CS206986B1 - Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů - Google Patents
Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů Download PDFInfo
- Publication number
- CS206986B1 CS206986B1 CS717379A CS717379A CS206986B1 CS 206986 B1 CS206986 B1 CS 206986B1 CS 717379 A CS717379 A CS 717379A CS 717379 A CS717379 A CS 717379A CS 206986 B1 CS206986 B1 CS 206986B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- eluent
- concentration
- ethanol
- formic acid
- preparative
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 title claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 7
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 7
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 4
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- PLFFHJWXOGYWPR-HEDMGYOXSA-N (4r)-4-[(3r,3as,5ar,5br,7as,11as,11br,13ar,13bs)-5a,5b,8,8,11a,13b-hexamethyl-1,2,3,3a,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysen-3-yl]pentan-1-ol Chemical compound C([C@]1(C)[C@H]2CC[C@H]34)CCC(C)(C)[C@@H]1CC[C@@]2(C)[C@]4(C)CC[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@@H]1[C@@H](CCCO)C PLFFHJWXOGYWPR-HEDMGYOXSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100365746 Caenorhabditis elegans sid-5 gene Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- -1 ribonucleoside diphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
(54) Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů
Vynález se týká preparátivního dělení směsí difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů připravovaných z biologického materiálu, značených radioizotopy 1^C, ^2P nebo s vysokou specifickou aktivitou.
Dosud se tyto látky zpravidla dělily metodou preparati-vní papírové chromatografie.
I když lze vhodnou kombinací rozpoustědlových soustav rozdělit i složitou směs na jednotlivé složky, má tato metoda zjevné nedostatky. Především jsou to izolační ztráty a nižší stupeň chemické čistoty sloučenin, které se dělí touto metodou. Při dnešních požadavcích na vysoké molové aktivity značených sloučenin jsou ztráty převyšující 10/ug z ekonomického hlediska nezanedbatelné. Nižší stupeň chemické čistoty preparátů připravovaných papírovou preparativní chromatografii je zapříčiněn zejména výluhy z ehromatografického papíru, což je opět rozhodující při dělení sloučenin s vysokou molovou aktivitou. Další nedostatek preparativní papírové chromatografie spadá do oblasti bezpečnosti práce s radioaktivními látkami. Manipulace s radioaktivními sloučeninami pří nanášení na chromatografické papíry, vlastní chromatografie, autoradlografie a eluce podstatně zvyšují možnost kontaminace prostředí i osob. Nutno ještě konstatovat, že preparativní papírová chromatografie je časově náročnou metodou.
Pro ilustraci uvádíme dosud používaný způsob pro separaci při výrobě ribonukleo206 986
208 880 sid-5'-trifosfátů-14C (U).
Enzymatická směs se nanese na chromatografioký papír Whatman 3 a sestupně se vyvíjí v soustavě kyselina izomáselná t voda t koncentrovaný amoniak (66 i 33 > 1,5) po dobu 20 hodin. Po skončeném dělení se papíry suší v proudu vzduchu· Identifikaoe se provede na základě souběžně prováděné chromatografie standardů. Radioaktivní trlfosfát se na papíru promyje soustavou butanol nasycený vodou, čímž se odstraní zbytek kyseliny izomáselné. Eluoe z papíru se pak provádí směsí 96 % etanol - 1,5 N amoniak (1 i 1)· Protože se obvykle nedosáhne požadované čistoty, je třeba papírovou chromatografií i několikrát opakovat, čímž vzrostou dále ztráty preparátu· Sušení papírů s nenasycenými radioaktivními preparáty má za následek vysoké riziko kontaminace pracovníků i ovzduší*
Podstata způsobu prepaprativního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů značených radioizotopy se speoiflokou aktivitou vyšší než
3,7 GBq/mmol eluční vysokotlakou kapalinovou chromatografií podle vynálezu spočívá v tom, že se směs látek vznikajících při přípravě radioaktivních difosfátů a trifosfátů deoxyribonukleosidů a ribonukleosidů dělí na sloupci porézního hydrofilního iontoměniče na bázi ethylenglykolmetakrylátového kopolymerů s diethylaminoethylovými výměnnými skupinami za použití eluentu tvořeného kyselinou mravenčí, mravenčeném amonným, ethylalkoholem a vodou, přičemž koncentrace kyseliny mravenčí v eluentu činí 0,01 M až 4,5 M, koncentraoe mravenčenu amonného 0,01 M až 1,3 M, konoentraoe ethanolu 1 až S0 % objemových, přičemž takto získané frakce eluentů, obsahujíoí nukleotidy, případně nukleosidy nebo báze se dále zbavují netěkavýoh složek eluentu na sloupci porézního hydrofilního iontoměniče na bázi ethylenglykolmethakrylátového kopolymerů s fosfátovými, kárboxylovými nebo sulfátovými skupinami za použití eluentu tvořeného ethanolem, kyselinou octovou, kyselinou mravenčí a vodou, přičemž koncentrace kyseliny v eluentu činí 0,05až5 M a konoentraoe ethanolu 1 až 80 % objemových.
Výhody nového postupu spočívají v tom, že výtěžek radioaktivního produktu je přibližně o 20 až 30 % vyšší než při dělení dosud běžným způsobem papírové ohromatografie, neboť ztráty způsobené na ionexeoh jsou ve srovnání s chromatografiokým papírem zanedbatelné· Vzhledem k tomu, že účinnost dělení a tudíž i čistota preparátů je velmi vysoká, vznikají ještě další úspory tím, že získáváme čisté další radioaktivní látky a dále tím, že použitý donor lze znovu použít·
Dělení kapalinovou ohromatografií v podstatě probíhá v kapalném prostředí v uzav řeném poloautomatizovaném systému. Odpadá autoradiografie a sušení chromátografických papírů, při niohž snadno může dojít ke kontaminaoi obsluhy radioaktivitou· Tím se podstatně zvyšuje také bezpečnost práce·
Pro objasnění je dále uveden příklad postupu izolace radioaktivního 5'guanoslntrifosfátu z reakční enzymatioké směsi, která obsahuje donor 5'adenoslntrifosfát
206 986 a v menším množství produkty rozkladu uvedených trifosfátů tj· difosfáty, monofosfáty, nukleosidy a báze· Kromě uvedených látek obsahuje výchozí směs ještě značená množství solí·
Asi 15 ml dělená směsi se vnese na kolonu 15 x 400 mm a a promývá nejprve 0,05 M mravenčeném amonným pH « 8,1 v 10 % obj· ethanolu· Po eluci nukleosidů a bází se promývá 0,1 M mravenčanem amonným pH » 7,2 a po eluol monofosfátů 0,5 M mravenčanem amonným pH » 6,3 v 30 % obj. ethanolu· Po eluci 5'adenosindifosfátu se přepne na eluent 1 M mravenčen amonný pH - 6,3 v 50 % ethanolu a tak se rozdělí zbylé komponenty výchozí směsi, tj· 5'guanosindifosfát, 5'adenosintrifosfát a 5'guanosintrifosfát.
Jednotlivé frakce rozdělené z původní směsi látek se dále odsolí na koloně 38 x 500 mm plněné katexem na bázi ethylenglykolmethakrylátového kopolymeru se sulfátovými výměnnými skupinami, promývaném roztokem 1,5 M kyseliny mravenčí v 5 % ethanolu. Odsolené frakce se odpaří do sucha na vakuové odparce, a tím se získají čisté kyseliny monomérů nukleotidů, které se pak mohou neutralizovat a uchovávat v mrazícím boxu·
Claims (1)
- Předmět vynálezuZpůsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů značenýoh radioizotopy se specifickou aktivitou vyšší než 3,7 GBq/mmol eluční vysokotlakou kapalinovou sloupcovou chromatografií, vyznačujíoí se tím, že se směs látek vznikajíoíoh při přípravě radioaktivních difosfátů a trifosfátů deoxyribonukleosidů a ribonukleosidů dělí na sloupci porézního hydrofilního iontoměniče na bázi ethylenglykolmetakrylátového kopolymeru s diethylaminoethylovými výměnnými skupinami za použití eluentu tvořeného kyselinou mravenčí, mravenčanem amonným, ethylalkoholem a vodou, přičemž koncentrace kyseliny mravenčí v eluentu činí 0,01 M až 4,5 M, koncentrace mravenčenu amonného 0,01 M až 1,3 M, koncentrace ethanolu 1 až 80 % objemových, přičemž takto získané frakce eluentů, obsahující nukleotidy, případně nukleosidy nebo báze se dále zbavují netěkavých složek eluentu na sloupci porézního hydrofilního iontoměniče na bázi ethylenglykolmetakrylátového kopolymeru s fosfátovými, karboxylovými nebo sulfátovými skupinami za použití eluentu tvořeného ethanolem, kyselinou octovou, kyselinou mravenčí a vodou, přičemž koncentraoe kyseliny v eluentu činí 0,05 až 5 M a koncentrace ethanolu 1 až 80 % objemových.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS717379A CS206986B1 (cs) | 1979-10-24 | 1979-10-24 | Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS717379A CS206986B1 (cs) | 1979-10-24 | 1979-10-24 | Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS206986B1 true CS206986B1 (cs) | 1981-07-31 |
Family
ID=5420356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS717379A CS206986B1 (cs) | 1979-10-24 | 1979-10-24 | Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS206986B1 (cs) |
-
1979
- 1979-10-24 CS CS717379A patent/CS206986B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moffatt et al. | Nucleoside Polyphosphates. VIII. 1 New and Improved Syntheses of Uridine Diphosphate Glucose and Flavin Adenine Dinucleotide Using Nucleoside-5'Phosphoramidates2 | |
| Khorana | Carbodiimides. Part V. 1 A Novel Synthesis of Adenosine Di-and Triphosphate and P1, P2-Diadenosine-5'-pyrophosphate | |
| Hurlbert | [111] Preparation of nucleoside diphosphates and triphosphates | |
| Tener et al. | Studies on Polynucleotides. II. 1 The Synthesis and Characterization of Linear and Cyclic Thymidine Oligonucleotides2 | |
| Cohn | The separation of purine and pyrimidine bases and of nucleotides by ion exchange | |
| Ponnamperuma et al. | Nucleotide synthesis under possible primitive earth conditions | |
| Bendich et al. | Fractionation of Deoxyribonucleic Acids on Columns of Anion Exchangers; Methodology1 | |
| Shelton et al. | A proton exchange between purines and water and its application to biochemistry | |
| Lohrmann et al. | Studies on Polynucleotides. LI. 1 Syntheses of the 64 Possible Ribotrinucleotides Derived from the Four Major Ribomononucleotides2 | |
| Markham et al. | The structure of ribonucleic acid. 3. The end groups, the general structure and the nature of thecore' | |
| Ralph et al. | Studies on Polynucleotides. XVIII. 1 Experiments on the Polymerization of Mononucleotides. The Synthesis and Characterization of Deoxyguanosine Oligonucleotides 2 | |
| Plunkett et al. | Metabolism of 9-β-D-arabinofuranosyladenine by mouse fibroblasts | |
| Symons | [11] Synthesis of [α-32P] ribo-and deoxyribonucleoside 5′-triphosphates | |
| Hall et al. | Nucleoside Polyphosphates. III. 1 Syntheses of Pyrimidine Nucleoside-2'(3'), 5'-diphosphates | |
| Rhaese et al. | Chemical analysis of DNA alterations: II. Alteration and liberation of bases of deoxynucleotides and deoxynucleosides induced by hydrogen peroxide and hydroxylamine | |
| Glitz | Nucleotide sequence at the 3'-linked end of bacteriophage MS2 ribonucleic acid | |
| Singhal et al. | Cation-exclusion chromatography on anion exchangers. Application to nucleic acid components and comparison with anion-exchange chromatography | |
| Drummond et al. | Deoxyribonucleoside-3′, 5′ Cyclic Phosphates. Synthesis and Acid-Catalyzed and Enzymic Hydrolysis | |
| Tener et al. | Cyclic Phosphates. II. Further Studies of Ribonucleoside 2': 3'-Cyclic Phosphates1 | |
| Okazaki | Studies of deoxyribonucleic acid synthesis and cell growth in the deoxyriboside-requiring bacteria, Lactobacillus acidophilus: III. Identification of thymidine diphosphate rhamnose | |
| Singhal | Separation and analysis of nucleic acids and their constituents by ion-exclusion and ion-exchange column chromatography | |
| Smellie et al. | Studies on the biosynthesis of deoxyribonucleic acid by extracts of mammalian cells III. Net synthesis of polynucleotides | |
| Chambers et al. | Nucleoside Polyphosphates. V. 1 Syntheses of Guanosine 5'-Di-and Triphosphates | |
| CS206986B1 (cs) | Způsob preparátivního dělení difosfátů a trifosfátů ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů | |
| Ip et al. | Separation of nucleosides and nucleotides by reversed-phase high-performance liquid chromatography with volatile buffers allowing sample recovery |