CS207462B1 - method of making the antibiotics - Google Patents

method of making the antibiotics Download PDF

Info

Publication number
CS207462B1
CS207462B1 CS425777A CS425777A CS207462B1 CS 207462 B1 CS207462 B1 CS 207462B1 CS 425777 A CS425777 A CS 425777A CS 425777 A CS425777 A CS 425777A CS 207462 B1 CS207462 B1 CS 207462B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
antibiotic
column
ethyl acetate
methanol
mixture
Prior art date
Application number
CS425777A
Other languages
English (en)
Inventor
John H E J Martin
Martin R Hertz
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of CS207462B1 publication Critical patent/CS207462B1/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby nového antibiotika fermentací, způsobu jeho izolace a koncentrace ze surových roztoků a způsobu jeho čištění. Vynález zahrnuje antibiotikum BL580A ve zředěné formě jako surový koncentrát a v čisté krystalické formě. Svými, účinky proti kokcidíose v kombinaci s chemickými a fyzikálními vlastnostmi se odlišuje od dříve popsaných antibiotik.
Antibiotikum BL580A se může vyjádřit následujícím strukturním vzorcem, ve kterém je podle přijaté konvence α-substituent za rovinou papíru a je vyjádřen---vazbou, zatímco jS-substituent je před rovinou papíru a je vyjádřen -4 vazbou.
CtYH vhodnými kationty. Soli vytvořené směsí volné kyseliny se stechiometrickým množstvím kationtů, vhodně v neutrálním rozpouštěNové antibiotikum podle vynálezu je organická karboxylové kyselina, a proto může tvořit soli s netoxickými, farmaceuticky dle, se . mohou získat s kationty jako sodným, draselným, vápenatým, hořečnatým a amonným iontem, a s kationty organického aminu jako tri (nižší alkyl) aminu (například triethylaminu, triethanolaminu), prokainu a podobně. Kationtové soli antibiotika BL580A jsou obecně krystalické látky poměrně nerozpustné ve vodě a rozpustné ve většině běžných organických rozpouštědel jako methanolu, ethylacetátu, acetonu, chloroformu, heptanu, etheru a benzenu.
Nové antibiotikum, které je označeno BL580A, se vyrobí za regulovatelných podmínek kultivací nového kmene Streptomyces hygroscopicus, který také produkuje známé antibiotikum BL580a a BL580S (v. U. S. patent č. 3 812 249). Tento nový kmen je mutantem odvozeným z S. hygroscopicus NRRL 5647 působením N-methyl-N‘-nitro-N“-nitrosoguanidinu. Životaschopná kultura nového mikroorganismu je trvale uložena ve sbírce kultur Culture Collection Laboratory, Northern Utilizatlon Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois. Je volně přístupná veřejnosti pod číslem NRRL 8180.
Způsob ' výroby antibiotika BL580A se vyznačuje tím, že se kmen Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 kultivuje po dobu 48 až 96 hodin při teplotě 25 - až 32 °C a pH v rozmezí 6 až 8 ve vodném živném prostředí obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlohydrátu, dusíku a anorganických solí za submerzních aerobních podmínek a takto získané antibiotikum se izoluje.
Kulturální, fyziologické a morfologické znaky kultury NRRL 8180 jsou v podstatě stejné jako u NRRL 5647, jak stanovil dr. H. D. Tresner- Lederle Laboratories Division, Američan Cyanamid Company, Pearl River, New York. Obecný popis mikroorganismu, založený na pozorované diagnostické charakteristice, je stejný jako u NRRL 5647, zveřejněný v U. S. patentu č. 3 812 249, ale je znovu uveden v následujícím.
Kulturální, fyziologická a morfologická pozorování kultury NRRL 8180 byla učiněna podle způsobu uvedeného Shirlingem a Gottf t liebem, Internát. Journ. of Syst. Bakteriol., 16, 313—340 (1966). Popisné barvy byly vybrány od Jacobsona et al., Color Harmony Manual, 3. vydání (1948), Container corp. of Amerika, Chicago, Illinois. Podrobný popis je uveden v tabulce 1 až 4.
Růst je dobrý na kvasničném extraktu,
Kusterevě agaru s ovesnými vločkami, agaru s tomatovým protlakem a ovesnou moučkou a agaru s bramborovou dextrosou; mírný na agaru s asparagin-dextrosou, na Hickeyově - a Tresnerově agaru, škrobovém agaru -s anorganickými solemi a Bennettově agaru; slabý na agaru s Czapkovým roztokem.
Vzdušné mycelium je bělavé až nažloutlé, šedne ve sporulačních zónách přecházejících od světlehnědé barvy (4ig) na bobrovou hněď (4 li), na popelavou - barvu (5 fe). Sporulační zóny ve starších kulturách tmavnou a stávají se hydroskopické.
Ve většině prostředí nejsou rozpustné pigmenty; nažloutlé jsou na kvasničném extraktu, Bennetově agaru a agaru s bramborovou dextrosou a pouze v nepatrném množství.
Reversibilní barva je ve většině prostředí v nažloutlých odstínech.
Při fyziologických reakcích se dusičnany 4 redukují na dusitany; nastává úplné ztekucování želatiny; na pepton-železitém agaru se netvoří melaninové pigmenty; v sedmi dnech nastává úplná peptonizace purpuro- * vého mléka; tolerance NaCl v růstovém prostředí ž 7 procent, ale < 10 procent. Využití uhlíkového zdroje podle -Pridhama a Go-ttlieba, J. BacterioL, 56, 107—114 (1948) je následující: dobré využití adonitu, -d- galaktózy, d-fruktózy, d-raffinózy, salicinu, d-xylózy a dextrózy; špatné nebo žádné využití d-melesitosy, d-melibiosy, 1-arabinosy, i-inosítu, laktosy, d-mannítu, 1-rhamnosy, sacharosy a d-trehalosy.
Vzdušné mycelium tvoří řetězce spor, které končí úzce stočenými spirálami v několika závitech; spory jsou většinou isodiametrické, válcovité, vlajkovité, 0,6 až 0,7 μηι x 0,7 až 0,8 μη. Povrch spor je hladký, jak - stanoveno elektronovou mikroskopií; obal spor jemně zvrásněn.
Na základě pozorované obecné charakteristiky je mikroorganismus NRRL 8180 Členem velké skupiny streptomycet, které jsou charakterisovány šedými sporami, spirálovitými řetězci spor, hladkým povrchem- spor a ztrátou melaninových pigmentů. Na zá- » kladě hygroskopické povahy společně s morfologickými a fyziologickými znaky je uvedená kultura typickým kmenem Streptomyces hygroscopicus, jak uvádí H. D. Tres- ь ner a E. J. Backus, „A Broadened Concept of the Characteristics of Streptomyceshygroscopicus“, Appl. MicrobioL, 4, 243—250 (1956) a H. D. Tresner, E. J. Backus a J. A. Hayes, - „Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex“, Appl. Microbiol., 15, 637 — 639 (1967).
ω о
CM tí +-» о к φ Η
'>>
•w g '>4 'tí я
tí ÍJ tí ΰ § £
Tj O ctí Tj TJ TJ Tj Q ctí S Cti
'cd Ctí 0ч 'Cti 'Ctí '(tí '(tí 'Ctí >t3 tí Λ
>N 3 ® tí G >N >N >SJ ctí g tí β
PQ
Η
Ό Φ >R
4-*
R ctí rQ tí
'>»
R
£3 £5 R< R R
O O r*
7tí тЗ в в
R в
o
Tj
tí O
R > 2 β ctí ® O tí o tí R tí 0Ό tí > o R o £>
R > g
Д oj O r-S 5
-tí 4-» ω S Λ o tí ui Φ Φ fí 0) R £3 (/)
Cti ьо > o CQ R tí
< bO <
(5 fe) na světlehnědou (4 íg). Mírná sporulace.
β
TABULKA 2
Mikromorfologie Streptomyces -hygroscopicus NRRL 8180
Prostředí Vzdušné mycelium Tvar spor Velikost Povrch
a/nebo -struktura spor spor
ispor
Kusterův agar Vzdušné mycelium. s ovesnými tvoří řetězce spor vločkami. končící úzce stoče- nými spirálami v několika závitech. Spory jsou většinou isodiametrické, válcovité, vlajkovité. 0,6 až 0,7 μη 0,7 až 0,8 jum Hladký, jak stanoveno elektronovou mikroskopií. Obal spor jemně zvrásněn.
TABULKA 3
Smíšená fyziologická reakce Streptomyces hydroscopicus NRRL 8180
Prostředí Inkubace růst fyziologická reakce (28 QC)
organický dusičnan 7 -dní dobrý dusičnany se redukují
organický - dusičnan 14 dní dobrý na dusitany dusičnany se redukují
želatina 7 dní dobrý na dusitany úplné ztekucení
pepton — železitý agar 24 až 48 hodin dobrý nevznikají m-elaninové
purpurové mléko 7 -dní pigmenty
agar s kvasníčným extraktem 10 dní dobrý dobrý úplná peptontzace NaCl tolerance
plus (4, 7, 10 a 13%) NaCl š 7 % ale < 10 %
TABULKA 4
Využití uhlíkového zdroje mikroorganismem Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180
Inkubace: 10 dní
Teplota: 28 °C uhlíkový zdroj využití -Ιadonit3 l-arabínosa0 dextran3 d-fruktosa3 i-inosit0 laktosa0 d-m-annit0 d-melesitosa1 d-meiibiosa1 d-raffinosa3
1-rham,nosa0 salicin3 sacharosa0 d-trehalosa0 d-xylosa3 dextrosa3 negativní kontrola0 + 3 = dobré využití = slušné využití = špatné využití = žádné využití tanty vyrobené z mikroorganismu NRRL 8180 různými způsoby jako X-zářením-, ultrafialovým - zářením, hořčičným- dusíkem, působením fágů a podobně.
Antibiotikum BL -580 Δ je vysoce účinné při regulaci kokcidiálních infekcí - u teplokrevných zvířat jako- hostitelů. Dále je antibiotikum BL 580. Δ nepochybně méně toxické - než antibiotikum BL 530 a (jeho struktura je uvedena v holandském patentu č. 7 402 938). Účinnost antibiotika BL 580 Δ jako anttkokcidiálního prostředku je demonstrována následujícími zkouškami in vivo, kde bylo- použito u drůbeže následující diety.
Předsměs vitamínů a aminokyseliny 0,5 % stopy minerálů 0,1. % chlorid sodný 0,3 °/o fosforečnan vápenatý 1/2 % rozmělněný vápenec 0,, % stabilizovaný tuk 4,0 -% dehydratovaná vojtěška (17% protein) ,220 % lepik-ová mouka (41% protein) 5,0 % Manhadenova rybí moučka (60% protein) 5,0 ' % spojová neodtučněná moučka (44% protein) 33,ΰ % rozemletá kukuřice, jemná do 100 %
Výše uvedená předsměs má následující složení. Množství se vztahuje na kilogram diety.
Nutno- poznamenat, že výroba antibiotika podle vynálezu není omezena uvedeným mikroorganismem nebo mikroorganismem plně odpovídajícím- růstu a mikroskopickému popisu NRRL -8180. Mohou se použít mu207462
Butyloyaný hydroxytoluen 125 mg
dl-methionin 500 mg
vitamín A 3300 I.U.
vitamín D3 1100 I. C. U.
riboflavin 4,4 mg
vitamín E 2,2 I. U.
niacin 27,5 mg
pantothenová kyselina 8,8 mg
cholinchlorid 500 img
listová kyselina 1,43 · mg
menadion hydrosíran sodný 1,1 mg
vitamín B12 11 mcg
rozemletá kukuřice, jemná do 5 g
Smíšená kokcidiální infekce Eimeria tenella a Eimeria acervulina.
Smíšené inokulum 5000 sporulovaných oocylst Eimeria aceryulina a· dostatečné množství oocyist Eimeria· tenella, které vede u .neléčených skupin k 85 až ' 100i% úmrtnosti, se dá skupinám· 7 dní starých kuřat, přímou inokulací do líhně· všech kuřat. Kuřata mají během celé zkušební doby volný přístup k dietě a vodě. · Dva dny po inokulaci se .poidá různým· skupinám· liíuiřat krmivo s lélky, tvořené dietním krmiivelm a několika koncentracemi BL 580 Δ. 10 dní po inokulaci .se zkouška ukončí. Kuřata . se váží, usmrtí a v jejich zažívacím traktu se zjišťuje· napadení.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5. Tyto výsledky ukazují, že při podání 125 ppm nebo· 250 ppm BI 580 Δ infikovaným kuřatům v dietě .přežije 100 % infikovaných kuřat. Tyto výsledky také ukazují, že při .podání 30· .ppm nebo 60 ppm BL 580 Δ infikovaným kuřatům v dietě se dosáhne významného zastavení infekce způsobené Eimeria tenella a Eimeria acervulina.
t TABULKA 5 procento kuřat se sníženým napadením· Eimeria acervulina
Koncentrace BL 580 Δ v dietě ppm počet kuřat procento přežilých Eimeria Tenella
0 60 17 0 0
250 5 100 100 100
125 5 100 100 100
60 24 91,6 46 100i
30 25 60 0 64
Smíšená kokcidiální infekce Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti a Eimeria maxima.
Kuřatům se podá při 70násobné normální imunizační dávce obchodně dostupná valkcína (Coccivac @ D, Stervin Laboratories, Opalika, Alabama), obsahující směs alespoň pěti druhů Eimeria coccidia. Vakcína se podá skupinám 7 dní starých kuřat, přímou inokulací do líhně všech kuřat. Kuřata mají během celé zkušební doby volný přístup k vodě a · výše uvedené dietě.
Dva dny po inokulací se podá . různým skupinám kuřat krmivo s léky, tvořené dietním krmivém a několika koncentracemi BL 580 Δ. 10 dní · po inokulací se zkouška ukončí a ptáci se zváží, usmrtí a v jejich zažívacím traktu se zjišťuje napadení. Výsledky této zkoušky jsou uvedeny v tabulce 6. Tyto výsledky ukazují, že při podání 120 ppm BL 580 Δ infikovaným kuřatům v dietě přežije 100 % infikovaných kuřat. Tato hladina také · ukazuje významné · zastavení infekce způsobené Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti a Eimeria maxima.
TABULKA 6
Konc. BL 580 Δ počet procento procento kuřat se sniž.
v dietě ppm kuřat přežilých napadením druhy · Eimeria tenella ' · acervulina necatrix brunetti max.
0 15 0 0 0 60 0 20
120 15 100 100 100 100 100 100
60 15 100 40 93 100 48 80
30 15 100 7 7 86 0 21
207482
Kultivace mikroorganismu Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 se může provádět v kultuře v různém kapalném prostředí. Prostředí, použitelná pro výrobu antibiotika BL 580 Δ, zahrnují asimilovatelné zdroje uhlíku jako škrob, cukr, melasu, glycerin atd.; asimilovatelné zdroje dusíku jako protein, proteinový hydrolyzát, polyjpeptidy, aminokyseliny, kukuřičný výluh atd.; a anorganické anionty a kationty jako draslík, sodík, vápník, síran, fosforečnan, chlorid atd. Stopové prvky jako bor, molybden, měď atd. jsou přiváděny s ostatními složkami prostředí jako nečistoty. Provzdušňování nádrží a nádob se zajišťuje vháněním sterilního vzduchu povrchem nebo na povrch feřmentačního prostředí. Míchání v nádržích je zajištěno mechanickým oběžným kolem. Odplyňovadlo se může případně přidat jako 1% oktadekanol ,v oleji vylisovaném ze sádla.
Inokulum Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 se připraví naočkováním 100 ml částí sterilního kapalného prostředí v 500 mllilitrových lahvích seškrabanými nebo spláchnutými sporami kultury ze šikmého agaru. Obvykle se použije následující prostředí:
sójová mouka glukóza kukuřičný výluh СаСОз voda
1,0 %
2,0 %
0,5 %
0,3 % do 100 %
Lahve se inkubují při teplotě v rozmezí 25 až 29 °C, s výhodou 28 aC a intenzívně se míchají 48 až 96 hodin na rotační třepačce.
Dvě 100 ml části tohoto inokula se použijí к naočkování 121itrů stejného sterilního prostředí ve 201itrové nádobě. Toto inokulum se inkubuje za míchání a provzdušňování sterilním vzduchem 36 až 64 hodin při teplotě 25 až 29 °C, s výhodou °C.
Toto inokulum se použije к naočkování 300 litrů stejného sterilního prostředí ve fermentační nádrži. Toto inokulum se inkubuje za míchání a provzdušňování sterilním vzduchem 36 až 64 hodin při 25 až °C, s výhodou 28 °C.
Toto Inokulum se .použije к naočkování 41)00 1 fermentační nádrže obsahující 3000 1 sterilního prostředí následujícího složení:
kukuřičný výluh 0,5 %
sojová mouka 1,0 %
kukuřičný škrob 4,0 %
СаСОз 0,1 %
voda do 100 %
dávce 4,92 litru 3785 1 od,pěňovadla jako Hodag FD 82.
Když je fermentace skončena, spojí se fermentovaná zápara obsahující antibiotikum BL 580 A asi s polovičním objemem ethylacetátu a míchá se 2 až 3 hodiny. Přidá se přibližně 8% dávka křemeliny a směs se filtruje přes rámový filtrační lis. Koláč se promyje na lisu ethylacetátem. Ehtylacetátové extrakty se shromáždí a koncentrují se na sirup.
Uvedený sirup se míchá s dvojnásobkem heptanu a skladuje se přes noc při 4 °C. Látka plovoucí na povrchu se odstraní dekantací a koncentruje se na gumovitý zbytek.
Ke gumovitému koncentrátu se ipřidá 10 1 methanolu a mrazí se několik hodin pomocí suchého ledu. Směs se filtruje fritou s vrstvou křemeliny a promyje se studeným méthanolem. Methanolový roztok se koncentruje ve vakuu do sucha.
Cihromatografická kolona se naplní aktivním uhlím při poměru asi 1 litr uhlí na 50 g vsázky. Suchý zbytek se rozpustí v methylenchloridu při poměru 40 g/1 a naplní se do kolony. Methylenchloridový eluát se shromáždí jako jedna frakce a koncentruje se do sucha. Zbytek se smíchá s methanolem a uskladní se na 15 minut na chladném místě se suchým ledem, aby se teplota snížila na —10 °C. Po 15 minutách se ztuhlý olej odfiltruje a látka rozpustná v methanolu se zahustí ve vakuu do sucha a získá se olej.
Tento olej se .rozpustí v minimálním množství methylenchloridu, smíchá se se silikagelem, zahustí se do sucha a plní se do kolony se suchým silikagelem. Kolona se vyvíjí 10% ethylacetátem v benzenu a potom 20% ethylacetátem v benzenu. Kolona se potom nechá odvodnit. Kolona se rozdělí na 10 stejných částí (.včetně náplně). Středové vzorky se odstraní při Rf 0,05, 0,15, 0,25, 0,35... atd. na délku celé kolony a eluují se vhodným objemem směsi eťhylacetát : methylenchlorid : methanol (2: :2:1). Na místech, kde překrývá antibiotikum, se provádí odebírání středových vzorků pří každé 1/8 jednotky Rf. Antibiotikum se stanoví chromatografií středových eluátů v tenké vrstvě za použití obchodně dostupných desek (Silplate-22, Brinkmann Instrument CO., Westbury, New York 11 590). Příslušející zóny byly detekovány za přítomnosti kyseliny sírové.
Z kolony se odstraní část obsahující Rf 0,11 až 0,35 a rozmíchá se ve směsi ethylacetát : methylenchlorid : methanol (2:2:1 objemově). Tato směs se filtruje, promyje další směsí rozpouštědel a zahustí se ve vakuu do sucha. Zbytek se rozpustí v t-butanolu, filtruje se a lyofilizuje se za vzniku tekuté látky.
Připraví se dvoufázový systém smícháním n-heptanu : methanolu : ethylacetátu :
:vodě v poměru 3000:1500:75:37 (objemově). Celatom (Eagle-Picher Industries, CinToto prostředí se fermentuje 100 až 200 hodin při teplotě 27 až 32 °C za míchání oběžným kolem a provzdušňování při rychlosti 0,4 až 0,8 litru vzduchu na litr prostředí za minutu. Normálně se použije pří cinnati, Ohio), obchodní značka křemeliny, se smíchá se spodní fází tohoto systému při poměru asi 800 g/600 ml spodní fáze a naplní se do· kolony (7,5 cm· v průměru). Náplň se aplikuje jako směs křemeliny, spodní fáze a lyofiiízovaného· produktu (40 g : : 30 m : 13,8 g). Naplněná kolona se vyvíjí horní fází a shromáždí se 25 ml frakce. Účinnost se detekuje chromatografií zvolených frakcí v tenké vrstvě za použití gelu, směsi chloroform : ethylacetát (1:1) jako vývojky. Frakce 90 až 150 se spojí a koncentrují a získá se antibiotikum- BL 580 Δ.
Vynález bude blíže objasněn v následujících specifických příkladech.
Příkl ad 1
Příprava inokula.
Typické prostředí použité k růstu primárního inokula se připraví podle následujícího složení:
sójová mouka glukóza kukuřičný extrakt
CaCO3 voda
1,0 g
2,0 g
0,5 g
0,3 g do 100 ml
Smyté nebo seškrábané spory Strep.tomyces hygroscopicus NRRL 8180 ze šikmého agaru se použijí k naočkování dvou 500 ml lahví, obsahujících 100 ml výše uvedeného prostředí, které bylo· sterilováno. Lahve · se umístí na rotační třepačce a intenzívně se míchají 72 hodin při 28 °C.
Výsledné inokulum se přemístí do skleněné láhve o obsahu 18,93 litru, obsahující 12 litrů stejného· sterilního prostředí. Toto sekundární inokulum se provzdušňuje sterilním vzduchem, zatímco růst pokračuje po 48 hodin při 28 °C.
Výsledné sekundární inokulum se přemístí do nádrže o obsahu 378,5 litru, obsahující 300 1 stejného sterilního prostředí. Toto terciární inokulum se provzdušňujr sterilním vzduchem při rychlosti 1 litr vzduchu/lltr prostředí/minuta a míchá · se oběžným kolem pracujícím při 173 otáčkách za minutu. Růst pokračuje 48 hodin při 28 °C. Hodnota pH je v této době 6,9 až 7,0.
P ř í k 1 a d 2
Fermentace.
Fermentační prostředí se připraví podle následujícího složení:
kukuřičný extrakt 0,5 g
sójová mouka 1,0 g
kukuřičný škrob 4,0 g
CaCO3 0,1 g
voda do 100· ml
uvedeného složení se steriluje 60 minut při 120 °C v 4000 1 nádrži. pH prostředí po sterilizaci je 6,4 až 6,5. Toto prostředí se naočkuje 300 1 terciárního inokula, připraveného jak popsáno v příkladu 1. Fermentace se provádí při · 28 až 30· °C za použití 4,0 1 Hodag FD82 jako odpěňovadla. Provzdušňování se provádí při rychlosti 0,6 litrů sterilního· vzduchu na litr zápary za minutu. Zápara se míchá oběžným kolem· při 150 otáčkách za minutu. Po 138,5 hod. fermentace je zápara zralá.
příklad 3
Izolace a čištění.
2550 litrů fermentované zápary, připravené jak popsáno· v příkladu 2, mající pH 7,4, se smíchá s 1275 litry ethylacetátu a 2 a 1/2 hod. se míchá. Přidá se 8 % hmot, křemeliny. Směs se fil^t^r^uje v několika částech za míchání přes dvojici rámových filtračních lisů. Vodno-ethylacetátový filtrát se shromáždí a získá se 3250 litrů filtrátu, který se nechá oddělit, a získá se 1000 litrů ethylaicetátového extraktu. Když se · každá část směsi zápara-ethylacetát-křemelina zfiltruje lisem, koláč na lisu se promyje ethylacetátem. Ethylacetátová promývací tekutina se spojí a po oddělení se získá 535 litrů ethylacetátové promývací tekutiny. 1000 litrů ethylacetátového extraktu a 535 litrů ethylacetátové promývací tekutiny se spojí a zahustí se v 1514 1 destilačními kotli na 225 litrů. Těchto 225 litrů se dále zahustí v · 189,25 1 desttlačním přístroji na 20 1. Těchto· 20 litrů se dále · zahustí ve skleněném destilačním přístroji na sirup.
Sirup se uskladní 48 hodin při 4°C a potom se míchá s dvojnásobkem heptanu. Směs se nechá stát přes noc při 4°C. Látka plovoucí · na povrchu se odstraní dekantací a zahustí se na gumovitý zbytek.
Ke gumovitému zbytku se přidá 10 1 metanolu a směs se několik hodin zmrazí pomocí suchého ledu. Směs se filtruje fritou s vrstvou křemeliny a promyje se studeným methanolem. Spojený filtrát a promývací tekutina se zahustí ve vakuu do sucha a získá se 1353,5 g zbytku.
1353,5 g zbytku se rozpustí v methylenchloridu při dávce 40 g/Iitr. Chro.matografická kolona se připraví naplněním· 27,07 litru zrnkového· uhlíku (20 x 40 ok). zbytek · v methylenchloridu se nechá projít touto· · kolonou při rychlosti toku 375 až 400 ml za minutu. Methylenchloridový eluáf se shromáždí jako jedna · frakce a zahustí se do sucha za vzniku· 1053 g zbytku. Zbytek se intenzívně míchá s 8 až 9 litry methanolu. Směs se nechá na chladném· místě se suchým ledem,· aby se teplota snížila na —10 °C a při této teplotě se udržuje 15 minut. Ztuhlý olej se odfiltruje a methan-olový filtrát se zahustí ve vakuu do sucha a získá se 781,4 g oleje.
30Ό0 litrů fermentačního· prostředí výše
Chromatografická kolona se · · připraví naplněním 4 kg silikagelu do plastické kolony s obvodem 12“. 200 g výše získaného· oleje se rozpustí v minimálním, množství methylenchloridu. Přidá se 300 g silikagelu a důkladně se míchá a směs se potom koncentruje ve vakuu do· sucha. Tato směs se potom · plní do kolony a · na vrcholek kolony se umístí několik zrnek mořského písku, aby se během eluce nepoškodila vrstva. Plastická kolona se umístí do skleněné podpěry. Kolona se eluuje 12 litry ΙΟθ/o ethylacetátu v benzenu. Kolona se nechá běžet za sucha a potom, se eluuje 7,6 litry 20i% ethylacetátu v benzenu. Frakce se shromáždí a kolona se nechá pracovat za sucha. Kolona se potom profoukne· dusíkem. Antibiotická účinnost se stanoví zkoušením frakcí proti Streptococcus pyogenes NY5. Kolona se rozdělí na 10 stejných částí (včetně náplně). Středové vzorky se odstraní při Rf 0,05, 0,15, 0,25, 0,35 ... atd. na délku celé kolony. Na místech, kde překrývaly pásy antibiotika, se provádí odebírání středových vzorků při každé 1/8 jednotky Rř. Každý středový vzorek se eluuje 10 ml směsí ethylacetát: methylenchlorid : methanol (2: :2:1) a zkouší se chromatografií v tenké vrstvě · za použití systému ^Ьу^се!^ : chloroform (1:1), · vytvářejícím 30 skvrn vzorku a detekcí kyselinou sí-rovou. Část kolony obsahující Rf 0,11 až 0,35 se odstraní a rozmíchá se ve směsi ^Ьу^се!^: meithylen.chtorid : 'methanol · (2:2:1). Snjěs se filtruje a promyje stejnou směsí rozpouštědel a koncentruje se ve · vakuu do sucha. Zbytek se rozpustí v t-butanolu, filtruje se a lyofilizuje za vzniku 26,7 g · látky.
Připraví se dvoufázový systém smícháním n-heptanu : methanolu : ethylacetátu : vodě v poměru 3000:1500:75:37 (objemově). 800 g křemeliny promyté kyselinou se smíchá se 600 ml spodní fáze tohoto systému a plní se do skleněné kolony o· obsahu 122,9 cm3. Náplň, obsahující 40 g křemeliny, 30 ml spodní fáze systému rozpouštědel a 13,8 · g výše uvedeného· lyofilizovaného materiálu, se aplikuje · jako směs. Naplněná kolona se vyvíjí horní fází systému a shromáždí se 25 ml frakce. Žádaná sloučenina se stanoví zkoušením vzorků frakcí, jak · výše uvedeno, chromatografií v tenké vrstvě. Frakce 90 až · 150 se spojí a lyofillzují a · získá se 2,75 g produktu · BL 580 A hlavně jako· sodné soli.
Příklad 4
Příprava a izolace BL 580 Λ jako volné kyseliny.
Dílčí sodná sůl antibiotika BL 580 A · se připraví a izoluje jak popsáno v příkladech až 3. Připraví se dvoufázový systém smícháním heptanu, methanolu, · ethylacetátu, vody v poměru 3000:1500:80:40 (objemově).
Skleněná kolona · se naplní směsí 800 g křemeliny a 600 ml spodní fáze · výše uvedeného systému. Náplň se aplikuje jako směs 28 g křemeliny, 21 ml spodní fáze a 10,9 g dílčí sodné soli BL ‘580 A. Kolona se · vyvíjí horní fází. 90 ml frakce se shromáždí. Vybrané frakce se chromatografují na Silplate F-22 za použití· směsi et·hylacetát:
: chloroform jako vývojky a detekce kyselinou sírovou, aby se zjistilo antibiotikum BL 580· A. Frakce 29 až 39, obsahující BL 580 A, se spojí a rozpouštědlo· ' se odstraní. Výsledná látka se znovu rozpustí v t-butanolu a lyofilizuje se a získá se 4,79 g látky.
800 mg této lyofnřzované látky se míchá v 300 ml dvoufázového systému tvořeného směsí voda : ether : petrolether (2:1:1). pH se upraví za míchání za použití IN HC1 · na hodnotu 2,5. Organická fáze se oddělí a 3x promyje stejným objemem vody. Extrakt se koncentruje ve vakuu za sucha. Zbytek se rozpustí v t-butanolu a potom se lyofilizuje a získá se 657 mg antibiotika BL 589 A jako volné kyseliny.
Volná kyselina antibiotika BL 580 Λ má následující mikroanalytická data: C 61,10; H 8,9; popel 0; a specifická rotace [a^5 = = +21° ± 1° (C = 0,9 v methanolu).
Volná kyselina antibiotika BL 580 Δ projevuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti spektra· při následujících vlnových délkách: 2,95, 5,88, 8,35, 8,60, 9,00, 9,12, 9,43, 9,62, 10,05 a 10,47 μ.
Standardní infračervené absorpční spektrum volné kyseliny antibiotika BL 580 Δ připravené v tabletách KBr je ukázáno na obr. 4 připojených výkresů.
Standardní spektrum protonové magnetické resonance volné kyseliny antibiotika BL 580 Δ je ukázáno na obr. 5 připojených výkresů.
Standardní spektrum protonové magnetické resonance volné kyseliny antibiotika BL 580 Δ je ukázáno na obr. 6 připojených výkresů.
P říklad 5
Příprava sodné soli BL 580 Δ.
Volná kyselina antibiotika BL 580 Δ (lg) se rozpustí ve 300 ml směsi ether-petrolether (1:1). Tento roztok se přidá ke 200 ml vody, aby se vytvořil . dvoufázový systém. pH se upraví· za míchání přídavkem 0,1 N NaOH na hodnotu 10,0, načež se organické fáze oddělí a zahustí se ve vakuu do· sucha. Zbytek se rozpustí v 10 ml etheru a přidá se 20 ml · petroletheru (30 až 70¾). Výsledný roztok se naočkuje krystalem· sodné soli antibiotika BL 580 Δ a nechá se při 4 °C pomalu odpařovat, dokud se nevytvoří krystalická látka. Krystaly · se odfiltrují, promyjí studeným petroletherem a suší na vzduchu a získá se 323 mg sodné soli antibiotika BL 580 Δ. z
Sodná · sůl antibiotika BL · 580 Δ má teplo207462 tu tání 157 až 161 °C; C 60,99; H 8,47; Na 1,95; [a]D 25 = +6° ± 1° (C = 1,153 v methanolu). Sodná sůl antibiotika BL 580 Δ projevuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti spektra při následujících vlnových délkách, 6,27, 7,28, 9,0, 9,13, 9,23, 9,48 a 10,60 μ.
Standardní infračervené absorpční spektrum sodné soli antibiotika BL 580 Δ, připravené v tabletách KBr je ukázáno na obr. 1 připojených výkresů.
Standardní spektrum 13C jaderné magnetické resonance sodné soli antibiotika BL 580 Δ je ukázáno na obr. 2 připojených výkresů.
Standardní spektrum protonové magnetické resonance sodné soli antibiotika BL 580 Δ je ukázáno na obr. 3 připojených výkresů.
№íklad 6
Příprava a izolace p-bromfenacylového esteru antibiotika BL 580 Δ.
Dílčí sodná sůl antibiotika BL 580 Δ se připraví a izoluje jak popsáno· v příkladech 1 až 3. Do baňky se umístí 1 g této· sodné soli antibiotika BL 580 Δ, 834 mg p-bromfenacylbromidu, 600 mg uhličitanu lithného a 20 ml suchého dimethylformamidu a nechá se reagovat 16 hodin při 37 °C. Přidají se 4 objemy chloroformu a získaná suspense se filtruje. Filtrát se zahustí ve vakuu, aby se odstranilo rozpouštědlo a získá se sirupovitý zbytek. Připraví se rozdělovači kolona za použití systému tvořeného směsí heptan : ethylacetát: methanol: voda v poměru 2000:25:1000:17. Pro kolonu se použije 120 g křemeliny a 90 ml spodní fá ze. Na vrcholek kolony se aplikuje sirupovitý zbytek, 12 g křemeliny a 9 ml spodní fáze. Kolona se vyvíjí horní fází. 10 mi frakce se shromáždí. Účinnost ve frakcích se stanoví chromatografií v tenké vrstvě. Frakce 22 až 41 se spojí a zahustí ve vakuu na zbytek. Zbytek se rozpustí v 50 ml methanolu a filtruje se. Filtrát se zahřívá na parní lázni, přidá se 10 ml vody a směs se nechá pomalu ochladit na 4 °C. Vzniklé krystaly se odfiltrují a získá se 566 mg antibiotika BL 580 Δ jako p-bromfenacylesteru.
p-bromfenacyleíster antibiotika BL 580 Δ má následující mikroanalytická data: C 58,80; H 7,80; Br 8,64; specifická rotace [a]o25= +63° · ± 2° (CHC13 při 0,51 %).
p-bromfenacylester antibiotika BL 580 Δ projevuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti spektra při následujících vlnových délkách: 2,95, 5,88, 6,30, 8,20, 8,45, 8,60, 9,00, 9,15 (široký), 9,37 (široký), 9,62, 10,06 a 10,37.
Molekulová váha p-bromfenacylesteru antibiotika BL 580 Δ-monohydrátu je 1114 ± ± 0,3 %, jak stanoveno ohybem rentgenových paprsků.
Standardní infračervené absorpční spektrum p-bromfenacylesteru antibiotika BL 580 Δ připraveného v tabletách KBr je· ukázáno na obr. 7 připojených výkresů.
Standardní ultrafialové absorpční spektrum p-bromfenacylesteru antibiotika BL 580 Δ připraveného při koncentraci 33,84 mcg/ml v methanolu je ukázáno na obr. 8 připojených výkresů.
Standardní protonové magnetické resonanční spektrum p-bromfenacylesteru antibiotika BL 580 Δ je ukázáno· na obr. 9 připojených výkresů.

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Způsob výroby antibiotika BL 580 Δ, vyznačený tím, že se kmen Streptomyces hygroscopicus NRLL 8180 kultivuje po dobu 48 až 96 hodin při teplotě 25 až 32 °C a pH v rozmezí 6 až 8 ve vodném živném: prostře- 9 dí, · obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlohydrátu, dusíku a anorganických solí za submersních aerobních · podmínek a takto získané antibiotikum se izoluje.
CS425777A 1976-06-30 1977-06-28 method of making the antibiotics CS207462B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70139576A 1976-06-30 1976-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS207462B1 true CS207462B1 (en) 1981-07-31

Family

ID=24817205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS425777A CS207462B1 (en) 1976-06-30 1977-06-28 method of making the antibiotics

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4138481A (cs)
BE (1) BE856314A (cs)
CS (1) CS207462B1 (cs)
SU (1) SU715034A3 (cs)
ZA (1) ZA773288B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4232006A (en) * 1977-02-09 1980-11-04 Schering Corporation Antibiotic W-10 complex, antibiotic 20561 and antibiotic 20562 as antifungal agents
US4263427A (en) * 1978-11-29 1981-04-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monensin urethane derivatives
JPS5592387A (en) * 1978-12-29 1980-07-12 Taisho Pharmaceut Co Ltd Antibiotic substance tm-531
US4294925A (en) * 1979-09-20 1981-10-13 Hoffmann-La Roche Inc. Monensin urethane derivatives produced by streptomyces
US4278663A (en) * 1980-01-30 1981-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-14868A, B, C and D
JPS577492A (en) 1980-06-13 1982-01-14 Shionogi & Co Ltd K-41 derivative
JPS5758687A (en) * 1980-09-27 1982-04-08 Taisho Pharmaceut Co Ltd Antibiotic
US5043353A (en) * 1989-10-10 1991-08-27 Eli Lilly And Company A80789 polyether antibiotic
US5242814A (en) * 1989-10-10 1993-09-07 Eli Lilly And Company Polyether antibiotic

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3595955A (en) * 1969-03-26 1971-07-27 Upjohn Co Geldanamycin and process for producing same
US3812249A (en) * 1972-11-24 1974-05-21 American Cyanamid Co Antibiotic bl580
US4024251A (en) * 1974-08-13 1977-05-17 Merck & Co., Inc. Antibiotic FR-02A and therapeutic compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US4138481A (en) 1979-02-06
ZA773288B (en) 1978-04-26
SU715034A3 (ru) 1980-02-05
BE856314A (fr) 1977-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0063456B1 (en) Pseudo-aminosugars, their production and use
US3595955A (en) Geldanamycin and process for producing same
KR900006233B1 (ko) 폴리사이클릭 에테르 항생물질의 제조방법
CS207462B1 (en) method of making the antibiotics
US4539203A (en) CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use
US4661353A (en) CL-1577-B4 compound, its production and use
CA1225333A (en) Antiviral agents
US3812249A (en) Antibiotic bl580
CA1337337C (en) Acidic polycyclic ether antibiotic having anticoccidial and growth promotant activity
CS229936B2 (en) Production method of polycyclic ehter type new acid antibiotic
US4189537A (en) Process of producing antibiotic BL580Δ with Streptomyces hygroscopicus
KR870001147B1 (ko) 19-에피-디아네마이신의 제조방법
CA1050462A (en) Antibiotic from streptomyces atcc21386
US4132779A (en) Antibiotic BL580 Zeta and use thereof as anticoccidial agent
US5064855A (en) Acid polycyclic ether antibiotic
CA1093999A (en) Antibiotic bl580.delta. from streptomyces hygrosicopieus
US4615975A (en) Purified culture of Actinomadura verrucaspora subspecies veractimyces
US5427941A (en) Actinomadura brunnea var. antibiotica strains
US4920050A (en) Acidic polycyclic ether antibiotic
KR810001709B1 (ko) 항생제 bl580△의 제조방법
US5403738A (en) Microorganism for producing polycyclic ether antibiotics
US3907643A (en) Process for producing the antibiotic U-44,590
US3734832A (en) Fermentation process for producing physostigmine
EP0553106B1 (en) Anticoccidial and growth promoting polycyclic ether antibiotic
US5183758A (en) Production of 7-chloro-3-methoxy-2&#39;-N-methyltetracycline with Actinomadura brunnea