CS198055B1 - způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek - Google Patents
způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek Download PDFInfo
- Publication number
- CS198055B1 CS198055B1 CS502677A CS502677A CS198055B1 CS 198055 B1 CS198055 B1 CS 198055B1 CS 502677 A CS502677 A CS 502677A CS 502677 A CS502677 A CS 502677A CS 198055 B1 CS198055 B1 CS 198055B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- viruses
- cell
- determination
- medium
- cells
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 206010034038 Parotitis Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek.Řeší zjednodušeni metodiky v připadechzkdy je zapotřebí prodloužené inkubace pokusných kultur.
Pomnoženi /nebo inhibice pomnoženi / virového inokula v buněčné kultuře je základem diagnostických postupů pro izolaci infekčního agens,pro kvantitaci infekční aktivity ve vzorcích virové tekutiny /ΤΚίΡ^θ / i inhibični aktivity např.virusneutra lizačn1ch proti látek.
Při obecně známém postupu se k testu uživá narostlých buněčných kultur.Po výměně více méně vyčerpaného kultivačného media se aplikuje vyšetřované inokul um a v průběhu dalši inkubace se sledují změny v* kuItuřezkteré jsou indikátorem pomnoženi viru.Při malém počtu inoku lovaných infekčních částic nebo u virů s pomalejší reprodukci je zapotřebí protrahované inkubačni dobyzběhěm niž je nutno vyměňovat medium v kulturách až 2krát týdně/viz na př. Mayr A. et al.zVirologische Arbeitsmethoden,sv.Iz VEB G. Fischer,Jena 1974 /.
Jsou známa také některá zjednodušeni diagnostického postupu,která se s výhodou uplatni zvláště při sériových výšetřovánich.Při inokulaci vzorků na narostlé kultury bylo např.popsáno užiti media s galaktosou a pyruvátem,umožňujici nejméně 10 až 12 denní inkubaci kultur bez výměny media /Izbický A.,Zprávy SEVAC 3Z81-89Z1974 /. Jinou modifikaci
198 055
198 0SS je Inokulace testovaného materiálu přímo do suspense buněk,určených ke kultivaci v běžném růstovém mediu.Odpadá tak samostatné pracovní fáze nasazováni ku ltury,nehledě k tomu,že tento způsob aplikace je pro pomnožovénl řady virů zvláStě vhodný/Mayr A.et al., V1rolog1sche Arbeitsmethoden,Sv.l,VEB G.Fischer Jana 1974/.Ve srovnáni se známými modifikacemi přlnéSI nová řeSenl dalS1 sníženi pracnosti a nákladů.
Podstatou vynálezu je spojeni Inokulace buněk pro nárůst kultury a Inokulace testovaného materiálu do jedná operace a to v mediu,v němž. je glukosa nahražena příměsi galaktózy a pyruvátu.Postup slučuje výhody menS1 pracnosti postupu a prodlouženého udržováni kultur bez výměny media.
V novám řeSenl se využívá poznatku,že médium s galaktózou a pyruvátem/bez glukózy/ je vhodná jak krůstu,tak 1 prodlouženému udržováni buněčných kultur.Dobré růstová vlastnosti galaktózy byly zjištěny při pomnožovénl řady druhů buněk/WilImerE.N.edlt.,CelIs and tlssues 1n culture,vol.I,Academle Press,London-N-York,1965/,včetně lidských d1plo1dn1ch buněk UI-38 /Sloním Ď.,J.B1ol.Stand.,2,51-58,1974,Baugh C.L.,L1fe Science,6,371-380,1967/. Taká pyruvát stimuloval růst některých buněčných Iini1/Uillmer E.N.edit.Cells and tlssues, vol.I,Academie Press,London-N.York,1965/ 1 lidských d1plo1dn1ch buněk /Sloním D.,J.B1ol. Stand.,2,51-58,1974/.Při studiu kultivace lidských dlploldnlch buněk/Slonim D„,J.Biol. Stand.,2,51-58,1974/ a buněk linie VĚRO /Izblcký A.,Čs.Epidem. 26,1,9-14,1977/ byl v modifikovaném Eaglově minimálním esenciálním mádlu s galaktózou / 1 g/litr/ a pyruvátem /0,5 g/l1tr/ zjiStěn vySS1 pomnožovael efekt,než v mádlu s glukólou.Současně v mádlu s galaktózou nebo pyruvátem 1 v mádlu s příměsi obou látek docházelo v průběhu kultivace lidských dlploldnlch buněk/Slonim D.,J.B1ol.Stand., 2,51-58,1974/ a buněk Unie Věro /Izblcký A.,Čs.Ep1dem. 26,1,9-14,1977/ jen k pomalému poklesu pH a bylo v něm možná kultury protrahovaně inkubovat bez výměny média /Izblcký A.,Zprávy SEVAC,č.3,81-89,1974/. Podle výsledků naS1 laboratoře má modifikovaná Eaglovo minimální esenciální médium s galaktózou a pyruvátem vhodná vlastnosti 1 např. pro prodloužené/sledováno po dobu 3 týdnů/ udržováni narostlých primárních kultur buněk psftSh /beagle/ ledvin i pro jejich růst.
Je zřejmá,že se médium s galaktózou a pyruvátem může uplatnit při kultivaci mnoha typů buněk primárních,dlploldnlch 1 heteroploldnlch buněčných linii a při jejich Širokém diagnostickém využiti.Jen lidská dlploldnl buňky samy o sobě mohou sloužit k diagnostice např. viru zarděnek,var1cella-zoster,RSV,herpesviru,cýtomegalov1ru a entarovirů/Lenette E.H.,Schm1dt N.J. et al.,Laboratorní vySetřovad metody virových a rickettsiálnlch nákaz, Avlcenum 1974/-buňky Věro potom viru SV 40,herpesvirů,reov1rů,poxv1rů,viru parotitidy, spalni ček,psinky,NDV,SV5,rubely,lymfocytárnl choříomenlngltIdy,adenovirů,erbovírů ap. /Whitaker A.,Tissue and cell,Ba1lllere Tindall, 1972/.
Novým řeSenlm se dosahuje předevžlm ekonomického efektu,který je dán zjednodušením pracovního postupu,snížením spotřeby materiálu a u zkumavkovýeh kultur využitím stacionární Inkubace.Sníženi počtu laboratorních operaci kromě toho zkracuje exposici pracovníků profesionálním rlslkům a zmenSuje možnost eventuální kontaminace a znehodnoceni kultur.
198 085
PŘÍKLAD
Stanoveni ΤΚΙΟ^θ parotitického viru a virus parotitidy neutralizujících protilátek ve zkumavkových kulturách buněk Věro
Buňky
Jako biologického substrátu se v testu užívá kultur buněk heteroploidní linie Věro /odvozených z ledvinné tkáně opice Cercopithecus aethiops/ s negativním nálezem mykoplasmatické kontaminace.Buňky se.pomnožuj1 v lahvích podle Rouxe /1200 ml/ v Eaglově minimálním esenciálním médiu/Eagle H.,Science,Washington, 130,432-437,1959/,/Izbický A.,Zprávy SEVAC í.2,54-60,1 974;izbický A. , £s. Epi dera., 26,1,9-1 4,1 977/.
Médium
Ve vlastním testu se užívá Eaglovo modifikované minimální esenciální médium,v němž je glukóza nahražena galaktózou/1 g/litr/ a natrium pyruvátem /0,5 g/litr/ /Baugh C.L. et at.,Life Science, 6,371-380,1 967;S lonim D.,J,Biol.Stand. 2,51-58-,1 974; Xzbi cký A.,Zprávy SEVAC č. 3,81-89,1974/ se 7,5% inaktivovaného telecího séra a 1,2 ml roztoku 7,5 %NaHCO^ na 100 ml média a s příměsi penicillinu a sterptomycinu /100 j.,respekti ve 100 mg na 1 ml média/- dále jen MEM-GaPy.
Příprava inokula pro virusneutralizačni test
Dvojnásobná řada ředěni /2_n/ vyšetřovaného séra/inaktivovaného/ se smisi se stejným objemem virové tekutiny /např.Endersův laboratorní kmen viru parotitidy/ o obsahu 100 TKIDS0 v 1 ml a inkubuje se při 37 °C po dobu 60 minut nebo při +4 °C 18 hodin.
Vlastni test
Bezprostředně před zahájením vlastního testu se připraví suspenze buněk Vero/z Roux lahvi uvolněny pomoci roztoku 0,01 % trypsinu s 0.02 % versenu-dvojsodná sůl EDTA v densitě 300 000 buněk na 1.3 ml média MEM-GaPy /cca 231 000 buněk/ml/ a až do inokulace se udržuje v chladu />4 °c/.
Ředěni vzorku pro stanoveni ΤΚΙΒ^θ /geometrická řada 10nv médiu MEM-GaPy/ se provádí průběžně během pokusu,séra pro stanoveni obsahu virusneutralizačnich protilátek je nutno zpracovat předem/viz příprava inokula pro virusneutralizačni test/.
Do zvoleného počtu/např. deset u testu TKIDgg a čtyři u virusneutralizačniho testu/ zkumavek průměru 16 mm a délky 100 mm se inokuluje po 1.3 ml buněčné suspenze a po 0,2 ml příslušného ředěni testovaného mateřiálu.zkumavky se potom zazátkuji gumovými zátkami, důkladně protřepou a uloži ke stacionární inkubací v šikmé poloze při teplotě +37 °C na dobu deseti dnů.
Ode čítáni
Přestože se pomnoženi parotitiekého viru v kultuře buněk Věro zpravidla projeví zřetelným eytopatickým efektem/tvorba syncycii až destrukce monolayeru/,je vhodné sledovat také hemag lutinaci kuřecích erytrocytů v médiu jednotlivých zkumavek a výskyt hemadsorpce.
Po skončené inkubaci se zkumavky odzátkuji a do média/1.5 ml/ se přidá po 0.2 ml suspenze třikrát promytých 3 % kuřecích erytrocytů v roztoku PBS /Dulbecco,Vogt,J.Exper. Med. 99,1 67-1 82,1 954/ bez Ca++ a Mg ++,důkladně protřepou a ponechají v klidu ve vertikální
198 OSS poloze v inkubátoru + 37 °C po dobu 30 minut, a potom při- laboratorní teplotě do vytvořeni sedimentu kontrolních zkumavek/kontrola erytrocytálni suspenze/.
Potom se prostým okem odečte hemaglutinace, u kultur s negativní nebo nejasnou heraaglutinad se konečný výsledek ověří mikroskopicky /zvětšeni 6 x 10/ podle výskytu hemadsorpce nebo cytopatického efektu.
Při testováni infekční aktivity se hodnoty ΤΚΙΕ>5θ stanoví výpočtem podle Reeda a Muenchea /Amer.J.Hyg.,27,493,1938/ a vyjádři v negativních log
Při stanoveni virusneutralizačnich protilátek se titr urči jako ředěni séra,které sniži počet destruovaných buněk v kultuře asi na po loví nu,nebo které ještě zřetelně redukuje hemadsorpci.
Součásti titračniho pokusu jsou vyšetřeni referenčních vzorků a soustava kontrol, e
Vedle využiti ve virolog ické diagnostice /izolace viru,stanoveni infekční nebo virusinhibuj 1 ci aktivity např. protilátek/ se může nový postup uplatnit i při pomnožováni virových agens pro výrobní účely;nelze vyloučit ani jeh využiti mimo oblast virologie při sledováni biologického účinku pomalu působících látek neinfekčniho charakteru.
Claims (1)
- Způsob přípravy te.stovaciho systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek,vyznačuj 1d se tim,že se testovaný materiál inokuluje v jedné operaci současně s buňkami pro nárůst kultury s užitím Caglova minimálního esenciálního média,v němž je glukóza nahražena galaktózou v množstvi 0,5 až 1,5 g na litr média a pyrohroznanem sodným v množství 0,25 až 0,75 g na 1 litr média,o pH 7,0 až 7,8, s inkubaci po dobu 4 až 21 dni při teplotě 30 až 40 °C«
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS502677A CS198055B1 (cs) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS502677A CS198055B1 (cs) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS198055B1 true CS198055B1 (cs) | 1980-05-30 |
Family
ID=5394301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS502677A CS198055B1 (cs) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS198055B1 (cs) |
-
1977
- 1977-07-29 CS CS502677A patent/CS198055B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sedwick et al. | Reproducible plaquing system for rabies, lymphocytic choriomeningitis, and other ribonucleic acid viruses in BHK-21/13S agarose suspensions | |
| Baublis et al. | Measles antigen and syncytium formation in brain cell cultures from subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) | |
| Hamdy et al. | Response of white-tailed deer to infection with peste des petits ruminants virus | |
| Fernandes et al. | Endosymbiotic relationship between animal viruses and host cells: a study of rabies virus in tissue culture | |
| Moe et al. | Plaque assay for Ebola virus | |
| Reich et al. | Nucleic acid homology studies of adenovirus type 7-SV40 interactions. | |
| Gutekunst | Latent pseudorabies virus infection in swine detected by RNA-DNA hybridization | |
| Howell et al. | Plaque formation by bluetongue virus | |
| EP1497468B1 (en) | Cells for detection of influenza and parainfluenza viruses | |
| Hughes | Physical and chemical methods for enhancing rapid detection of viruses and other agents | |
| Moulder et al. | Purification and properties of the agent of feline pneumonitis | |
| LaColla et al. | Vaccinia virus infection of HeLa cells. I. Synthesis of vaccinia DNA in host cell nuclei | |
| Saunders | Development and evaluation of an enzyme-labeled antibody test for the rapid detection of hog cholera antibodies | |
| Chiu et al. | Potato yellow dwarf virus in leafhopper cell culture | |
| Högman | Blood group antigens on human cells in tissue culture: The effect of prolonged cultivation | |
| Nakajima et al. | Immunodiffusion studies of purified equine infectious anemia virus | |
| Pinon et al. | Evaluation of risk and diagnostic value of quantitative assays for anti-Toxoplasma gondii immunoglobulin A (IgA), IgE, and IgM and analytical study of specific IgG in immunodeficient patients | |
| Genovesi et al. | Effect of macrophage-specific colony-stimulating factor (CSF-1) on swine monocyte/macrophage susceptibility to in vitro infection by African swine fever virus | |
| Oshiro et al. | Electron microscopic studies of rubella virus | |
| Echeverria et al. | The first isolation of equine arteritis virus in Argentina | |
| US4334016A (en) | Human osteogenic sarcoma cell line and use thereof for immunofluorescent antibody test | |
| CS198055B1 (cs) | způsob přípravy testovacího systému buněčných nebo tkáňových kultur pro stanoveni virů nebo viry inhibujiclch látek | |
| Tada et al. | An analysis of factors influencing the isolation rate of herpes simplex virus | |
| Dewar et al. | Isolation of HIV-1 from plasma of infected individuals: an analysis of experimental conditions affecting successful virus propagation | |
| Takemoto et al. | Transformation of mouse cells by K-papovavirus |