CS203769B1

CS203769B1 - Process for ferment preparing l-lysine

Info

Publication number: CS203769B1
Application number: CS264179A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Smekal
Original assignee: Frantisek Smekal
Priority date: 1979-04-18
Filing date: 1979-04-18
Publication date: 1981-03-31

Description

. Vynález se týká způsobu fermentační přípravy L-lysinu kultivací produkčních kmenů Brevibacterium flavum na tekutých živných půdách obsahujících zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné látky a růstové faktory.. The invention relates to a process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing production strainsBrevibacterium flavum on liquid culture media containing assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrients and growth factors.

Fermentační příprava L-lysinu, aminokyseliny tvořící nezbytnou složku racionální výživy hospodářských zvířat v moderních velkochovech, pomocí různých produkčních mikroorganismů, je známá především z patentové literatury, jako hlavní zdroj asimi-lovateiného uhlíku byla popsána například glukosa (USA patent č. 1 258 380) nebo melasa (švýcarský patent č· 535 831) s použitím kmenů, které jsou dependentní na některé aminokyseliny a současně rezistentní ke specifickým analogům (například lysinunebo threontnu). Dále byla popsána fermentační příprava (USA patent č. 3 687 810) L-lysinu na bázi melasy jako hlavního zdroje uhlíku, s produkčními kmeny, které jsou rezistentní na určité koncentrace některých antibiotik (například penicilinu, bacitracinu aj.). Kombinace různých uhlíkatých zdrojů při fermentaci L-lysinu- s použitím melasy a hydrolyzátu rašeliny je rovněž známa (sovětský patent č. 496 300).The fermentative preparation of L-lysine, an amino acid constituting an essential component of rational nutrition of livestock in modern farms, using various production microorganisms, is known mainly from patent literature, for example glucose has been described as the main source of assimilatable carbon (U.S. Patent No. 1,258,380). or molasses (Swiss Patent No. 535,831) using strains that are dependent on certain amino acids and resistant to specific analogs (for example, lysine or threontine). Further, a fermentation preparation (US Patent No. 3,687,810) of molasses L-lysine as the main carbon source has been described, with production strains that are resistant to certain concentrations of certain antibiotics (e.g. penicillin, bacitracin, etc.). The combination of various carbon sources in the fermentation of L-lysine using molasses and peat hydrolyzate is also known (Soviet Patent No. 496,300).

Nejlepších výtěžků při fermentační přípravě L-l-ysinu se dosahuje při použití živných půd obsahujících jako hlavní zdroj asimilovatelného uhlíku sacharosu. Poněvadž se nověji stává sacharosa drahou a deficitní surovinou, tedy limitujícím faktorem ekonomiky biosyntetické výroby L-lysinu, objevují se stále častěji snahy nahradit tuto surovinu alespoň částečně jinými zdroji, snázeThe best yields in the fermentation preparation of L-1-ysine are obtained using nutrient media containing sucrose as the main source of assimilable carbon. As sucrose is becoming more expensive and a deficient raw material, a limiting factor in the economy of L-lysine biosynthetic production, efforts to replace this raw material at least partly by other sources are becoming more common

- dostupnými a levnějšími, a to· i za cenu nižších výtěžků fermentace.- affordable and cheaper, even at the cost of lower fermentation yields.

Uvedený úkol řeší způsob fermentační přípravy L-lysinu kultivací produkčních kmenů Brevibacterium flavum na tekutých živných půdách obsahujících zdroje asimllovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné látky a růstové faktory, podle vynálezu. Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se fermentace zahajuje na živné půdě s počátečním obsahem 10 až 18 % hmot. sacharo-sy, přičemž 40 až 50 % hmot. z tohoto množství tvoří sacharosa obsažená v melase, načež se v průběhu fermentace po dosažení hodnoty pH média 7,8 až 8,0 dávkuje do živné půdy směs melasy a 30 až 40% roztoku sacharosy v objemovém poměru 1 :1 až 1 : 2, v množství 1 až 2 % obj., vztaženo na výchozí objem půdy za současné úpravy pH půdy na hodnotu 7,0 až 7,2 přídavkem čpavkové vody, přičemž každá následující dávka směsi melasy a roztoku sacharosy se přidává k půdě vždy po poklesu koncentrace.This object is achieved by a process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing Brevibacterium flavum production strains on liquid nutrient media containing assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrients and growth factors according to the invention. The principle of this process is that the fermentation is started on a culture medium with an initial content of 10 to 18% by weight. % saccharose, wherein 40 to 50 wt. of this amount, the sucrose is present in molasses, during which a mixture of molasses and a 30 to 40% sucrose solution in a volume ratio of 1: 1 to 1: 2 is metered into the culture medium during fermentation after reaching a pH of 7.8 to 8.0; in an amount of 1 to 2% by volume, based on the initial volume of the soil while adjusting the pH of the soil to 7.0 to 7.2 by adding ammonia water, each successive dose of molasses and sucrose solution being added to the soil each time the concentration decreases.

203768 redukujících cukrů na hodnotu 3 až 5 mg/ml, a to až do ukončení produkční fáze.203768 reducing sugars to a value of 3 to 5 mg / ml until the end of the production phase.

Při provedení způsobu podle vynálezu se poměr mezi melasou a roztokem sacharosy ve směsi dávkované do ferměntačního média řídí jednak obsahem sachárosy v melase, jednak proměnlivým .obsahem balastů v této surovině, které by mohly negativně působit na produkční mikroorganismus. V závislostí na tom se také upravuje způsob dávkování této kombinace do půdy v průběhu fermentace.In the process according to the invention, the ratio between molasses and sucrose solution in the mixture fed into the fermentation medium is controlled both by the sucrose content of the molasses and by the varying content of ballasts in the raw material which could negatively affect the production microorganism. Accordingly, the method of dosing this combination into the soil during fermentation is also adjusted.

Při způsobu fermentační přípravy L-lysinu podle vynálezu se podle použitého kmene, kvality melasy* i poměru melasy k roztoku sacharosy dosahuje výtěžků L-lysinu v rozmezí 48 až 5,3 g/litr média.In the fermentation process of L-lysine according to the invention, yields of L-lysine in the range of 48-5.3 g / liter of medium are obtained, depending on the strain used, the molasses quality and the molasses to sucrose solution ratio.

Bližší podrobnosti způsobů podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují. .Further details of the methods of the invention will be apparent from the following examples, which are intended to illustrate but not limit the invention. .

Příklady provedeníExamples

Příklad 1Example 1

Produkčním kmenem Brevibacterium flavum, který vyžaduje k růstu homoserin a který je rezistentní k S-aminoethyl-L-cysiteinu, se zaočkuje 60 ml inokulačního média v 500 ml varných baňkách, jež má toto složení (g/litr):The Brevibacterium flavum production strain, which requires homoserine for growth and which is resistant to S-aminoethyl-L-cysitein, is inoculated with 60 ml of inoculum medium in 500 ml beakers having the following composition (g / liter):

glukosa 40 močovina 3 prim. fosforečnan draselný 0,5 sek. fosforečnan draselný 1,5 síran hořečnatý kryst. 0,5 pepton 15 hovězí extrakt 5 vada do 1000 ml pH po sterilizaci 7,2 až 7,5.glucose 40 urea 3 primary potassium phosphate 0.5 sec potassium phosphate 1.5 magnesium sulphate crystal. 0.5 peptone 15 beef extract 5 defect to 1000 ml pH after sterilization 7.2 to 7.5.

. Po zaočkování probíhá kultivace v baňkách při 29 °C na rotační,třepačce (240 vt./ /min.) po dobu 18 hodin. Narostlou kulturou se zaočkuje 600 ml fermentačního média v laboratorním fermentačním tanku o objemu 2 litrů. Médium má toto složení (g/litr):. After inoculation, the flasks are cultured at 29 ° C on a rotary shaker (240 rpm) for 18 hours. The grown culture was inoculated with 600 ml of fermentation medium in a 2 liter laboratory fermentation tank. The medium has the following composition (g / liter):

Wt':·' melasa 100 sacharosa 20 močovina 3 síran hořečnatý kryst. 0,2 sek. fosforečnan draselný 0,9 hydrolyzát arašídové mouky 300 ml uhličitan vápenatý mletý 30 thiamin 100/íg biotln , 50 ,ug voda vodovodní do 1000 ml pH po sterilizaci 7,0 až 7,2.Wt ': ·' molasses 100 sucrose 20 urea 3 magnesium sulphate crystals. 0.2 sec. Potassium phosphate 0.9 peanut flour hydrolyzate 300 ml calcium carbonate ground 30 thiamine 100 µg biotin, 50 µg tap water up to 1000 ml pH after sterilization 7.0 to 7.2.

Po zaočkování probíhá kultivace v tancích při 29 °C, při vzdušnění 1 objemem vzduchu, za míchání 800 ot./min· Po 18 hodinách kultivace se do fermentačního tanku dávkuje směs 60% melasy a 35% roztoku sacharosy v objemovém poměru 1 : 1, a to ve tříhodinových intervalech v. množství 10 ml/tank a současně se upravuje pH fermentačního média čpavkovou vodou na hodnotu 7,0 až 7,2. Produkce L-lysinu dosahuje 52,8 g/litr média v 96. hodině fermentace.After inoculation, the cultures are performed in tanks at 29 ° C, aerated with 1 volume of air, with stirring at 800 rpm. After 18 hours of cultivation, a mixture of 60% molasses and 35% sucrose solution in a 1: 1 volume ratio is added to the fermentation tank. at three-hour intervals in an amount of 10 ml / tank and at the same time adjusting the pH of the fermentation broth with ammonia water to a value of 7.0 to 7.2. L-lysine production reaches 52.8 g / liter of medium at 96 hours of fermentation.

. P ř í k 1 a d 2. Example 1 a d 2

Z kmene Brevibacterium flavum se analogicky jako v příkladu 1 připraví inokulum. Kultury vyrostlé v baňkách sé. použij i k přípravě očkovacího materiálu pro vlastní fermentaci. Složení očkovacího média (očkovací tank, g/10 litrů):An inoculum is prepared from a Brevibacterium flavum strain analogously to Example 1. Cultures grown in se flasks. used for preparation of seed material for fermentation. Inoculation medium composition (inoculation tank, g / 10 liters):

glukosa . 400 prim. fosforečnan draselný 5 sek. fosforečnan draselný 15 močovina ...... 30 síran hořečnatý kryst. 5 pepton 200 hovězí extrakt 50 biotin (jako 1% roztok) 50 mg voda vodovodní do 10 litrů pH po sterilizaci 7,0 'až 7,2.glucose. 400 primary potassium phosphate 5 sec. Potassium phosphate 15 urea ...... 30 magnesium sulphate cry. 5 peptone 200 bovine extract 50 biotin (as 1% solution) 50 mg tap water up to 10 liters pH after sterilization 7.0 - 7.2.

Kultivace probíhá při 29 °C, po dobu 18 hodin, při 400 ot./min. a vzdušnění 1 objemem vzduchu. Vyrostlou kulturou se v množství 10- % obj. zaočkuje 10 litrů fermentačního média ve fermentačním tanku o objemu 20 litrů; médium má toto složení (g/10 litrů)Cultivation is carried out at 29 ° C, for 18 hours, at 400 rpm. and aeration with 1 volume of air. Inoculate 10 liters of fermentation medium in a 20-liter fermentation tank at 10% by volume; medium has the following composition (g / 10 liters)

melasa molasses 1000 1000 sacharosa sucrose 200 200 močovina urea 30 30 síran hořečnatý kryst. magnesium sulfate crystals. 3 3 prim. fosforečnan draselný primary potassium phosphate 7 7 uhličitan vápenatý mletý ground calcium carbonate 300 300 hydrolyzát arašídové mouky Peanut flour hydrolyzate 3000 3000 ml . ml. biotin (jako 1% roztok) biotin (as a 1% solution) • 50 • 50 mg mg voda vodovodní tap water do 10 litrů up to 10 liters pH po sterilizaci pH after sterilization 7,2. 7.2.

Fermentace probíhá za těchto· podmínek: teplota 29 °C, míchání 470 ot./min., vzdušnění 1 objem vzduchu. Při poklesu na hodnotu 6,7 se pH upraví čpavkovou vodou na 7,0 až 7,2. V průběhu fermentace se od 24. hodiny dávkuje v tříhodinových intervalech směs 400 ml konc. melasy a 600 ml 35% roztoku sacharosy, a to v množství 200 ml/tank. Produkce L-lysinu dosahuje 48,6 až 51,4 g/ /litr média v 96. hodině fermentace.Fermentation takes place under the following conditions: temperature 29 ° C, stirring 470 rpm, aeration 1 air volume. When the pH drops to 6.7, the pH is adjusted to 7.0-7.2 with ammonia water. During fermentation, a mixture of 400 ml conc. molasses and 600 ml of 35% sucrose solution at 200 ml / tank. L-lysine production reached 48.6-51.4 g / l of medium at 96 hours of fermentation.

P ř í k 1 a d 3Example 1 a d 3

Produkční kmen Brevibacterium flavum podle příkladu 1, vystavený působení nitrosomethylmočoviny, kultivovaný podle podmínek příkladu 1, poskytl produkci lysinu 43,7 g/litr média. Při kultivaci za podmínek jako v příkladu 2 se produkce pohybovala mezi 44 až 46 g/litr média, v obou případech po .96 hodinách fermentace.The Brevibacterium flavum production strain of Example 1 exposed to nitrosomethylurea cultured under the conditions of Example 1 gave a lysine production of 43.7 g / liter of medium. When cultivated under the conditions of Example 2, production varied between 44 and 46 g / liter of medium, in both cases after 96 hours of fermentation.

Claims

SUBJECT

A process for fermentation of L-lyisin by culturing production strains of Brevibacterium glavum on liquid culture media containing assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrients and growth factors, characterized in that fermentation is initiated on culture media with an initial content of 10 to 18% by weight of sucrose, wherein 40-50% by weight of this amount is sucrose contained in molasses, during which a pH of 7.8-8.0 medium of molasses and 30-40% sucrose solution is added to the culture medium during the fermentation after reaching the pH of the medium. 1: 1 to 1: 2, in an amount of 1 to 2% by volume based on the initial soil volume, while adjusting the pH of the soil to 7.0 to 7.2 by addition of ammonia water, each successive batch of molasses and sucrose solution being adds to the soil each time the concentration of reducing sugars decreases to a value of 3 to 5 mg / ml, up to end of production phase.