CS206950B1 - Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H - Google Patents
Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H Download PDFInfo
- Publication number
- CS206950B1 CS206950B1 CS628679A CS628679A CS206950B1 CS 206950 B1 CS206950 B1 CS 206950B1 CS 628679 A CS628679 A CS 628679A CS 628679 A CS628679 A CS 628679A CS 206950 B1 CS206950 B1 CS 206950B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- adenosine
- radioactive
- adenine
- reaction
- purine
- Prior art date
Links
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 title claims description 45
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 26
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 33
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 129
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 67
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 67
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 48
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 38
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 14
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 claims description 12
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims description 7
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 23
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 20
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 19
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 17
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 15
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 15
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 15
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Natural products O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 9
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 8
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 7
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100036286 Purine nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 6
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 6
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 6
- 108010009099 nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 4
- MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CCCCO MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- -1 1-Butanol - 1-propanol - ammonium hydroxide - water Chemical compound 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- YXJDFQJKERBOBM-AIHAYLRMSA-N [(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O YXJDFQJKERBOBM-AIHAYLRMSA-N 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 7h-purine Chemical compound C1=NC=C2NC=NC2=N1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 7h-purine;pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 2
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 2
- 108700006317 Purine-nucleoside phosphorylases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 6-chloropyridine-3,4-diamine Chemical compound NC1=CN=C(Cl)C=C1N OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001135931 Anolis Species 0.000 description 1
- 240000000491 Corchorus aestuans Species 0.000 description 1
- 235000011777 Corchorus aestuans Nutrition 0.000 description 1
- 235000010862 Corchorus capsularis Nutrition 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 108010054917 Pyrimidine Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000001853 Pyrimidine Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N alpha-D-ribose 1-phosphate Chemical group OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H
Předmětem vynálezu je způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného radioizotopem 14C nebo ^H specificky či nespecificky, využívající katalytických vlastností nepurifikovaných supernatantních frakcí homogenátů bakterií Escherichia coli B (frakce 105.000 x g). Enzymy přítomné v nepurifikovaných supernatantních frakcích katalyzují přenos ribosylové skupiny mezi radioaktivním či neradioaktivním adeninem a «6-D-ribosa-1-fosfátem, respektive radioaktivními či neradioaktivními ribonukleosidy.
Způsobem dle předmětného vynálezu lze připravit radioaktivní adenosin značený radioizotopem 14C respektive 3H specificky či nespecificky, dále provést jeho značení alternativně buci v bázi nebo ribosylovém zbytku, případně nespecificky v celé molekule; kromě toho se umožňuje kombinované značení adenosinu oběma shora uvedenými radioizotopy.
Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu dle předmětného vynálezu využívá speciíiokého složení enzymů katalyzujícího enzymového preparátu a jeho široké substrátové specificity, která dovoluje aplikovat různé donory ribosylových skupin, například radioaktivního či neradioaktivního ^-D-ribosa-1-fosfátu, guanosinu, inosinu, cytidinu či uridinu.
Při enzymové syntéze radioaktivního adenosinu způsobem dle předmětného vynálezu se neprojevuje vliv degradativních enzymů; nežádoucí adenosindeaminázová aktivita
206 950
206 9S0 v enzymových preparátech se eliminuje primárně způsobem přípravy supernatantníoh frakoí bakteriálních homogenátů, případně sekundárně parciální termickou inaktivaoí.
Reakční podmínky enzymová syntézy radioaktivního adenosinu způsobem dle předmětného vynálezu lze zvolit tak, že stupeň konverze radioaktivního adeninu na adenosin zpravidla převyšuje 90 %.
Studium biologické funkoe nukleovýoh kyselin v živých organismech, zkoumání chemické struktury těchto polymerů a cest jejich vzniku v živé buňce je stále středem zájmu řady vědních disciplin· Neocenitelnou pomocí pro všechny oblasti výzkumu nukleovýoh kyselin je aplikace jejioh základních složek značených vhodným radioizotopem·
K metodicky nejvýznamnějším složkám nukleovýoh kyselin patří nukleosidy a nukleotidy adeninu· Účinné způsoby značení těchto sloučenin radioaktivními izotopy jsou proto záležitosti vysooe aktuální a jsou trvale sledovány·
Stávající způsoby přípravy radioaktivního adenosinu vycházejí z obeoně známých metodických možností organické syntézy* a biosyntézy. Adenosin se zpravidla připravuje značený radioizotopem 1^C nebo nespecificky v celé molekule nebo specificky v purinové bázi.
Pro řešení řady specifických problémů biosyntézy nukleovýoh kyselin je však žádoucí mít k dispozici i radioaktivní a^enopin jjnačepý alternativně bu5 v purinové bázi nebo ribosylovém zbytku, a to specificky i nespecifickyj v úvahu připadá i kombinovaný způsob značení, například radioizotopem v purinové bázi a radioizotopem
O JHv ribosylu. Způsob dle předmětného vynálezu představuje universální model enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, který výše zmíněné způsoby jeho značení umožňuje*
Svou podstatou je předmětný způsob přípravy radioaktivního adenosinu specifickým případem přenosu ribosylových skupin mezi purinovou bází a purinovými čl pyrimidinovýml nukleosidy, katalyzovaného enzymy ze skupiny glykosyltraneferas.
Zatímco o existenci přímého přenosu deoxyribosylovýoh skupin mezi bázemi a deoxyribonukleosidy reakcemi transferázového typu se u některých druhů baktérií, například sp. Laotobaoillus, se nepochybuje (MoNutt, W. S., J. Bioohem. 50. 384 /1952/;
Beok, W. S. a Levin, M., J. Biol. Chem. 238. 702 /1963/) a u dalších druhů baktérií, například sp· Esoheriohia coli, se tento způsob přenosu deoxyribosylovýoh skupin alespoň předpokládá (Hoffmann, C. E., Pederation Proč. 21» 231 /1952/), nebyly pro existenci transferázového typu přenosu rlbosylovýoh skupin u bakterií dosud shromážděny přesvědčivé důkazy. Pouze Koch (Koch, A· L., J. Biol. Chem. 223. 535/1956/), který zkoumal meohanismus štěpení inosinu a guanoslnu enzymy přítomnými v nepurifikovaných bezbuněčných extraktech bakterií Escherichia ooli B v přítomnosti potenciálních inhibitorů či stimulátorů reakce (mimo jiné purinovýeh a pyrimidinovýoh bází), usoudil na přítomnost specifických núkleosldribosyltransferas zprostředkovávajících přenos ribosylových skupin mezi ribonukleosldy a bázemi. Tyto bezesporu zajímavé závěry však nejsou dokumentovány v potřebné míře experimentálními nálezy; za pozoru3
206 950 hodné však lze považovat zjištěni, že bezbuněčné bakteriální extrakty obsahují významné množství adenosindeaminázy, což znemožňuje aplikovat adenosin jako substrát.
Ve srovnání s nukleosidribosyltransferézami jsou informace o bakteriálních nukleosidfosforylázách rozsáhlé. To se týká zejména purin-nukleosidfosforylázy} o výskytu tohoto enzymu v živočišných i bakteriálních tkáních, jeho specifických katalytických vlastnostech i mechanismu jím katalyzovaných enzymových reakcí, se poznatky zveřejňují čas od času přehledně (Friedkin, M. a Kalckar, H. v The Enzymes, 2. vyd. /Boyer,
P. D., Lardy, H. a Myrback, K., editors/ sy. 5, str. 237 /1961/ - Acad. Press, New York; Parks, R. E. Jr. a Agarwal, R. P. v The Enzymes /Boyer, P. D., editor/ sv. 7, str. 483 /1972/ - Acad. Press, New York). Purin-nukleosidfosforylázy z bakterií Salmonella typhimurium a Esoherichia coli byly dokonce připraveny v krystalické formě jako elektroforetioky homogenní preparáty (Jensen, K. P. a Hygaard, P., Eur. J. Biochem. £1, 253 /1975/} Jensen, K. F., Eur. J. Biochem. 61. 377 /1976/). Tyto vysoce purifikované enzymy jsou makromolekuly o molekulové hmotnosti 138.000 + 10 % sestávající ze šesti podjednotek, přičemž jejich hexametrická forma je enzymově aktivní.
S oběma enzymy byly provedeny rozsáhlé kinetické studie reakcí mezi purinovými bázemi a nukleosidy. Soudí se, že enzymy katalyzují dva typy reakcí:
a) Purin(deoxy)ribonukleosid + orthofosfát ......1 -purin + (deoxy)ribosagjie-fosfát a
b) purin·! + puring-nukleosid :.......puring + puri^-nukleosid, přičemž purinovou složkou je adenin, guanin či hypoxanthin.
Nejen rekace typu a), ale i reakce typu b) vyžaduje přítomnost anorganického fosfátu, a to alespoň v katalytickém množství} přitom neexistují žádné okolnosti, které by mechanismus této reakce transferázového typu mohly vysvětlit jinak než na podkladě sekvenčního působení fosforolýzy a syntézy nukleosidů.
Ve většině studií zabývajících se řešením mechanismu přenosu ribosylových skupin mezi bázemi a ribonukleosidy se ovšem aplikují nukleosidfosforylázy nikoli ve formě homogenních enzymů o definované molekulové hmotnosti, ale buň ve formě nepurifikovaných bakteriálních extraktů nebo ve formě enzymových preparátů o různém stupni purifikace.
Mechanismus přenosu ribosylových skupin reakcí typu purin-purin katalytickým účinem enzymů přítomných v bezbuněčnýoh extraktech bakterií Esoherichia coli B byl modelově studován na reakci:
Adenin + inosin ---------- ......adenosin + hypoxanthin, a to v prostředí fosfátového pufru při fyziologické teplotě (Ott, J. L. a Werkman,
C. H., Arch. Biochem. Biophys. 48. 483 /1954/} Ott, J. L. a Werkman, C. H., Arch. Biochem. Biophys. 69. 264 /1957/} Ott, J. L. a Werkman, C. H., Biochem. J. 65. 609 /1957/} Ott, J. L. a Werkman, C. H., v Bioohemistry of Nitrogen, Ann. Acad. Scient. Fennicae A. II, 60. 174 /1955/). Zjistilo se, že bakterie Esoherichia coli B obsahují
206 980 purin-nukleosidfosforylázy, které jsou aktivní vůči adenosinu a inosinu, a že tyto enzymy mohou katalyzovat přenos ribosylové skupiny mezi adeninem a inosinem za tvorby <X/-D-ribosa-1-fosfátu jako meziproduktu ve dvoustupňové reakci:
a) Inosin + orthofosfát —hypoxynthin + oG-D-ribosa-1-fosfát, a
b) adenin + oó-D-riboaa-1-fosfát =^- — adenosin + orthofosfát
Bezbuněčné extrakty byly aplikovány v nepurifikované formě, bez dialýzy nebo dialýzované, v některýoh případech po parciální purifikaci nasyceným roztokem síranu amonného. K zásadním zjištěním patři poznatek, že bezbuněčné extrakty obsahují enzymový systém, který katalyzuje jednak syntézu adenosinu z adeninu a inosinu, jednak deaminaci vzniklého adenosinu na inosin. Uvádí se však pH prostředí optimální pro syntézu adenosinu (pH = 6,5), při kterém zároveň stupeň deaminaoe adenosinu je minimální. Zjišťuje se, že orthofosfát se v mechanismu shora uvedených reakcí uplatňuje již v katalytickém množství. Poukazuje se na inhibiční účin dvojmocnýoh kationtů, konstatuje se však, že přítomností fosfátových iontů se tento inhibiční účin ruší.
Obecný model mechanismu přenosu ribosylovýoh skupin typu purin-purin byl vypraoován na základě výsledků získaných aplikací vysoce purifikované purin-nukleosidfosforylázy z bakterií Aerobacter oloacea (Tazuke, Y. a Yamada, Η., Agr. Biol. Chem.
27. 625 /1963/); preparát vykazuje vysokou katalytickou aktivitu vůči adenosinu, guanosinu a inosinu a katalyzuje vzájemný přenos ribosylu mezi purinovými bázemi a nukleosidy, avšak je zcela inaktivní vůči uridinu a oytidinu.
Přenos ribosylu typu purin-pyrimidin byl detailně studován pomocí nukleosidfosforyláz izolovaných z bakterií Erwinia oarotovota a Corynebaoterium sepedonicum, které byly vybrány z širokého souboru testovaných bakteriálních kultur vykazujících nukleosidfosforylázovou aktivitu (Sakai, T., Tochikura, T. a Ogata, K., Agr. Biol.
Chem. 29. 742 (1965/; Sakai, T., Tochikura, T. a Ogata, K., Agr. Biol. Chem. 30.
245 /1966/). Aplikovány byly jednak bezbuněčné extrakty bakterií, jednak vysoce purifikované enzymy. Modelově byla studována reakce:
Hypoxanthin + uridin ...... - —...... — uraoil + inosin.
Byl učiněn závěr, že reakce probíhá ve dvou stupních:
a) Uridin + orthofosfát ag;:··· ' .....>= uráčil + có-D-ribosa-1-fosfát, a
b) hypoxanthin + Jj -D-ribosa-1-fosfát =S5=====^ inosin + orthofosfát a je katalyzována kombinovaným účinem pyrimidin-nukleoaidfosforylázy (reakce a/) a purin-nukleosidfosforylázy (reakoe b/). Reakce probíhá dobře v prostředí fosfátového pufru, je reversibllní a její rovnováha je zřetelně posunuta ve směru tvorby purlnového nukleosidu. Průběh reakoe je podmíněn přítomností orthofosfátu a optimální syntéza inosinu je závislá na pH prostředí. Jako purinové substráty mohou fungovat adenin a hypoxanthin. Bezbuněčné bakteriální extrakty obsahují výrazné
206 950 množství adenosindeaminázy; v případě, že Je akceptorem ribosylu adenin, získá se shora uvedenou reakcí směs adenosinu a inosinu. Adenosindeaminázu lze z dialyzovaných bezbuněěných extraktů bakterií Erwinia carotovora v podstatné míře odstranit srážením kyselinou octovou. Vzhledem k vysokému obsahu oytidindeaminázy v nepurifikovaných bakteriálních extraktech není oytidin jako donor ribosylu funkční.
Výčet shora uvedených informací, týkajících se možností enzymového přenosu ribosylu mezi bázemi nukleových kyselin a nůkleosidy v bakteriálních kulturách, lze shrnout následovně.
^řenos ribosylovýoh skupin mezi ribonukleosidy a volnými bázemi, včetně přenosu ribosylové skupiny z ribonukleosidů na adenin, je u bakterií často se vyskytujícím typem enzymové přeměny. Mechanismus enzymových přeměn je zevrubně prozkoumán; z četných studií vyplývá, že přenos ribosylu se uskutečňuje dvěma typy reakcí:
1) Reakcí, která se zpravidla označuje jako typ fosforylázový a která probíhá ve dvou stupních:
a) Báze^-ribosyl + orthofosfát =^= Báze-D-ribosa-1-fosfát a
b) Báze2 + <Z/-D-ribosa-1-fosfát =^==^= Báze2-ribosyl + orthofosfát
Souhrnně:
Báze^-ribosyl + Báze2 — Báze^ + Báze2-ribosyl.
2) Reakoí, kterou lze označit jako typ transferázový a která probíhá v jediném stupni:
Báze^-ribosyl + Báze2 —s.- ------- Báze^ + Báze2-ribosyl.
Prvý typ reakce je katalyzován nukleosidfosforylázami, a sice purin-nukleosidfosforylázou [e.C.2.4.2.1., Purin-nukleosid: orthofosfátribosyltransferasa^ resp. pyrimidin-nukleosidfosforylázou [e.C.2.4.2.2., Pyrimidin-nukleosid: orthofosfátribosyltransferázaj. Reakce druhého typu je katalyzována nukleosidribosyltransferázou [E.C.2.4.2.5., Nukleosids purin(pyrimidin)ribosyltransferázaj,
Specifioita katalytického účinu shora uvedených enzymů není beze zbytku vyjasněna, takže není možno s určitostí tvrdit, který reakční typ je určující, či do jaké míry se oba reakční mechanizmy uplatňují komplementárně. Zatím se většinou soudí, že převládá fosforylázový typ reakce, tedy dvoustupňový přenos ribosylové skupiny, případně se katalytická účinnost nukleosidfosforyláz rozšiřuje i na sféru reakcí transferázového typu.
Předmětný vynález uvádí nový způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu. Základem postupu je využití katalytických vlastností enzymů přítomných v supernatantních frakcích homogenátů bakterií Escherichia coli B, získaných odstředěním bakteriálních suspenzí při 105.000 x g a aplikovaných jako nepurifikovaný enzymový preparát.
206 950
Bakterie Escherichia ooli B se kultivují libovolným vhodným způsobem, nejlépe v čisté syntetickém mediu obsahujícím glukózu (Škoda J., Hess V. F. a Šorm F., Coll, Czech. Chem* Commun. 22. 1130 /1957/); živný roztok se inokuluje 2 % kultury Esoheriohia ooli B staré 24 hod., kultivace bakterií se provede stacionárně při teplotě 310 K a přeruší se v okamžiku končící exponenciální fáze růstu kultury. Bakterie se promyjí při 277 K fyziologickým roztokem a pak se suspendují v ledovém 0,05 M Tris-HCl pufru o pH 7,4. Bakteriální suspenze se homogenizují dezintegraoí ultrazvukem při 275 až 277 K Optimální doba a intenzita dezintegrace se určí s ohledem na hustotu bakteriálních suspenzí; zpravidla se bakterie získané kultivací po dobu 16 hodin suspendují ve 40 ml pufru a homogenizují ultrazvukem při výkonu dezintegrátoru 1,5 kc po dobu 70 sekund* Supernantantní frakce homogenátů, které se aplikují jako nepurifikované enzymové preparáty, se v menších porcích skladují při 253 K. Před vlastní aplikací se v enzymových preparátech zjišíuje přítomnost adenosindeaminázy. Enzymové preparáty, připravené shora uvedeným postupem, adenosindeaminázovou aktivitu zpravidla neobsahují. Případná residuál ní množství adenosindeaminázy v preparátech se odstraní její parciální termiokou denaturaoí; k tomuto účelu dostačuje několikanásobné rozmražení preparátu na laboratorní teplotu, případně preinkubaoe preparátu v prostředí 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8, při teplotě 310 K a po dobu 1 hod.
Postup přípravy radioaktivního adenosinu dle předmětného vynálezu se provádí tak, že se adenosin získá značený specificky či nespeoifioky v bázi radioizotopem ^4C respektive ^H, dále značený alternativně buž v bázi nebo ribosylu, případně značený nespeoifioky v célé molekule nebo kombinovaně oběma zmíněnými radioizotopy*
Princip enzymové syntézy radioaktivního adenosinu spočívá v ribosylaoi neradioaktivního či radioaktivního adeninu (značeného radioizotopem 14C respektive ^H speoifioky či nespecificky) katalytickým účinem enzymů přítomných v supernatantníoh frakcích homogenátů bakterií Escherichia coli B získaných odstředěním bakteriálních suspenzí při 105.000 x g, v přítomnosti donorů ribosylovýoh skupin, s výhodou oó-D-ribosa-1-fosfátu respektive neradioaktivníoh či radioaktivních ribonukleosidů (značených radioizotopy 14C respektive ^H), při reakční teplotě v rozmezí 276 až 310 K a v rozmezí vhodného pufru, s výhodou Tris-HCl pufru o pH 6,5 až 7,5.
Postup přípravy radioaktivního adenosinu dle předmětného vynálezu využívá k produkci této sloučeniny následujících hlavních kombinací akoeptorů a donorů ribosylovýoh skupin:
| Akceptor: | Donór: | Produkt: | |
| 1. | Adenin+ | •ó-D-ribosa-1-fosřát | adenin+JAdenosin |
| 2. | Adenin+ | (Purin)ribonukleosid | adenin**] Adenosin |
| 3. | Adenin*** | (Pyrimidin)ribonukleosid | adenin+J Adenosin |
| 4. | Adenin+ | (Purin)ribonukleosid+ | Adenosin** |
| 5. | Adenin+ | (Pyrimidin) ribonukleosiď* | Adenosin*** |
| 6. | Adenin | (Purin)ribonukleosid+ | íribosa+lAdenosin |
206 050
7. Adenin (Pyrimidin)ribonukleosid+ £ribosa+J Adenosin (Sloučeniny či skupiny označené jsou značené radioizotopem 1^C případně 3Hj purinovými respektive pyrimidinovými ribonukleosidy jsou guanosin, inosin, cytidin a uridin).
Přenos ribosylových skupin podle shora uvedeného principu probíhá v důsledku příznivého složení enzymového aparátu bakteriálních extraktů, aplikovaných jako nepurifikované enzymové preparáty. Je výhodné, že enzymové preparáty neobsahují adenosindeaminázu, respektive že lze tento degradativní enzym odstranit z enzymových preparátů jednoduchou termickou inaktivaoí, aniž by docházelo ke snížení enzymové aktivity enzymů, syntetizujících radioaktivní adenosin.
Má zásadní význam, že enzymové preparáty katalyzují nejen reakci typu:
Adenin + //-D-ribosa-l-fosfát ......adenosin + orthofosfát, ale zůstávají zcela funkční rovněž při přenosech ribosylu typu purin-purin a purin-pyrimidin podle předpokládaného reakčního schématu:
a) purin(pyrimidin)ribonukleosid + orthofosfát -— purin(pyrimidin) + + <Z/-D-ribosa-1-řosfát,
b) adenin + <b -D-ribosa-1-fosfát . adenosin + orthofosfát
Substrátová speoifita enzymových preparátů je dostatečně široká, což dovoluje použít v reakcích všechny základní, přirozeně se vyskytující ribonukleosidy purinového i pyrimidinového typu (adenosin, guanosin, cytidin a uridin), a rovněž některé ribonukleosidy minoritních bází (například inosin). Tato okolnost je mimořádně důležitá proto, že je možné v reakcích aplikovat výše zmíněné základní ribonukleosidy nespeoificky značené radioizotopem respektive a připravit tak radioaktivní adenosin značený radioizotopy respektive 3H hejen v bázi, ale alternativně v bázi či ribosylovém zbytku, případně nespecificky v celé molekule nebo kombinovaně oběma zmíněnými radioizotopy.
Všeohny vedlejší radioaktivní produkty shora uvedených reakcí jsou biologicky aktivní a tudíž i komerčně vysooe zajímavé sloučeniny; z reakčních směsí je lze jednoduše izolovat.
Přenos ribosylu podle shora uvedených reakcí probíhá v prostředí libovolného vhodného pufru, s výhodou 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 6,5 až 7,5.
Enzymová syntéza radioaktivního adenosinu byla sledována v širokém rozmezí reakčních teplot od 275 K do 311 K. Z časového průběhu syntézy radioaktivního adenosinu při teplotě 277 K, 293 K a 310 K, jak je dále uvedeno v příkladu, vyplývá, že enzymovou syntézu radioaktivního adenosinu dle předmětného vynálezu lze provádět při teplotě fyziologické (310 K) i laboratorní (293 K), avšak a výhodou při 277 K, kdy se dociluje vysokého stupně přeměny radioaktivního adeninu na adenosin (více než 90 %),
206 9S0 aniž dochází k fosforolýze adenoslnu.
Produkci radioaktivního .adenoslnu lze ovlivnit volbou molárního poměru adenlnu ja ko akceptoru ribosylové skupiny a cC-D-ribosa-1-fosfátu respektive ribonukleosidů jako donorů ribosylu. Při molárním poměru adenin : donor ribosylu v rozmezí od 1 t 2 do 1 i 3 je radioaktivní adenosin již dominujíoím produktem enzymové reakoe a v závislosti na množství enzymového preparátu a době reakoe se zpravidla dociluje konverze radioaktivního adeninu na adenosin vyšěí než 90 %.
Izolace radioaktivního adenoslnu, případně vedlejších reakčních produktů z reakčních směsí, se provádí po deproteinaoi inkubačníoh roztoků ohromatograficky. U látek s vysokou molovou aktivitou je výhodná papírová chromatografie v některém z následujících chromatografických systémů!
a) 1-Butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 : 5 t 7 « 2),
b) 1-butanol nasycený vodou,
c) 1-butanol - kyselina octová - voda (4 ž 1 : 5).
Způsoby přípravy radioaktivního adenoslnu, značeného radioizotopem 1^C respektive H, jsou uvedeny v příkladech, aniž je tím omezena aplikační šíře použitého prinoipu.
Příklad 1
Enzymová syntéza [adenin-1(U )jadenosinu
Směs [u-1^c]adeninu (30/xmol} molová radioaktivita 9 250 MBq.mmol“1) a uridinu (90/umol) byla rozpuštěna ve 4 ml 0,2 M Tris-HCl pufru o pH 6,5 a inkubována s 2 ml enzymového preparátu po dobu 3 hodin při 310 K. Inkubace byla ukončena zahřátím roztoku ve vroucí vodní lázni po dobu 1 až 2 minut. Reakční směs byla chromatografována na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanolu nasyceného vodou při laboratorní teplotě a v sestupném uspořádání. Autoradiografií byl detegován. Jadenin-1^C(U)Jadenosin jako hlavní reakční produkt; vedle toho byl detegován ještě nezreagovaný adenin.
Stupeň konverze radioaktivního adeninu na radioaktivní adenosin byl za shora uvedených podmínek 91,4 %· [adenin-1^C(U)J Adenosin byl z ehromatografického papíru eluován vodou a jeho identita ověřena ještě,kvalitativní papírovou chromatografii v soustavě 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 : 5 t 7 : 2) a 1-butanol - kyselina octová - voda (4 t 1 í 5); v uvedených chromatografických systémech byl preparát radioohemicky čistý. Výtěžek [adenln-1^C(U)J adenoslnu byl 79,3 %, vztaženo na celkovou radioaktivitu výchozího adeninu. Molová radioaktivita preparátu byla
250 MBq.mmol“1.
Příklad 2
Enzymová syntéza [e-1^C^adenosinu
Směs [[s-1^c[j adeninu (10/umol; molová radioaktivita 1 850 MBq.mmol1) a í6-D-ribosa-1-fosfátu (20/xmol) byla rozpuštěna ve 4 ml 0,2 M Tris-HCl pufru
206 950 o pH 6,5 a inkubována s 2 ml enzymového preparátu po dobu 1,5 hodiny při 311 K. Inkubace byla ukončena zahřátím roztoku ve vroucí vodní lázni po dobu 1 až 2 minut. Reakční směs byla chromatografována na papíře Whatman č, 3 v soustavě 1-butanolu nasyceného vodou při laboratorní teplotě a v sestupném uspořádání. Autoradiografií byl detegován pouze |adenin-14C(U)^ adenosin jako jediný reakční produkt. Radioaktivní adenosin byl z chromatografického papíru eluován vodou a jeho radiochemická čistota byla ověřena ve stejných rozpouštědlových systémech jako v předchozím případě (viz příklad 1)} preparát byl radiochemicky čistý. Výtěžek £8-14cJadenosinu byl 85,6 %, vztaženo na celkovou radioaktivitu výchozího £8-14cfjadeninu. Molové radioaktivita preparátu byla 1 850 MBq.mmol“1.
Příklad 3
Enzymová syntéza ju-14cjadenosinu
Směs £u-14cjadeninu (0,5/umolf molové radioaktivita 9 250 MBq.mmol”1) a Ju-14cJ guanosinu (1,5 /umol} molová radioaktivita 11 100 MBq.mmol. ) byla rozpuštěna v 0,3 ml 0,2 M Tris-HCl pufru o pH 7,0 a inkubována s 0,2 ml enzymového preparátu po dobu 40 minut při 310 K. Inkubace byla ukončena zahřátím roztoku ve vroucí vodní lázni po dobu 1 až 2 minut. Reakční směs byla chromatografována na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanol - kyselina octová - voda (4:1: 5). Autoradiografií a porovnáním s referenčními standardy byly detegovány [u-14cjadenosin a £u-14cjadenin a dále £u-14cjguanosin a [u-14cjguanin. Radioaktivní látky byly z ohromatografického papíru eluovány vodou a stanovena jejich celková radioaktivita. Celkově bylo získánoí?
4,5 MBq jjj-14cjadenosinu, 1,1 MBq Ju-14cJadeninu, 12,6 MBq £u-14cjguanosinu a 1,9 MBq ju-14cjguaninu. Identita £u-14C^adenosinu byla ověřena ještě kvalitativní papírovou chromatografií v soustavě 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 : 5 : 7 : 2) a 1-butanolu nasyceném vodou} v obou rozpouštědlových systémech byl preparát radiochemicky čistý. Molová radioaktivita ju-14C^adenosinu byla 9 880 MBq.mmol“1.
Příklad 4
Enzymová syntéza p3-14cjadenosinu v závislosti na reakční teplotě
Směs jjs-14cj adeninu (0,5 /umol; molová radioaktivita 1 850 MBq.mmol“1) a uridinu (1,5/umol) byla rozpuštěna v 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 6,5 a inkubována s 0,1 ml enzymového preparátu po dobu 30 hodin při reakční teplotě 277 K, 293 K respektive 310 K. Průběh inkubace byl v časových intervalech vyhodnocen radiochromatografickou analýzou. Bylo zjištěno, že při fyziologické teplotě (310 K) se dociluje optimální přeměny adeninu na adenosin již v 1 hodině reakce (92,3 % adenosinu), zatímco při laboratorní teplotě (293 K) proběhne v téže době přeměna adeninu na adenosin z 80 % a při anomálně snížené reakční teplotě (277 K) pouze z 50 %. V dalších fázích inkubace dochází při teplotě 293 K a zejména 310 K k výrazné zpětné konverzi adenosinu na adenin, za10
206 9S0 tímoo při 277 K má syntéza adenosinu po oelou dobu inkubace trvale vzestupný oharakter. Ve 30 hodině reakce je při 310 K foeforolýza adenosinu na adenin úplná, při 293 K zůstává v reakční směsi pouze 19 % radioaktivního adenosinu, zatímco při 277 K představuje radioaktivní adenosin 94 % celkové radioaktivity reakční směsi a k jeho fosforolýze nedochází·
Příklad 5
Enzymová syntéza ^2-^H, ribosa-^0(Ujedenosinu
Směs ^2-^lfjadeninu (10yumolj molová radioaktivita 740 GBq.nanol“^) a jjj-1^C^uridinu (10 /umol; molová radioaktivita 16 GBq.mmol ) byla rozpuštěna ve 2 ml 0,2 M Tris-HCl pufru o pH 6,5 a inkubována s 1,0 ml enzymového preparátu při 310 K po dobu 1,5 hodiny· Zahřátím reakční směsi ve vrouoí vodní lázni po dobu 1 až 2 minut byla reakee ukončena. Reakční směs byla chromátografována na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 s 5 : 7 í 2) při laboratorní teplotě a v sestupném uspořádání. Rechromatografie radioaktivního adenosinu byla provedena v soustavě 1-butanol - kyselina octová - voda (4 » 1 » 5). Výtěžek [2-¾. ribosa-^C(U)J adenosinu byl 43 %, radiochemioká čistota preparátu ve shora uvedených rozpouštědlovýoh soustavách a v soustavě 1-butanolu nasyceného vodou byla vyšší než 98 %.
Claims (2)
- Předmět vynálezu1. Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného radioizotopem nebo oH speoifioky či nespeoifioky, anabolickou přeměnou· radioaktivního či neradioaktivního adeninu na radioaktivní adenosin katalytiokým účinem enzymových preparátů lzolovanýoh z bakterií Escherichia coli B, v přítomnosti donorů ribosylovýoh skupin, s výhodou <Z/-D-ribosa-1-fosfátu respektive radioaktivních nebo neradioaktivních ribonukleosidů, v prostředí vhodného pufru, s výhodou Tris-HCl pufru o pH 6,5 až7,5 a při vhodné reakční teplotě, vyznačený tím, že jako katalyzujíoí enzymové preparáty se použiji nepurifikované supernatantní frakce získané odstředěním homogenátů bakterií Escherichia coli S při 105.000 x g.
- 2. Způsob dle bodu 1, vyznačený tím, že se katalytická reakce provádí při teplotě 275 až 311 K, s výhodou při teplotě 277 K.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS628679A CS206950B1 (cs) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS628679A CS206950B1 (cs) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS206950B1 true CS206950B1 (cs) | 1981-07-31 |
Family
ID=5409547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS628679A CS206950B1 (cs) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS206950B1 (cs) |
-
1979
- 1979-09-18 CS CS628679A patent/CS206950B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bloch et al. | On the mode of action of 7-deaza-adenosine (tubercidin) | |
| Tatibana et al. | Control of pyrimidine biosynthesis in mammalian tissues: V. Regulation of glutamine-dependent carbamyl phosphate synthetase: activation by 5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate and inhibition by uridine triphosphate | |
| Mikhailopulo | Biotechnology of nucleic acid constituents-State of the art and perspectives | |
| Parks Jr et al. | 16 Purine Nucleoside Phosphorylase | |
| Biswas et al. | Release of repressor control of ribonucleotide reductase by thymine starvation | |
| Zhou et al. | Synthesis of 2, 6‐dihalogenated purine nucleosides by thermostable nucleoside phosphorylases | |
| Utagawa | Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics | |
| de Verdier et al. | Alternative pathways of thymine and uracil metabolism in the liver and hepatoma | |
| Barai et al. | A universal biocatalyst for the preparation of base‐and sugar‐modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation | |
| Pasternak et al. | Alterations in pyrimidine metabolism in L5178Y leukemia cells resistant to 6-azauridine | |
| Brox et al. | Inactivation of guanosine 5'-phosphate reductase by 6-chloro-, 6-mercapto-, and 2-amino-6-mercapto-9-β-D-ribofuranosylpurine 5'-phosphates | |
| Hutchinson | New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides | |
| Cohn | The isolation and identification of desoxy-5-methylcytidylic acid from thymus nucleic acid1 | |
| Kimball et al. | Inhibitory effects of the arabinosides of 6-mercaptopurine and cytosine on purine and pyrimidine metabolism | |
| Votruba et al. | The mechanism of inhibition of DNA synthesis in Escherichia coli by pyrimidin-2-one β-d-ribofuranoside | |
| CS206950B1 (cs) | Způsob enzymové syntézy radioaktivního adenosinu, značeného specificky či nespecificky radioizotopem nebo ^H | |
| Henderson et al. | Naturally occurring acid-soluble nucleotides | |
| Reeve et al. | A method for the enzymatic synthesis and purification of [α-32 nucleoside triphosphates | |
| Firshein et al. | The biosynthesis of DNA by insects. I. The utilization of deoxycytidine by developing adults of the Cecropia silkworm | |
| Zinchenko et al. | Enzymatic synthesis of nucleoside 5′-mono and-triphosphates | |
| Kalckar | The enzymes of nucleoside metabolism | |
| Hill et al. | The purine and pyrimidine metabolism of Tetrahymena pyriformis | |
| Dulyaninova et al. | Salvage pathway for NAD biosynthesis in Brevibacterium ammoniagenes: regulatory properties of triphosphate-dependent nicotinate phosphoribosyltransferase | |
| Firshein et al. | Utilization of deoxyribonucleosides by virulent and avirulent Pneumococci | |
| Salser et al. | The mechanism of action of 6-mercaptopurine: II. Basis for specificity |