CS206060B1 - Způsob imobilizace a separace enzymů - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace a separace enzymů.

Současná mikrobiologie a biochemie umožňují získat enzymy pro různorodé reakce, významné i pro národní hospodářství. Jejich rozšíření doposud brání velká cena a malá dostupnost některých enzymů, malá tepelná odolnost a nemožnost opakovaného použití. V posledních letech jsou tyto nedostatky dílem odstraňovány použitím tzv. imobilizovaných enzymů, tj. enzymů uměle svázaných s nerozpustným nosičem. Takto upravené enzymy jsou odolnější vůči vnějším podmínkám, reakce je možné heterogenizovat, případně enzym vydělit a opakovaně použít. Přípravu ve vodě nerozpustných, imobilizovaných enzymů lze uskutečnit několika způsoby (viz Kotyk A., Horák J.: Enzymová kinetika, Academia, Praha 1977).

Jedním z nich je adsorpce na inertních nosičích, nebo iontoměničích. Tento způsob má několik nevýhod, které ho znehodnocují oproti jiným metodám imobilizace. Velké koncentrace solí i substrátu enzym desorbují a je obtížné se vyhnout úniku enzymu.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob imobilizace a separace enzymů podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se enzym adsorbuje na pevný nosič za přítomnosti 10“³ až 10“² mol l^-1 kationoidního tenzidu.

Jako kationoidního tenzidu je možné s výhodou použít N-(a-karbethoxypentadecyl)-trimethylamoniumbromid nebo cetyltrimethylamonjumbromid. .

Na enzym se působí iontovým tenzidem, který má povahu protiiontu, vznikne iontový asociát enzym-tenzid, který se adsorbuje na pevný nerozpustný nosič. Imobilizaci je možné provádět také tak/že se na pevný nosič naadsorbuje tenzid, načež se na něj působí roztokem enzymu.

Při adsorpci iontových sloučenin je rozhodující jejich náboj a povrchový náboj nosiče. Anorganické nosiče na bázi oxidu křemičitého, kyseliny křemičité, křemičitanů a aluminosilikátů jako jsou silikagel/ kaolinit a podobně, mají záporný povrchový náboj. Je-li požadována adsorpce enzymu, který při daných podmínkách existuje v roztoku ve formě aniontu, je vhodné repulsi souhlasných nábojů adsorbentu a adšorbátu odstranit přídavkem kationoidního tenzidu. Tento způsob adšorbce je velmi účinný. Při jeho aplikaci je možné použít všech běžných kationoidních tenzidů, například cetyltrimethylamoniumbromidu, N-ía-kár206060

bethoxypentadecyl)-trimethyl-amoniumbromidú (septonexj a podobně. Kombinací nosičů Fenzidů a volbou pH je možné adsorpci enzymů výrazně ovlivnit, což může mít význam pro separaci a izolaci enzymů. Výhodou způsobu podle vynálezu je jednoduchost přípravy imobilizovaných enzymů, která se může uplatnit při přípravě multienzymových systémů.

Způsob imobilizace enzymů je blíže objasněn v následujícíh příkladech.

Příklad 1 ....... ....... ~ |

Imobilizace glukosooxidasy cetyltrimethylamoniumbromidem (CTAB) na silikagel.

Glukosooxidasa je enzym katalyzující oxidaci glukosy (A).

/J-D-glukosa + O₂ ^glu*^os°^o;í^id.^asa-> D-glukono-ó-lakton + H₂O₂ (A)

Isoelektrický bod pí má hodnotu 4,3 a při pH 7 existuje enzym výlučně ve formě aniontu. Z micelárního prostředí cetyltrimethylamoniumbromidu je možné iontový asociát enzym/CTAB adsorbovat na silikagel.

Ke 4 g silikagelu bylo přidáno 20 ml roztoku enzymu (koncentrace 1,3 mg bílkoviny/ml, aktivita 201.U./mg bílkoviny), 20 ml 10² mol 1^_1 roztoku CTAB, resp. 20 ml vody. Oba vzorky byly po dobu 8 hodin promíchávány, pevná fáze oddělena centrifugo váním (0,5 hodiny při' 3000 ot. min ^!) a v čirém roztoku bylo spektrofotometricky stanoveno množství enzymu. Za přítomnosti CTAB proběhla adsorpce z 83%, ve vodném roztoků pouze ze 17 %. K enzymu, resp. iontovému asociátu enzym/tenzid adsorbovaným na silikagel bylo přidáno 600 ml vody, intenzívně hodinu mícháno a po sedimentaci byly suspenze dekanťovány. K oběma vzorkům imobilizovaných enzymů bylo přidáno 5 ml fosfátového ústoje (pH 7,30) a 10 ml roztoku glukosy' (500 mg/100 ml). Po l,5hodinovém míchání při 20 °C byly imobilizované enzymy odděleny centrifugo váním a stanovena aktivita enzymu. Oddělené imobilizované enzymy byly 15 minut promíchávány se 600 ml vody a po sedimentaci dekantovány. Po přidání fosfátového pufru a roztoku glukózy bylo možné opakovaně sledovat aktivitu imobilizovaných enzymů. Tento cyklus byl opakován 6 x. Aktivita enzymu imobilizovaného pomocí cetyltrimethylamoniumbromidu byla v průměru 11 x větší.

Příklad 2

Imobilizace katalasy cetyltrimethylamoniumbromidem na silikagel.

Katalasa je enzymem katalyzujícím rozklad peroxidu vodíku (B).

2H₂O 2 H₂O + Ó₂ (B)

Enzym se vyznačuje mimořádně vysokou aktivitou a jeho účinek není snižován přítomností cetyltrimethylamoniumbromidu.

Ke 4 g silikagelu bylo přidáno 10 ml suspenze katalasy (koncentrace 0,217 mg bílkoviny/ml, aktivita 20001.U./mg bílkoviny), 10 ml 10“² mol l^-1 CTAB, resp. 10 ml vody. Po 5 hodinách míchání byly imobilizované enzymy odděleny a dvakrát po dobu 30 minut promývány 600 ml vody. K oběma vzorkům enzymu imobilizovaných na silikagel bylo přidáno 10 ml fosfátového ústoje (pH 7,38) a 10 ml 3% H₂O₂. Při 20 °C byly vzorky 10 minut míchány a po dalších 5 minutách byl u každého vzorku odebrán 1 ml do 10 ml 4N-H₂SO₄. Nerozložený peroxid vodíku byl stanoven manganimetricky. Imobilizované enzymy promyté vodou bylo možné opakovaně použít. Enzym imobilizovaný pomocí CTAB vykazuje větší účinnost (Tab. 1).

Tabulka 1 . Aktivita katalasy imobilizované na silikagel % vyreagování H₂O₂

1. pokus 2. pokus 3. pokus

imobilizace pomocí CTAB	100	92,6	47,6
imobilizace z vodného prostředí	68,5	24,6	24,3

U tohoto enzymu se však po adsorpci zachovává pouze 1 % aktivity nativního enzymu. Nedokonalá adsorpce navíc způsobuje, že aktivita enzymu při opakovaném použití klesá (Tab. 1). Přítomnost katalasy v prodejnách vzorcích glukosooxidasy způsobuje, že stanovení aktivity enzymu pomocí analýzy peroxidu vodíku je nejisté. Po jednorázovém vymytí glukosooxidasy imobilisované prostřednictvím cetyltrimethylamoniumbromidu na silikagel (15 mg bílkoviny/4 g silikagelu) 600 ml vody se po oxidaci glukosy zvýší «Τ '

X -íj 206 060 množství uvolneňého^peroxidu vodíku 5 x. Navřženyzpůsob adsorpce pomocí ČTAB je tedy použitelný i pro dělení enzymů____________________ί _ . . . “

Adsorpce enzymů a jinýčbdátek jidmdcíAavrženéhózpůsobumůže dále sloužitkůpravě povrchu nosičů pro chromatografické separační metody, například yro afinitní chromatografii a podobně.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   L Způsob imobilizace á separace enzymů, vyznačený tím, že se enzym adsorbuje na pevný nosič za přítomnosti 10³ až 10² mol l“¹ kationoidního tenzidu.__
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený ťím/žě še jako kaTionoidní tenzíďlpbužijeNTa-karbethoxvpentadecylT7’ -trimethyíamoniumbromid. . ~,7

   ?. Způsob podle bodu l, vyznačený tím, že se jako kationoidní tenzid použije cetyltrimethylamoniumbromid.