CS201638B1

CS201638B1 - Method of the cultivation of microorganism bacillus subtilis and strainsbacillus subtilis ccm 2792 and ccm 2793 obtained by the said method

Info

Publication number: CS201638B1
Application number: CS752277A
Authority: CS
Inventors: Frantiska Paleckova
Original assignee: Frantiska Paleckova
Priority date: 1977-11-15
Filing date: 1977-11-15
Publication date: 1980-11-28

Description

(54) Způsob šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis a kmeny Bacillus subtilis CCM 2792 a CCM 2793 získané tímto způsobem(54) Breeding method for Bacillus subtilis and Bacillus subtilis strains CCM 2792 and CCM 2793

Vynález se týká způsobu šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis a kmenů Bacillus subtilis CCM 2792 a CCM 2793 získaných tímto způsobem. Ják je známo, produkuje jmenovaný mikroorganismus směs exoproteáz a jiných látek, jejichž .produkce je spojena s určitou etapou životního cyklu buňky. Způsob šlechtění a šlechtěním získané kmeny 'byly především orientovány na tvorbu směsi exoproteáz s vysokým obsahem neutrální proteázy, která by byla vhodná pro použití jako syřidlo při výrobě sýrů. Způsobem šlechtění podle vynálezu připravené kmeny produkují exoproteázy při kultivaci na půdách s krmnou pšeničnou moukou v kombinaci se sladinou, sušeným mlékem a kvasničným extraktem nebo sušenými kvasnicemi.The present invention relates to a method for breeding a Bacillus subtilis microorganism and Bacillus subtilis strains CCM 2792 and CCM 2793 obtained by this method. As is known, said microorganism produces a mixture of exoproteases and other substances, the production of which is associated with a particular stage of the cell life cycle. The method of breeding and the strains obtained were primarily directed to the formation of a mixture of exoproteases with a high neutral protease content, which would be suitable for use as rennet in cheese production. The strains prepared according to the invention produce exoproteases when grown on wheat flour soils in combination with wort, milk powder and yeast extract or dried yeast.

Během sporulace produkuje' mikroorganismus Bacillus subtilis směs tří proteolytických enzymů, z nichž jeden patří do skupiny metaloenzymů a druhý do skupiny serinoenzymů, třetí je esteráza. Tyto enzymy jsou uvolňovány do média od konce růstové fáze až do doby vytvoření prespor. V této době je rozdělení jejich aktivity toto: metaloproteáza má 20 % celkové proteolytické aktivity, serinoproteáza 80 % proteolytické a 15 % esterolytické aktivity a esteráza 85 % esterolytické aktivity (J. Millet, J. Appl. Bact. 33, 207, 1970). U mutant blokovaných v počátečných stádiích sporulace je poměr jednotlivých enzymů různý. Tímto zjištěním a sledováním požadavku na složení mikrobiálního syřidla (ve kterém je žádoucí převaha enzymu aktivního v neutrálním prostředí) bylo vedeno šlechtění a selekce mikroorganismu Bacillus subtilis způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na kulturu mikroorganismu působí N-methyl-N-nitro-N’-nitrosoguanidinem ve vodném roztoku s hodnotou pH 8,0, v koncentraci 7 rnM, po dobu 30 minut, načež se vzniklé mutanty dále nejméně dvakrát selektují na masopeptonovém agaru a získaný stabilní kmen schopný sporulace, produkující směs exoproteáz s maximálním obsahem neutrální proteázy a s vysokou sýřivou aktivitou produkovaných exoproteáz, vyjádřenou jednotkami SRN (Srinivasan), se izoluje.During sporulation, the Bacillus subtilis microorganism produces a mixture of three proteolytic enzymes, one of which belongs to the metalloenzyme group and the other to the serinoenzyme group, the third is an esterase. These enzymes are released into the medium from the end of the growth phase until the formation of the promoters. At this time, the distribution of their activity is as follows: metalloprotease has 20% total proteolytic activity, serinoprotease 80% proteolytic and 15% esterolytic activity and esterase 85% esterolytic activity (J. Millet, J. Appl. Bact. 33, 207, 1970). For mutants blocked in the early stages of sporulation, the ratio of individual enzymes varies. This finding and monitoring of the microbial rennet composition requirement (in which the predominance of the neutral active enzyme is desired) led to breeding and selection of the Bacillus subtilis microorganism according to the method of the invention, which consists in treating the microorganism with N-methyl-N -nitro-N'-nitrosoguanidine in an aqueous solution at pH 8.0 at 7 rnM for 30 minutes, after which the resulting mutants are further selected at least twice on masopepton agar and the obtained stable sporulable strain producing a mixture of exoproteases with a maximum with a neutral protease content and a high cheese-like activity of the exoproteases produced, expressed in units of Germany (Srinivasan), is isolated.

Způsob podle vynálezu je charakterizován použitím vícenásobné selekce při sledování dvou a více znaků, přičemž v každém stupni je brán zřetel na dva z nich. Pro získání kmenů se specifickými vlastnostmi producentů exoproteáz se šlechtění řídí těmito kritérii:The method of the invention is characterized by using multiple selection while monitoring two or more features, with two of them being considered in each step. In order to obtain strains with specific characteristics of exoprotease producers, breeding shall be subject to the following criteria:

a) schopností produkovat směs exoproteáz s maximálním obsahem neutrální proteázy.(a) ability to produce a mixture of exoproteases with a maximum neutral protease content.

b) schopností sporulace,(b) ability to sporulate;

c) množstvím produkovaných exoproteáz, hodnocených podle sýřivé aktivity.(c) the amount of exoproteases produced, evaluated according to cheese-making activity.

Principem způsobu šlechtění podle vynálezu je aplikace mutagenu a následující vícestupňová selekce. Jako mutagenů je možno používat z chemických činidel zejména nitroso- a thiosloučeniny, charakterizované methylační nebo ethylaůní aktivitou, z fyzikálních činidel pak ultrafialové záření nebo gama-paprsky. U kmene Bacillus subtilis se výhodně osvědčil N-methyl-N-nitro-N’-nitrosoguanidin, který se aplikuje na suspenzi spor, popřípiadě buněk u nesporulujících kmenů. Roztok mutagenu se připravuje v trismaleátovém pufru s hodnotou pH 8,0 o koncentraci 7 mM. Po 30 minutách působení mutagenu přežívá asi 60 % spor.The principle of the breeding method according to the invention is the application of the mutagen and the subsequent multistage selection. As mutagens, it is possible to use, in particular, nitroso- and thio compounds characterized by methylation or ethylane activity from chemical agents, and ultraviolet radiation or gamma rays from physical agents. In the Bacillus subtilis strain, N-methyl-N-nitro-N ' -nitrosoguanidine has proven to be advantageous and is applied to the spore suspension or cells in non-sporulating strains. The mutagen solution is prepared in 7 mM trismalate buffer, pH 8.0. About 30% of the spores survive after 30 minutes of mutagen treatment.

Z pokusu se vybírá nej variabilnější izolát z hlediska variability výše uvedených znaků. Tento v podstatě „výchozí“ kmen se dále selektuje, přičemž nový izolát se vybírá podle dvou ze tří uvedených kritérií. Selekce se opakuje tak dlouho, až se získá stabilní kmen se žádanými znaky. Tím, že se v každém stupni selekce vybírá podle dvou znaků, a to nikoli vždy podle stejných, ale podle kombinace dvou ze tří, získá se po relativně kratší době stabilní kmen se všemi třemi žádanými znaky·The most variable isolate in terms of variability of the above features is selected from the experiment. This substantially "parent" strain is further selected, wherein the new isolate is selected according to two of the three criteria. The selection is repeated until a stable strain with the desired traits is obtained. By selecting at each stage of the selection according to two features, not always the same, but a combination of two out of three, a stable strain with all three desired features is obtained after a relatively shorter time ·

Mateřský kmen Bacillus subtilis, izolovaný z přírodních zdrojů (uložený ve sbírce LAKTOFLORA), představoval při růstu na masopeptonovém agaru populace různých morfologických typů: drsné kolonie s ostrým okrajem; hladké kolonie s laločnatým okrajem; hladké matné kolonie s rovným okrajem. Produkce na půdě s pšeničnou moukou je 1900 SRN (jednotky sýřivé aktivity podle Srinivasana), ve směsi je 30 % neutrální proteázy, kmen sporuluje.The parent strain of Bacillus subtilis, isolated from natural sources (deposited in the collection of Lactoflora), represented populations of different morphological types when grown on masopepton agar: rough, sharp-edged colonies; smooth colonies with lobed edges; smooth matt colonies with a straight edge. The production on wheat flour soil is 1900 FR (Srinivasan cheese-making units), 30% neutral protease in the mixture, the strain sporulates.

Selekcí získané mutanty Bacillus subtilis byly uloženy v Čs. sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně, tř. Obránců míru 10, pod čísly CCM 2792 a CCM 2793. Mutanta označená CCM 2792 tvoří při růstu na masopeptonovém agaru hladké matné kolonie. Produkce exoproteáz na půdě s pšeničnou moukou je 3500 až 4000 SRN, ve směsi je 70 až 80 % neutrální proteázy, kmen sporuluje. Mutanta označená CCM 2793 se od předešlé mutanty morfologicky neliší, na půdě s pšeničnou moukou produkuje 3800 až 4300 SRN, ve směsi je 70 až 85 % neutrální proteázy. U kmene je snížena schopnost sporulace (oligosporogenní kmen).Bacillus subtilis mutants obtained by selection were deposited in Cs. collection of microorganisms of the University of J. E. Purkyně in Brno, tř. Defender of Peace 10, under CCM 2792 and CCM 2793. The mutant designated CCM 2792 forms smooth matt colonies when grown on Masopepton agar. The production of exoproteases on wheat flour broth is 3500 to 4000 FR, 70 to 80% neutral protease in the mixture, the strain sporulates. The mutant designated CCM 2793 does not differ morphologically from the previous mutant; it produces 3800 to 4300 FRG on wheat flour, and 70 to 85% neutral protease in the mixture. The strain of sporulation (oligosporogenic strain) is reduced in the strain.

Jak je na první pohled patrno při srovnání s výchozím kmenem bylo dosaženo způsobem šlechtění podle vynálezu u nových kmenů Bacillus subtilis CCM 2792 a CCM 2793 nejméně dvojnásobného zvýšení obsahu neutrální proteázy a sýřivé aktivity.As can be seen at first glance when compared to the parent strain, the breeding method of the present invention achieved at least a two-fold increase in neutral protease content and rennet activity in the new Bacillus subtilis strains CCM 2792 and CCM 2793.

Claims

SUBJECT

Method for breeding a microorganism of Bacillus subtilis, characterized in that the culture of the microorganism is treated with N-methyl-NS. The ability of the strains obtained to produce increased amounts of exoproteases is preferably applied on soils with wheat flour as a carbon source at 8-3% wt. both under laboratory (reciprocating shaker, 96 rpm, 9 cm swing) as well as operating conditions on the same soils at 37 ° C, as explained in more detail in the following examples.

Example 1

A culture of Bacillus subtilis strain CCM 2792 or 2793 grown on sloping masopepton agar at 37 ° C after a 4 to 5 day cultivation and then stored in a refrigerator at 5 ° C was seeded with a loop of 80 ml of production soil placed in 750 ml Erlenmayer flasks. having the following composition (in% by weight):

feed wheat flour 8.0 concentrated wort 5.2 skimmed milk powder 1.25 yeast extract or dried yeast 0.6 water to 100.0 pH after sterilization (not adjusted) is around 6.0. Sterilization is carried out at 120 ° C for 30 minutes. The milk powder is sterilized separately as a 10% aqueous solution at 120 ° C for 20 minutes and added to sterile soil. Cultivate on a reciprocating shaker (96 rpm). Samples to determine cheesing activity are taken after 24 hours. The maximum values are usually reached at 72 o'clock, they do not change substantially. This procedure results in the production of exoproteases in B. subtilis strain CCM 2793 with an average cheese activity of 4,000 SRN and 75% neutral protease, and in B. subtilis strain CNM 2792 an activity of 3,800 SRN with 70% neutral protease.

Example 2

Maintaining cultures of the same microorganisms as in Example 1 and seeding the productive soil is the same as in that example. The production soil has the following composition (in% by weight):

feed wheat flour 3.0 thickened wort 5.2 skimmed milk powder 2.0 yeast extract or dried yeast 0.3 water up to 100.0 pH not adjusted, after sterilization it is around 6. Sterilization and soil preparation, inoculation and cultivation are as in Example 1, as well as the determination of the cheesing activity. The maximum production of exoproteases is B. subtilis CCM 2793 4200 SRN with 80% neutral protease, in B. subtilis CCM 2792 4000 SRN with 75% neutral protease.

nitro-N'-nitrosoguanidine in an aqueous solution of pH 8.0, 7 mM, for 30 minutes, after which the resulting mutants are further selected at least twice on masopeptane agar and the obtained stable sporulable strain producing a mixture of exoproteases with a maximum with a neutral protease content and a high cheese-like activity of the exoproteases produced, expressed in units of Germany, is isolated.

2. Bacillus subtilis strain CCM 2792 obtained by the method of 1.

3. The Bacillus subtilis strain CCM 2793 obtained by the method of 1.