calculate:

měření při 334 nm:measurement at 334 nm:

měření při 340 nm: měření při 366 nm:measurement at 340 nm: measurement at 366 nm:

Příklad 3 účinnost CK-MB = ^E/minuta x 4 x 3 500 jednotek/litr, objemová účinnost CK-MB = 4 E/minuta x 4 x 3 376 jednotek/litr, objemová účinnost CK-MB = ^E/minuta x 4 x 6 364 jednotek/litr.Example 3 CK-MB efficiency = 4 E / minute x 4 x 3500 units / liter, CK-MB efficiency = 4 E / minute x 4 x 3,376 units / liter, CK-MB efficiency = 4 E / minute x 4 x 6 364 units / liter.

Test 11 ke kvantitativnímu stanovení účinnosti CK-MB v tělesných tekutináchTest 11 to quantify the efficacy of CK-MB in body fluids

a) Složení zkušebního balíčku(a) Composition of the test package

Balíček stačí pro 30 stanovení účinnosti. Obsahuje 1 nádobku s obsahem pufru pro 30 stanovení a 30 nádobek lyofilizované směsi, sestávající z koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM, vyrobené způsobem podle příkladu Ba.The package is enough for 30 efficiencies. It contains 1 vial containing 30 assay buffer and 30 vials of lyophilized mixture, consisting of coenzyme, enzyme, substrate and anti-CK-MM antibody, prepared according to the method of Example Ba.

Množství trietanolaminacetátu obsažené v nádobce s roztokem pufru odpovídá množství udanému v příkladu 2a. Jednotlivě nádobky s obsahem koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM, získané způsobem podle příkladu Ba odpovídají 3 složkám, svrchu zmíněným v příkladu 2a a mimo to obsahují protilátku proti CK-MM, která úplně blokuje až 1 000 jednotek/litr CK-MM.The amount of triethanolamine acetate contained in the buffer solution vial corresponds to the amount given in Example 2a. Individual containers containing coenzyme, enzyme, substrate and anti-CK-MM antibody obtained by the method of Example Ba correspond to the 3 components mentioned above in Example 2a and additionally contain an anti-CK-MM antibody which completely blocks up to 1000 units / liter of CK -MM.

b) Stanovení účinnosti CK-MB bl) Provedeníb) Determination of CK-MB activity b) Execution

K obsahu nádobky se směsí koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM se pipetou přidá 2,0 ml roztoku pufru a 0,1 ml séra. Směs se promíchá a inkubuje 5 minut při teplotě 25 °C, načež se vlije do kyvety a 5 minut se měří extinkce při 25 °C při vlnové délce 334, 340 nebo 366 nm při tloušlce vrstvy 1 cm.Add 2.0 ml of buffer solution and 0.1 ml of serum to the contents of the vial containing the mixture of coenzyme, enzyme, substrate and anti-CK-MM antibody. The mixture is mixed and incubated for 5 minutes at 25 ° C, then poured into a cuvette and the extinction at 25 ° C at 334, 340 or 366 nm at 1 cm layer thickness is measured for 5 minutes.

b2) Výpočetb2) Calculation

Z rozdílu extinkce za minutu ΛΕ/minuta se vypočítá střední hodnota a tato hodnota se dosadí do odpovídajícího vzorce:From the extinction difference per minute inkΕ / minute, the mean value is calculated and this value is put into the corresponding formula:

měření při 334 nm: objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta x 7 000 jednotek/litr, měření při 340 nm: objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta x 6 752 jednotek/litr, měření při 366 nm: objemová účinnost CK-MB = Δ E/minuta x 12 768 jednotek/litr.measurement at 334 nm: volumetric efficiency CK-MB = ΔΕ / minute x 7000 units / liter, measurement at 340 nm: volumetric efficiency CK-MB = ΔΕ / minute x 6,752 units / liter, measurement at 366 nm: volumetric efficiency CK -MB = Δ E / minute x 12,768 units / liter.

Příklad 4Example 4

Současné stanovení celkové účinnosti CK a účinnosti CK-MBSimultaneous determination of total CK efficacy and CK-MB efficacy

a) Složení zkušebního balíčku(a) Composition of the test package

Složení zkušebního balíčku odpovídá složení balíčku z příkladu 2a.The composition of the test package corresponds to that of Example 2a.

b) Stanovení celkové účinnosti CK a účinnosti CK-MB bl) Provedení(b) Determination of total CK activity and CK-MB activity (b) Execution

Do nádobky se směsí koenzymu, enzymu a substrátu se přidá 2,0 ml roztoku pufru a 0,1 ml séra nebo zředěného séra. Směs se promísí a inkubuje se 5 minut při teplotě 25 °C, načež se vlije do kyvety a 2 minuty se měří změna extinkce (ΛΕ1) při 25 °C. Pak se přidá 0,1 ml roztotói protilátky, směs se okamžitě promíchá a po 3 minutách se znovu měří změna extinkce ( AE2) při teplotě 25 °C při vlnové délce 334, 340 nebo 366 nm a tlouštce vrstvy 1 cm.2.0 ml of buffer solution and 0.1 ml of serum or diluted serum are added to the vial containing the mixture of coenzyme, enzyme and substrate. The mixture is mixed and incubated for 5 minutes at 25 ° C, then poured into a cuvette and measured for extinction (ΛΕ1) at 25 ° C for 2 minutes. 0.1 ml of the antibody solution is then added, mixed immediately, and after 3 minutes the extinction change (AE2) is measured again at 25 ° C at 334, 340 or 366 nm and a 1 cm layer thickness.

b2) Výpočetb2) Calculation

Celková účinnost CK se vypočítá následujícím způsobem:The total CK efficiency is calculated as follows:

měření při 334 nm: objemová účinnost CK = ÁE1/minuta x 35 000 jednotek/litr, měřeni při 340 nm: objemová účinnost CK = ΔΕΙ/minuta x 3 376 jednotek/litr, měření při 366 nm: objemová účinnost CK = Δ E1/minuta x 6 364 jednotek/litr.measurement at 334 nm: volumetric efficiency CK = EE1 / minute x 35 000 units / liter, measurement at 340 nm: volumetric efficiency CK = ΔΕΙ / minute x 3,376 units / liter, measurement at 366 nm: volumetric efficiency CK = Δ E1 / minute x 6,364 units / liter.

Účinnost CK-MB se měření při 334 nm měření při 340 nm měření při 366 nm vypočítá následujícím způsobem:The CK-MB efficiency is calculated as follows at 334 nm measurement at 340 nm measurement at 366 nm as follows:

objemová účinnost CK-MB = 4,E2/minuta x 7 350 jednotek/litr, objemová účinnost CK-MB = fa E2/minuta x 7 090 jednotek/litr, objemové účinnost CK-MB = Δ E2/minuta x 13 364 jednotek/litrCK-MB volume efficiency = 4, E2 / minute x 7 350 units / liter, CK-MB volume efficiency = f and E2 / minute x 7,090 units / liter, CK-MB volume efficiency = Δ E2 / minute x 13,364 units / liter

Příklad 5Example 5

Stanovení účinnosti CK-MB u nemocných se srdečním infarktem a bez infarktu při použití zkušebního balíčku podle příkladu 3Determination of CK-MB Efficacy in Heart Attacked and Non-Heart Attacked Patients Using Example 3

a) Účinnost CK u různých skupin nemocnýcha) Efficacy of CK in different groups of patients

Počet případů Number cases Střední hodnota Mean value účinnost CK (jednotky/litr) CK efficiency (units / liter) účinnost CK-MB (jednotky/litr) CK-MB efficiency (units / liter) nemocný se zvýšenou účinností CK bez srdečního infarktu patient with increased efficacy of CK without heart attack 48 48 480 480 <1,7 <1.7 nemocný se srdečním infarktem Patient with heart attack 5 5 510 510 44 44

Z tabulky je zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno rychle a jednoznačně od sebe odlišit případy se srdečním infarktem.It can be seen from the table that the cases of a heart attack can be distinguished quickly and unambiguously from the method according to the invention.

b) Průběh účinnosti CK-MB u nemocných se srdečním infarktemb) The course of efficacy of CK-MB in patients with heart attack

Hodiny po vzniku infarktu Hours after heart attack CK-MB (jednotky/litr) CK-MB (units / liter) 3,5 3.5 < 5 <5 4,5 4,5 <5 <5 5,5 5.5 6 6 7,5 7.5 22 22nd 8,5 8.5 23 23 9,5 9.5 29 29 10,5 10.5 50 50 H,5 H, 5 46 46 13,5 13.5 56 56 15,5 15.5 55 55 17,5 17.5 64 64 21,5 21.5 62 62 25,5 25.5 50 50 29,5 29.5 42 42 33,5 33.5 25 25 43,5 43.5 18 18 53,5 53.5 <5 <5 61,5 61.5 <5 <5

Údaje ukazují vzestup a opětný pokles účinnosti CK-MB u nemocných se srdečním infarktem tak, jak je možno jej stanovit způsobem podle vynálezu.The data show an increase and decrease in the efficacy of CK-MB in patients with a heart attack as determined by the method of the invention.

Výroba výchozích látekProduction of starting materials

Přiklad AExample A

Výroba CK-MMProduction of CK-MM

a) 1 ,2 kg na velmi nízkou teplotu zmrazeného lidského kosterního svalu se nechá roztát při teplotě místnosti a homogenizuje. Tkáň se uvede v suspenzi ve 2,5 litrech chladného 0,05 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 (pufr s tris-(hydroxymetyl)aminometanem a kyselinou chlorovodíkovou), který obsahuje ještě 0,01 M KC1 a 1 mmol kyseliny etylendiaaintetraoctové s 1 mmolem dithioerythritu, načež se výsledná směs ještě homogenizuje v mixéru. Homogenát se míchá 45 minut za chlazení ledem a pak se odstřeluje 60 minut při 12 000 g. 2,680 litrů čirého supernatantu se podrobí frakcionaci síranem amonným při pH 8,0 v rozmezí 40 až 75 % nasycení. Sraženina při 0,75 s se smísí s 0,04 M tris-pufrem s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 a dialyzuje se proti témuž pufru. K adsorpci mioglobinu a kyselým balastnich bílkovin se užije 500 g vlhkého zásaditého iontoměniče na podkladu zesítěněho dextranu v tomtéž pufru. Po 30 minutách se iontoměnič oddělí a dvakrát se promyje 400 ml téhož pufru pokaždé s příměsí 0,02 M chloridu sodného. Filtrát a promývací kapalina se slijí a nasytí se síranem amonným na 0,75 .s.(a) 1,2 kg to the very low temperature of frozen human skeletal muscle is thawed at room temperature and homogenized. The tissue is suspended in 2.5 liters of cold 0.05 M Tris-buffered hydrochloric acid pH 8.0 (buffer with tris- (hydroxymethyl) aminomethane and hydrochloric acid), which still contains 0.01 M KCl and 1 mmol of acid. of ethylenediaaintetraacetate with 1 mmol of dithioerythritol, and the resulting mixture is then homogenized in a mixer. The homogenate is stirred for 45 minutes under ice cooling and then centrifuged at 12,000 g for 60 minutes. 2,680 liters of the clear supernatant are subjected to ammonium sulfate fractionation at pH 8.0 in the range of 40-75% saturation. The precipitate at 0.75 s is mixed with 0.04 M tris-buffered saline pH 8.0 and dialyzed against the same buffer. For adsorption of mioglobin and acid ballast proteins, 500 g of wet basic ion exchanger on a cross-linked dextran substrate in the same buffer is used. After 30 minutes, the ion exchanger was separated and washed twice with 400 ml of the same buffer each time with 0.02 M sodium chloride. The filtrate and washings were combined and saturated with ammonium sulfate for 0.75 sec.

Sraženina se oddělí odstředěním, rozpustí se ve 100 ml 0,04 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 a dialyzuje se proti témuž pufru tak dlouho, až není možno zjistit žádný síran amonný. Čirý dialyzát se nanese na sloupec zásaditého iontoměniče na podkladu zesítněného dextranu o rozměrech 6 x 60 cm v tomtéž pufru. Sloupec se vymývá tímtéž pufrem tak dlouho, až je eluát prostý bílkovin. Pak se vymývá ze sloupce enzym -0,04 U trispufrem s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8 a obsahem 0,02 M NaCl, 1 mM kyseliny etylendiamintetraoctové a 1 mM dithioerythritu. Frakce s obsahem enzymu alespoň 20 jednotek/ml se vlijí, sytí se síranem amonným na 80 % a vysrážený enzym se oddělí odstředěním. Nakonec se enzym čistí chromatografií na svrchu uvedeném systému, jen použitý sloupec má menší objem. Čištěné aktivní frakce se slijí a enzym se sráží síranem amonným o 0,8 s, načež se rozpustí v 50 ml 0,04 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 s obsahem 0,02 M NaCl, 1 mM kyseliny etylendiamintetraoctové a 1 mM dithioerythritu, zfiltruje se za sterilních podmínek a znovu se sytí síranem amonným na 80 %. Tímto způsobem se získá při 4 °C stálá enzymatická suspenze CK-MM se specifickou účinnosti 26 až 30 jednotek/mg, měřeno při použití kreatinu jako substrátu při teplotě 25 °C.The precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 100 ml of 0.04 M Tris buffer with pH 8.0 hydrochloric acid and dialyzed against the same buffer until no ammonium sulfate was detected. The clear dialysate was applied to a basic ion exchanger column on a 6 x 60 cm crosslinked dextran substrate in the same buffer. Elute the column with the same buffer until the eluate is free of protein. The column is then eluted from the column with -0.04 U Tris-buffered hydrochloric acid, pH 8, containing 0.02 M NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 1 mM dithioerythrite. Fractions with an enzyme content of at least 20 units / ml are poured, saturated with ammonium sulfate to 80% and the precipitated enzyme is collected by centrifugation. Finally, the enzyme is purified by chromatography on the above system, except that the column used is smaller in volume. The purified active fractions are combined and the enzyme is precipitated with ammonium sulphate for 0.8 s and then dissolved in 50 ml of 0.04 M trisperate with pH 8.0 hydrochloric acid containing 0.02 M NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 1 ml. mM dithioerythrite, filtered under sterile conditions and re-saturated to 80% with ammonium sulfate. In this way, a stable CK-MM enzyme suspension is obtained at 4 ° C with a specific activity of 26 to 30 units / mg, measured using creatine as a substrate at 25 ° C.

Objem: 86 ml, účinnost: 316 jednotek/ml, obsah bílkovin: 11,8 mg/ml.Volume: 86 ml, efficiency: 316 units / ml, protein content: 11.8 mg / ml.

Výtěžek 30 %, vztaženo na extrakt orgánu.Yield 30% based on organ extract.

b) Analogicky jako v příkladu Aa) se izoluje CK-MM ze svalové tkáně opice Rhesus, vepře a skotu.b) Analogously to Example Aa), CK-MM is isolated from Rhesus monkey, pig and bovine muscle tissue.

Příklad ΒExample Β

Výroba protilátky pro CK-MMProduction of antibody for CK-MM

a) CK-MM z lidského svalu se dialyzuje proti fyziologickému roztoku chloridu sodného o pH 7,0 s přísadou 0,07 M trietanolaminu jako pufru, 10 mM merkaptoetanolu a 10 mM chloridu hořečnatého. Enzymatický roztok se uvolní v ultraodstředivce a obsah bílkovin se upraví dialyzačním pufrem na 2 mg/ml. 1 ml tohoto roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného činidla, která sestává ze suspenze vody a minerálního oleje, která obsahuje jeétě 2 mg usmrcených M-tuberkulózních bakterií. Tato emulze se vstřikuje nitrosvalově kozám. Po 3 stejných injekcích v odstupu 3 týdnů a 3 dalších injekcí boosterinu vždy v odstupu 16 týdnů se odebírá 21 dnů po poslední injekci krev. Sérum 3e získá známým způsobem, směsí 3 % ovčího sérového albuminu a 0,1 % azidu sodíku v 0,1 M borátovém pufru se nastaví na pH 8,4 a zfiltruje se za sterilních podmínek. Získaný roztok, který obsahuje protilátku proti CK-MM z lidského svalu, se plní po 0,5 ml do hnědých skleněných nádobek a lyofilizuje. Protilátky mají molekulovou hmotnost 160 000 až ,80 000.a) Human muscle CK-MM is dialyzed against physiological saline pH 7.0 with the addition of 0.07 M triethanolamine buffer, 10 mM mercaptoethanol and 10 mM magnesium chloride. The enzyme solution is released in an ultra centrifuge and the protein content is adjusted to 2 mg / ml with dialysis buffer. 1 ml of this solution is emulsified with 1 ml of complete Freund's adjuvant, which consists of a suspension of water and mineral oil containing 2 mg of killed M-tuberculous bacteria. This emulsion is injected intramuscularly into goats. After 3 equal injections of 3 weeks apart and 3 additional boosterin injections of 16 weeks apart, blood is drawn 21 days after the last injection. Serum 3e is obtained in a known manner, a mixture of 3% sheep serum albumin and 0.1% sodium azide in 0.1 M borate buffer is adjusted to pH 8.4 and filtered under sterile conditions. The resulting solution containing the anti-CK-MM antibody from human muscle is filled in 0.5 ml in brown glass vials and lyophilized. The antibodies have a molecular weight of 160,000 to 80,000.

b) CK-MM, získaný podle příkladu Aa) z lidského svalu,se dialyzuje proti fyziologickému roztoku chloridu sodného o pH 6,8 s obsahem 7,5 mM N-acetylcysteinu β 25 mM octanu hořečnatého s přísadou 0,1 M imidazolu jako pufru. Pak se enzymatický roztok uvolní v ultraodstředivce a obsah bílkoviny se dialyzačním pufrem nastaví na hodnotu 0,2 mg/ml. 1 ml tohoto roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného činidla. Vzniklá emulze se vstřikuje nitrokožně skopcům. Po 3 až 6 týdnech se vstřikuje ještě druhá a třetí nitrosvalová injekce a pak se vstřikují ještě 3 injekce boosterinu vždy v odstupu 14 týdnů. 19 dní po poslední injekci se odebírá krev. Zpracování se provádí obdobným způsobem jako v příkladu Ba), čímž se získá protilátka proti CK-MM lidského svalu v lyofilizované formě. Molekulová hmotnost protilátky je 160 000 až 180 000.b) CK-MM, obtained according to Example Aa) from human muscle, is dialyzed against saline, pH 6.8, containing 7.5 mM N-acetylcysteine β 25 mM magnesium acetate with the addition of 0.1 M imidazole buffer . The enzyme solution is then released in an ultra centrifuge and the protein content is adjusted to 0.2 mg / ml with dialysis buffer. 1 ml of this solution is emulsified with 1 ml of complete Freund's excipient. The resulting emulsion is injected intravermally into the rams. After 3 to 6 weeks, a second and a third intramuscular injection are injected, and then three injections of boosterin are injected every 14 weeks. Blood is collected 19 days after the last injection. Work-up was carried out in a similar manner to Example Ba) to obtain a human muscle CK-MM antibody in lyophilized form. The molecular weight of the antibody is 160,000 to 180,000.

c) CK-MM.ze svalu opice Rhesus se dialyzuje proti fyziologickému roztoku NaCl o pH 6,8 s přísadou 0,15 M imidazolu jako pufru, 25 mM dithioerythritu a 15 mM chloridu manganatého. Po odstranění agregátu v ultraodstředivce se upraví obsah bílkovin svrchu uvedeným dialyzačním pufrem na hodnotu 5 mg/ml. 1 ml získaného roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného prostředku. Počet injekci, odběr krve a zpracování získaného materiálu se provádí obdobným způsobem jako v příkladu Ba). Tímto způsobem se získá protilátka proti CK-MM ze svalu opice Rhesus v lyofilizované formě. Sedimentační konstanta této protilátky je 7 S.c) CK-MM.Rhesus monkey muscle is dialyzed against saline NaCl pH 6.8 with addition of 0.15 M imidazole buffer, 25 mM dithioerythrite and 15 mM manganese chloride. After removal of the aggregate in the ultra centrifuge, the protein content of the above dialysis buffer is adjusted to 5 mg / ml. 1 ml of the solution obtained is emulsified with 1 ml of complete Freund's vehicle. The number of injections, blood collection and processing of the obtained material were performed in a similar manner to Example Ba). In this way, an anti-CK-MM antibody is obtained from Rhesus monkey muscle in lyophilized form. The sedimentation constant of this antibody is 7 S.

d) CK-MM ze svalu vepře se aktivuje obdobným způsobem jako v přikladu Bb) a emulze takto získaného antigenu se vstřikuje králíkům s kompletním Freundovým pomocným činidlem.d) CK-MM from swine muscle is activated in a similar manner as in Example Bb) and the emulsion of the antigen thus obtained is injected into rabbits with complete Freund's adjuvant.

Po 4 týdnech následuje další podkožní injekce antigenu. Injekce se opakuje po dalších týdnech, ,9 dní po poslední injekci se odebírá frakce. Zpracování se provádí obdobným způsobem jako v příkladu Ba). Získá se protilátka proti CK-MM ze svalu vepře v lyofilizované formě. Molekulová hmotnost takto získané protilátky je 160 000 až ,80 000.After 4 weeks, another subcutaneous injection of the antigen follows. The injection is repeated after a further week, 9 days after the last injection a fraction is collected. The work-up is carried out in a similar manner to Example Ba). An anti-CK-MM antibody is obtained from swine muscle in lyophilized form. The molecular weight of the antibody thus obtained is 160,000 to 80,000.

Zcela analogickým způsobem je možno získat ze svalu skotu protilátku proti CK-MM ze svelu Skotu s molekulovou hmotností ,60 000 až ,80 000.In an analogous manner, an anti-CK-MM antibody can be obtained from bovine muscle from bovine muscle with a molecular weight of 60,000 to 80,000.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A composition for determining the efficacy of hybrid creatine kinase MB isenzymes in the presence of creatine kinase MM in a body fluid sample, comprising 0.01 to 1.0 mg of antibodies to completely inhibit up to 2500 units per liter of MM and MB subunit in a body sample fluid.

2. The composition of claim 1, wherein the antibodies are antibodies of the type

JgC.

3. The composition of claim 1, wherein said composition comprises antibodies derived from goats

Severography. n. p. plant 7, Most