CS197080B1 - Směs k fotometrickému stanovení aktivity alkoholdéhydrogenasy v biologickém materiálu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká směsi chemických sloučenin k fotometrickému stanoveni aktivity enzymu alkoholdéhydrogenasy v biologickém materiálu

Description

Vynález se týká směsi chemických sloučenin k fotometrickému stanoveni aktivity enzymu alkoholdéhydrogenasy v biologickém materiálu.

Měření enzymových aktivit v biologickém materiálu je cennou diagnostickou pomůckou v humánní i veterinární medicíně. Většinou se sleduje zvýšená aktivita v krevním seru, když se za patologického stavu dostává určitý enzym do kreve z rozpadnuvších se buněk nemocné tkáně. Použitelní diagnostické závěry poskytuje většinou teprve poměr změřených aktivit dvou i více enzymů. Je poměrně málo takových enzymů, u nichž by odchylka úrovně aktivity od normálních hodnot specificky indikovala určitý fyziologický stav nebo intenzitu a lokalizaci patologického procesu. Právě stanovení aktivity alkoholdéhydrogenasy v krevním seru by mohlo poměrné selektivně vypovídat o poškození jaterní tkáně, protože jaterni buňky obsahují alkoholdéhydrogenasy mnohonásobně více než některé jiné orgány. Protože i mozková tkáň tento enzxm obsahuje, mohlo by stanovení aktivity alkoholdehydrogenasy v mozkomíšním moku indikovat některé patologické procesy nejvyšší úrovně nervové soustavy.

Běžné fotometrické techniky stanovení alkoholdéhydrogenasy, založené na přírůstku nebo úbytku absorbance redukovaného koenzymu při 340 nM nejsou dost citlivé pro nízké úrovně aktivit, které nalézáme v biologickém materiálu za normálních podmínek. Citlivější

107 Π7«

187080 fluorometrické metody, schopné zachytit! i velmi malé aktivity jsou nepoužitelné v biologickém materiálu bez pracných a ztrátových operací, protože jsou rušeny mnoha doprovodnými součástmi biologických tekutin·

Uvedené nevýhody odstraňuje směs k fotometrickému stanovení aktivity alkoholdehydrogenasy podle našeho vynálezu které sestává z alkoholického substrátu, tvořeného primárním nebo sekundárním alkoholem například etanolem, butanolem, cyklohexanolem nebo furylalkoholem v koncentraci 10~^ až 10^-¼, z koenzymu, kterým je nikotlnamid-adenindinukleotid v koncentraci ÍO^-^ až 10^-¾ v ůstrojném vodním roztoku o pH 7 až 11 a z arylnitrososloučeniny obecného vzorce ,ho ° koncentraci 10 až 10“^!, kde A je fenyl nebo naftyl,

R^ a Rg jsou alkyly o jednom až čtyřech uhlících a která obsahuje popřípadě v meta-poloze k N0-skupině - CH^, - OCH^ nebo halogen, přičemž k odlišeni neenzymové reakce obsahuje —/i směs inhibitor alkoholdehydrogenasy do koncentrace 10 až 10 M.

Tato směs, smíchána se aerem, mozkomišním mokem, nebo s extraktem tkáně a podobně umožňuje změřeni nízkých aktivit alkoholdehydrogenasy v těchto tekutinách bez jejich předběžného zpracováni a to tak, že rychlost poklesu zbarveni nitrosloučeniny, měřená fotometrem, tuto aktivitu přímo určuje.

Složky navrhované směsi umožňuji spřažení dvou reakci katalysovaných alkoholdehydrogenasou tak, že redukovaná forma koenzymu vznikající při oxydaci alkoholu enzymem se využívá k enzymové redukci silně zbarvémé nitrosloučeniny, která se tím mění na bezbarvý produkt.

Použití směsi podle vynálezu osvětlují dále uvedené příklady:

Příklad 1

Ke dvěma mililitrům směsi, která je 2 mM n-butanolem, 0,1 mM nikotinamidadenindinukleotidem a 50 uM p-mitrosodlethylanilinem ve fosfátovém pufru o pH 8,5 v kyvetě spektrofotometru se vmíchá 0,5 ml krevního sera a při vlnové délce 440 mm se za teploty 25 °C 2 až J minuty leduje úbytek žlutého zbarveni, který se registruje automatickým zapisovačem. K zastavení enzymové reakce se pak do kyvety přidá 20 ul nasyceného vodného roztoku inhibitoru, kterým je pyrazol a v reakční kyvetě se delší 2 minuty registruje intenzita zbarvení: klesá-li dále, je to způsobeno neenzymovou redukcí nitrososloučeniny vlivem balastnich látek ve zkoumaném vzorku.

Z počáteční rychlosti úbytku žlutého zbarvení, určené podle tečny ke křivce v počátku záznamu, snížení o případnou rychlost neenzymové reakce, se vypočte aktivita enzymu v libovolných konvenčních jednotkách nebo (použitím molárního absorbčního koeficientu ni4 —1 —1 trososloučeniny, který je 3,5.10 cm M ) v mezinárodních jednotkách či v kataleoh.

Přiklad 2

Připraví se dvě dvoumililitrové porce fosfátového pufru o pH 7,0 s nikotinamidadenindinuklsotidem v koncentraci 50 uM, cyklohexanolem v koncentraci 10 mM a s p-nitrosodimethylanilinem v koncentraci 20 um. Do prvé porce, jako slepého vzorku se přidá 0,1 ml

187 OM

2M vodného roztoku isobutyramidu. Pak sa k oběma porcím směsi přidá po 0,5 ml zkoumaného krevního sera. Po přesně 20 minutách inkubace při 25 °C se i do druhé porce směsi přidá 0,1 ml 2M vodného roztoku isobutyramidu, čímž se zde přeruŠi enzymová reakce, která byla v prvním vzorku zablokovány až od počátku. Změřený rozdíl absorbanoí obou vzorků při 450 nm je úměrný aktivitě alkoholdehydrogenasy, jejíž číselná hodnota se vypočte analogicky jako v příkladě 1.

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Směs k fotometrickému stanoveni aktivity alkoholdehydrogenasy v biologickém materiálu, vyznačená tím, že sestává z alkoholického substrátu tvořeného primárním nebo sekundárním alkoholem, například etanoiem, butanolem, cyklohexanolem v koncentraci 10^-^ až 10^-1M, z koenzymu, kterým je nikotinamidadenindinukleotid v koncetraci 10^-^ až 10^-¾ v ústrojném vodním roztoku o pH ? až 11 a z arylnitrososloučeniny o koncentraci 10^-6 až 10^-¾ obecného vzorce (Κχ^^.Α.No, kde A je fenyl nebo naftyl, R-^ a Rg jsou alkyly o jednom až čtyřech uhlících, a která obsahuje popřípadě v meta-poloze k NO-skupině -CHj, - OCHj nebo halogen, přičemž k odlišení neenzymo.vé reakce obsahuje směs inhibitor alkoholdehydrogenasy do koncentrace 10^-4 až 10^-1M.