CS195709B2

CS195709B2 - Method of producing novel antibiotics based on polycyclic ethers

Info

Publication number: CS195709B2
Application number: CS755472A
Authority: CS
Inventors: Walter D Celmer; Walter P Cullen; Mark T Jefferson; John B Routien; Frank Ch Sciavolino; Charles E Moppett
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1975-07-06
Publication date: 1980-02-29
Also published as: PL97341B1; ZA754572B; AT342765B; ATA602975A; BE831947A; HU174820B

Description

Vynález se týká nových antibiotik na bázi polycykiických etherů s charakterem kyseliny, což je třída sloučenin biologicky charakterizovaných jejich účinkem na přenášení kationtů do mitochondrií. Tato skupina antibiotik zahrnuje:The invention relates to novel polycyclic ether antibiotics having the character of acid, a class of compounds biologically characterized by their effect on the transfer of cations to mitochondria. This group of antibiotics includes:

monensin (J. Amer. Chem. Soc., 89, 5737, 1967), nigericin (Biochem. Biopliys. Res. Comm., 33, 2Ů, 1968), grisorixin (J. Chem. Soc. Chem. Coinmun., 1421, 1970), dianemycin (J. Antibiotics, 22, 161, 1969), salinomycin (J. Antibotics, 27, 814, 1974), antibiotikum X-537A (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 967, 1972), antibiotikum X-206 (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 927 1971), antibiotikum A204A (J. Amer. Chem. Soc., 95, 3399,1973).monensin (J. Amer. Chem. Soc., 89, 5737, 1967), nigericin (Biochem. Biopliys. Res. Comm., 33, 2 2, 1968), grisorixin (J. Chem. Soc. Chem. Coinmun., 1421 (1970), dianemycin (J. Antibiotics, 22, 161, 1969), salinomycin (J. Antibotics, 27, 814, 1974), antibiotic X-537A (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 967, 1972) , antibiotic X-206 (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 927, 1971), antibiotic A204A (J. Amer. Chem. Soc., 95, 3399, 1973).

Antibiotika na bázi polycykiických etherů výše uvedené jsou aktivní proti gram-positivním bakteriím, houbám a prVokům. Vyvíjejí výraznou aktivnost vůči kokcidiím.The polycyclic ether-based antibiotics mentioned above are active against gram-positive bacteria, fungi and protozoa. They develop significant activity against coccidia.

Patent US 3 839 557 popisuje způsob zlepšování využití krmiv přežvýkavci a monogastrickými zvířaty, živenými vláknitými hmotami rostlinného původu, kterým se podává monensin, dianemycin, nigericin nebo jiná antibiotika na bázi polycykiických etherů.U.S. Pat. No. 3,839,557 discloses a method of improving the use of feed by ruminants and monogastric animals, fed fibrous matter of plant origin, by administering monensin, dianemycin, nigericin or other polycyclic ether antibiotics.

Vynález se týká nového antibiotika na bázi polycykiických etherů označovaného jako sloučenina 38 295 vzorce:The invention relates to a novel polycyclic ether antibiotic known as compound 38 295 of the formula:

Uvedená antibiotická sloučenina se vyrábí tak, že se mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 kultivuje za teploty 28 až 36 °C ve vodném živném prostředí obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíků a anorganických solí za submerzních aerobních podmínek a antibiotikum se izoluje buď oddělením z fermentační kapaliny extrakcí fermentační kapaliny organickým rozpouštědlem neutišitelným s vodou a chromatograficky koncentrovaného extraktu na sloupci silikagelu nebo odpařením fermentační kapaliny.The antibiotic compound is produced by culturing Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 at 28-36 ° C in an aqueous nutrient medium containing an assimilable source of carbon, nitrogen, and inorganic salts under submerged aerobic conditions, and isolating the antibiotic either by separation from the fermentation liquid by extraction liquid with a water-insoluble organic solvent and chromatographically concentrated extract on a silica gel column or by evaporation of the fermentation liquid.

Mikroorganismus, jehož se používá k přípravě antibiotika podle vynálezu, byl izolován z půdního vzorku z Japonska. Pěstoval se v řadě živných půd používaných k identifikaci tohoto rodu a výsledek byl, že se dosáhlo v podstatě podobného popisu jaký platí pro Streptomyces hygroscopicus.The microorganism used to prepare the antibiotic of the invention was isolated from a soil sample from Japan. It was grown in a number of nutrient media used to identify this genus and the result was that a substantially similar description to that of Streptomyces hygroscopicus was achieved.

Kultura (Pfizer F. D. 23604) byla porovnávána v řadě charakterizujících význaků na různých živných půdách kulturou Streptomyces hygroscopicus 482,48, získanou z veřejné nizozemské sbírky kultur, Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). Porovnání i rozhodování se prováděla na bázi popisu uvedeného druhu v Applied Microbiology, 4,243-250, 1956. Následují porovnání dvou kultur:The culture (Pfizer F. D. 23604) was compared in a number of characterizing features on various nutrient soils by Streptomyces hygroscopicus 482.48, obtained from the Dutch Public Culture Collection, Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). Comparisons and decisions were made on the basis of the description of this species in Applied Microbiology, 4,243-250, 1956. The following compares two cultures:

Morfologie řetězců spor.Morphology of strings.

Řetězce druhu Pfizer F. D. 23604 ve spirálách o 6 až 10 otáčkách nebo o menším počtu na různých živných půdách se podobaly popsaným řetězcům u Streptomyces hygroscopicus CBS, znázorněným na obr. 1 výše zmíněné práce.The chains of Pfizer F. D. 23604 in spirals of 6 to 10 turns or less on different media were similar to those described in Streptomyces hygroscopicus CBS shown in Figure 1 of the aforementioned work.

Spory u druhu Pfizer F. D. 23604 se zkoumaly analýzou pod elektronovým mikroskopem a měly podobu přesně takovou jaká jé u kmene CBS Streptomyces hygroscopicus, znázorněného v Applied Microbiology, 18, 695,-696, kde jsou spory popisofvény jako spory se zdrsněným povrchem s· fiinohá důlky obklopovanými hrázemi z materiálů stěn, spor. Když se pro mikroskopické účely zbarvily, jevily se obě kultury jako identické.The spores in Pfizer FD 23604 were examined by electron microscope analysis and took the form exactly as in the strain CBS Streptomyces hygroscopicus, shown in Applied Microbiology, 18, 695, -696, where the spores are described as having rough surface pits. surrounded by dikes of wall materials, spore. When stained for microscopic purposes, both cultures appeared identical.

Barva kolonií.Color of colonies.

Vzdušné mycelium se jevilo jako šedivé u řady . živných půd, přesné odstínění se však u obou kultur je rozdílné. Kultura Pfizer 23604 na sacharózovém. agaru Czape.k vykazovala růstové formy ztluštělé nepravidelně zvlněné, šedavě bílé, kdežto kultura kmene S. hygroscopicus CBS měla formu plochou, tenkou a šedou. Kultura Pfizer F. D. 23604 na agaru s ovesnou moukou po 4 týdnech inkubace vyvinula žluté vzdušné mycelium, které bylo napřed šedé. Kultura Pfizer F. D. 23604 na kvasničném výtažku a sladovém výtažku měla žluté růstové skvrny na šedém mybeliu.The aerial mycelium appeared gray in the line. However, the exact shielding is different for both cultures. Pfizer 23604 culture on sucrose. Czape.k agar exhibited growth forms thickened irregularly wavy, greyish-white, while S. hygroscopicus CBS culture was flat, thin and gray. The Pfizer F. D. 23604 culture on oatmeal agar after 4 weeks of incubation developed yellow airy mycelium that was previously gray. The Pfizer F. D. 23604 culture on the yeast extract and malt extract had yellow growth spots on the gray mycelium.

Na žádné z obou kultur na agaru pepton s železem se netvořil melanin.Melanin was not formed on either of the peptone-iron agar cultures.

Využití uhlíku.Carbon utilization.

Metoda Pridham a Gottlieb, J. Bact., 56, 107 až 114, 1948).The method of Pridham and Gottlieb, J. Bact., 56, 107-114, 1948).

Kmen Pfizer F. D. 23604 využíval glukosu, L-arabinosu, dextrin, D-fruktózu, D ( + j-galaktosu, glycerin, inosit, inulin, laktošú,: maltosu, D-mannit, rafinosu, rhamnosu, octan sodný, D-sorbit, sorbosu, škrob, sacharosu, trehalosu a D-xylosu. Dulcitu sé nepoužívalo. Tyto výsledky souhlasí s výsledky uváděnými u kmenů S. hygroscopicus v Applied Microbiology, 15, 637-639, 1967 a u kmenu S. hygroscopicus CBS uvedené v Industrial Microbiology, 10, 183-221 s výjimkou, že u kmene CBS se neužívalo inositu.The Pfizer strain FD 23604 used glucose, L-arabinose, dextrin, D-fructose, D (+ j-galactose, glycerin, inosit, inulin, lactose,: maltose, D-mannitol, raffinose, rhamnose, sodium acetate, D-sorbitol, These results are consistent with those reported in S. hygroscopicus strains in Applied Microbiology, 15, 637-639, 1967 and in S. hygroscopicus CBS strain in Industrial Microbiology, 10 , 183-221, except that inositol was not used in the CBS strain.

Bylo dosaženo positivních výsledků, pokud jde o produkci sirovodíku, u obou kultur na peptonovém agaru s železem (šikmý agar) s proužky octanu olovnatého.Positive results in terms of hydrogen sulfide production were obtained in both cultures on iron peptone agar (sloping agar) with lead acetate strips.

U obou kultur, pokud jde o mléko, byly dosaženy stejné výsledky, nedocházelo ke koagulaci, úplná hydrolýza nebo přibližně úplná za 12 dní, zbarvení, rozpustný pigment.In both cultures, the same results were obtained with respect to milk, no coagulation, complete hydrolysis or approximately complete in 12 days, coloring, soluble pigment.

ŽelatinaGelatine

Kultury byly obdobné v růstu, zbarvení a mírném stupni ztekucení.The cultures were similar in growth, coloration and moderate degree of liquefaction.

Speciální charakteristiky.Special characteristics.

Kmen S. hygroscopicus CBS vyvinul během 3 týdnů na. glukuso-asparaginovém agaru, ovesném- agaru a agaru obsahujícím výtažek z droždí a ze sladu černé hygroskoplcké plochy, kdežto kmen Pfizer F, D. 23604 vykazoval černé skvrny jen na agaru s výtažkem droždí a sladu. Další inkubace po dobu 1 týdne a uskladnění na kulturách na Petriho mlskách při 4 až 10 °C po dobu 4. týdne zvýšilo zčernání u kultur Pfizer F. D. 23604. Kmen Pfizer F. D. 23604 na ovesném agaru na sacharózovém agaru Czapek a na agaru s výtažkem droždí a sladu vytvářel pach podobný jako je pach plané cibule nebo česneku s určitým zemitým zápachem, kdežto S. hygroscopicus CBS vyvíjel jen zemitý zápach a u tohoto kmene není nikde popsán zápach po plané cibuli. Kmen Pfizer F. D. 23604 S. hygroscopicus produkuje sloučeninu 38 295, jež je nové antibiotikum na bázi polycyklického etheru, kdežto S. hygroscopicus CBS toto antibiotikum neprodukuje a nebyly podány žádné zprávy o produkci tohoto antibiotika pokud jde o jiné kmenyThe S. hygroscopicus CBS strain developed within 3 weeks on. Glucose-asparagine agar, oat-agar and agar containing black yeast and malt extracts of the black hygroscopic area, whereas Pfizer F, D. 23604 showed black spots only on yeast and malt extract agar. Further incubation for 1 week and storage on Petri cultures at 4 to 10 ° C for 4 weeks increased the blackness in Pfizer FD 23604 cultures. Pfizer FD 23604 strain on oat agar on Czapek sucrose agar and yeast extract agar, and malt produced an odor similar to that of wild onion or garlic with a certain earthy odor, whereas S. hygroscopicus CBS produced only an earthy odor, and there is no description of the wild onion odor in this strain. Pfizer F. D. 23604 S. hygroscopicus produces compound 38,295, which is a novel polycyclic ether antibiotic, whereas S. hygroscopicus CBS does not produce this antibiotic and no reports of the production of this antibiotic have been reported with other strains.

S. hygroscopicus. .S. hygroscopicus. .

Kultura Pfizer F, D. 23604 byla uložena v americké sbírce týpových kultur {The American Type Culture Collectlon, Řockville, Md.) a dostala označení v této sbírce jako ATCC 31050.Pfizer F, D. 23604 was deposited with the American Type Culture Collectlon (Rockville, Md.) And was designated as ATCC 31050 in this collection.

Kultivace Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 se provádí s výhodou ve vodné živné půdě za teploty 28 až 36 °C v submerní aerobní kultuře za míchání. Živná půda, která je použitelná pro tyto účely, zahrnuje zdroj asimilovatelného uhlíku, jako cukru, škrobů a glycerinu, dále obsahuje zdroj organického dusíku, jako je kasein nebo produkt enzymatického odbourávání kaseinu, sójovou mouku, bavlníkové pokrutiny, podzemnicovou mouku, pšeničný lepek, sójové pokrutiny, masovou a rybí moučku. S výhodnými výsledky lze také používat zdrojů podporujících růst jako rozpustné zrnité složky a výtažek z droždí, stejně jako soli, jako chlorid sodný, uhličitan vápenatý a stopové prvky jako..železo, hořčík, zinek, kobalt a mangan. Jestliže během fermentace dochází k nadměrnému pěnění, lze používat protipěnicí přísady jako rostlinné oleje nebo silikony, jež se přidávají do fermentačního pro-, středí. Větrání živné půdy v nádržích pro submerzní růst se s výhodou provádí v míře přibližně půl až dva objemy čerstvého vzduchu na objem kapalné živné půdy za minutu. Míchání se může provádět pomocí míchadel běžných v kvasném průmyslu. Je třeba ovšem udržovat aseptické podmínky při přenášení organismu a během růstu.The cultivation of Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 is preferably carried out in an aqueous broth at 28 to 36 ° C in a submerged aerobic culture with stirring. The nutrient medium useful for this purpose includes a source of assimilable carbon such as sugar, starches and glycerin, further comprising an organic nitrogen source such as casein or enzymatic degradation product of casein, soy flour, cotton cake, peanut flour, wheat gluten, soybean cakes, meat and fish meal. Growth-promoting sources such as soluble granular components and yeast extract as well as salts such as sodium chloride, calcium carbonate and trace elements such as iron, magnesium, zinc, cobalt and manganese can also be used with advantageous results. If excessive foaming occurs during fermentation, antifoam additives such as vegetable oils or silicones can be used which are added to the fermentation environment. The breeding of the culture medium in the submerged growth tanks is preferably carried out at a rate of about half to two volumes of fresh air per volume of liquid culture medium per minute. Stirring can be carried out using stirrers customary in the fermenting industry. However, it is necessary to maintain aseptic conditions during transport and growth.

Očkovací látka pro přípravu antibiotika se může získat používáním dílčích kultur. Růst organismu se může provádět očkováním bůď do lahví nebo očkovací nádrží nebo alternativně lze očkovací nádrže očkovat kulturami z třepacích lahví. Kultura v třepacích lahvích obecně dosáhne svého maxima za 3 až 5 dní, kdežto očkovací látka v submersních očkovacích nádržích se obvykle dosáhne za nejpříznivější období 2 až 3 dnů. Dosáhne se výrazné antibiotické aktivnosti v koncovém, fermentačním stadiu přibližně za 3 až 5 dní. Míra množství antibiotika se pohybuje mezi 50 až 500 mg/litr.The vaccine for the preparation of the antibiotic can be obtained by using partial cultures. Growth of the organism can be accomplished by inoculation of the skin into bottles or inoculation tanks, or alternatively, inoculation tanks can be inoculated with shake-bottle cultures. Shake flask culture generally reaches its maximum in 3 to 5 days, whereas the vaccine in submersible inoculation tanks is usually achieved in the most favorable period of 2 to 3 days. Significant antibiotic activity is achieved at the final, fermentation stage in approximately 3 to 5 days. The amount of antibiotic varies between 50 and 500 mg / liter.

Způsob výroby antibiotika se výhodně provádí tak, že se během fermentace provádí biologické testování, kultury a to tak, že se použije citlivých kmenů Staphylococcus aureus nebo Bacillus subtilis. Používá se standardní talířové zkušební metody, kde se použije jako měřítka pro antibiotickou účinnost pásma inhibice, které obklopuje kotouč filtračního papíru nasáklý živnou půdou.The method of producing the antibiotic is preferably carried out by carrying out biological testing of the culture during fermentation using sensitive strains of Staphylococcus aureus or Bacillus subtilis. A standard plate test method is used, where it is used as a measure for the antibiotic activity of the inhibition zone that surrounds a filter paper soaked with culture medium.

Pro analýzu antibiotika vyrobeného ve fermentační živné půdě a pro analýzu skladby surového i vyčištěného materiálu extrahovaného z fermentačních živných půd je užitečným nástrojem chromatografie v tenké vrstvě při níž se používá silikagelu. Chromatogram v tenké vrstvě po vyvíjení octanem ethylnatým se postřikuje 3°/o roztokem vanilinu, v ethanolickém roztoku kyseliny sírové (98,5:—1,5'%, obj./obj.) načež se zahřeje na 60 až 80 °C po několik minut. Antibiotikum se pozoruje jako zářivě růžovo červená skvrna s bílým pozadím.For analysis of the antibiotic produced in the fermentation broth and for the composition of the raw and purified material extracted from the fermentation broths, a thin layer chromatography using silica gel is a useful tool. Spray with a 3% w / v solution of vanillin, in ethanolic sulfuric acid solution (98.5: -1.5%, v / v), thin-layer chromatograph after developing with ethyl acetate, then heat to 60-80 ° C after couple of minutes. The antibiotic is observed as a bright pink-red spot with a white background.

Antibiotická sloučenina 38295 se může oddělovat a získávat z výčeřené fermentační živné půdy extrakcí organickým rozpouštědlem jako chloroformem, octanem ethylnatým nebo methylisobutylketonem. Hlavní podíl antibiotika je obsažen v odděleném myceliu a výhodně se extrahuje z něho tím, že se vytváří suspenze mycelia v rozpouštědle rozpustném ve vodě, jako je methanol.The antibiotic compound 38295 can be separated and recovered from the clarified fermentation broth by extraction with an organic solvent such as chloroform, ethyl acetate or methyl isobutyl ketone. The major portion of the antibiotic is contained in a separate mycelium and is preferably extracted therefrom by forming a suspension of mycelium in a water-soluble solvent such as methanol.

Výhodný způsob oddělování a získávání antibiotické sloučeniny 38 295 je tento:A preferred method of separating and recovering antibiotic compound 38,295 is as follows:

Úhrnná nefiltrovaná fermentační kapaliha se dvakrát extrahuje za použití přibližně 1/5 až ¹/2 objemového množství methylisobutylketonu. Extrakt v rozpouštědle se koncentruje na olejóvitý odparek, který se pak suspenduje do směsi chloroformu a hexanu v poměru 1:1 a vnáší se na sloupec silikagelu (s výhodou se na silikagel 60 naskládá vrstva silikagel PF254, oba produkty firmy E. Merck, Darmstadt). Sloupec silikagelu se postupně vyvíjí hexanem, směsí chloroform: :hexan (1:1) a chloroformem. Hlavní antibiotická frakce se eluuje octanem ethylnatým. Eluát se koncentruje ve vakuu, vyjme do acetonu a míchá se asi 30 až 60 minut s aktivovaným dřevěným uhlím (Darco G 60). Dřevěné uhlí se oddělí filtrací, roztok se koncentruje na malý objem ve vakuu, přidá se malé množství vody a pH s,e upraví hydroxidem sodným na 8,0 až 8,5. Krystalický materiál se oddělí filtrací, promyje vodou a vysuší.Aggregate unfiltered fermentation kapaliha extracted twice using about 1/5 to ^1/2 by volume of methylisobutyl ketone. The solvent extract is concentrated to an oily residue which is then suspended in a 1: 1 mixture of chloroform and hexane and loaded onto a silica gel column (preferably silica gel PF254, both from E. Merck, Darmstadt) is loaded onto silica gel 60. . The silica gel column was progressively developed with hexane, 1: 1 chloroform: hexane and chloroform. The major antibiotic fraction was eluted with ethyl acetate. The eluate was concentrated in vacuo, taken up in acetone and stirred for about 30 to 60 minutes with activated charcoal (Darco G 60). The charcoal was collected by filtration, the solution was concentrated to a small volume in vacuo, a small amount of water was added and the pH adjusted to 8.0-8.5 with sodium hydroxide. The crystalline material was collected by filtration, washed with water and dried.

Antibiotikum isolované v tomto stupni je směsová sodná a draselná sůl sloučeniny 38 295, vytvořená působením, sodných i dra195709 selných iontů, vyskytujících se ve fermentační kapalině a získaná z přidaného hydroxidu sodného. Chromatogramy v tenké vrstvě mohou ukázat přítomnost stopových množství alespoň dvou dalších vícepolárních antibiotik, která podobně jako sloučenina 38 295 vykazuje charakteristické růžovo-červené skvrny při postříkání vanilinem v ethanolickém roztoku kyseliny sírové.The antibiotic isolated in this step is a mixed sodium and potassium salt of compound 38,295 formed by the action of both sodium and potassium ions found in the fermentation liquid and obtained from the added sodium hydroxide. Thin layer chromatograms may show the presence of trace amounts of at least two other multi-polar antibiotics which, like compound 38,295, exhibit characteristic pink-red spots when sprayed with vanillin in an ethanolic sulfuric acid solution.

Sloučenina 38295 se může získat jako čistá jednotka sloupcovou chromatografií na silikagelu PF254 za použití hexanu. Směsné sodnodraselné soli se přidávají jako roztok v octanu ethylnatém nebo chloroformu a kolona se vyvíjí pod tlakem 5,5 kp/cm² za použití hexanu obsahujícího rostoucí podíly octanu ethylnatého. Pokrok v oddělování se sleduje chromatografií v tenké vrstvě. Vhodné frakce se kombinují, odpaří ve vakuu a antibiotikum vykrystaluje ve směsi acetonu a vody.Compound 38295 can be obtained as a pure unit by column chromatography on silica gel PF254 using hexane. The mixed sodium potassium salts were added as a solution in ethyl acetate or chloroform and the column was developed at a pressure of 5.5 kp / cm ² using hexane containing increasing proportions of ethyl acetate. Progress in separation was monitored by thin layer chromatography. Appropriate fractions were combined, evaporated in vacuo and the antibiotic crystallized in a mixture of acetone and water.

Volná kyselina sloučeniny 38295 se může získat ze směsné sodnodraselné soli úpravou pH v octanu ethylnatém nebo chloroformu na 4,5 zředěnou kyselinou fosforečnou. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem sodným, odpaří ve vakuu a odparek vykrystaluje ze směsi chloroformu a hexanu.The free acid of compound 38295 can be obtained from the mixed sodium potassium salt by adjusting the pH in ethyl acetate or chloroform to 4.5 with dilute phosphoric acid. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue crystallized from chloroform / hexane.

Sodná sůl sloučeniny 38295 se může získat •The sodium salt of compound 38295 may be obtained •

tak, že se roztok ethylacetátu nebo chloroformu volné kyseliny upraví na pH 8,5 1 N roztokem hydroxidu sodného. Látka vykrystaluje z acetonu a vody. Krystalická draselná sůl se obdobně získá za použití hydroxidu draselného místo hydroxidu sodného.by adjusting the solution of ethyl acetate or chloroform of the free acid to pH 8.5 with 1 N sodium hydroxide solution. The material crystallized from acetone and water. The crystalline potassium salt is similarly obtained using potassium hydroxide instead of sodium hydroxide.

Krystalická sůl stříbra se může připravit přidáním vodného roztoku dusičnanu stříbrného do ethanolického roztoku směsné sodnodraselné soli sloučeniny 38295. Další snadno získatelné sloučeniny jsou soli sloučenin 38295 měďnaté, zinečnaté, amonné, vápenaté, hořečnaté a lithné. Vzhledem k finálnímu způsobu použití pro .bránění a léčení koncldiózy drůbeže lze celou fermentační kapalinu obsahující sloučeninu 38295 vysušit, s výhodou sušením vymrazováním, a přidávat do krmima drůbeže v množství odpovídajícím požadované úrovni antiblotického působení.Crystalline silver salt can be prepared by adding an aqueous solution of silver nitrate to an ethanolic solution of the mixed sodium potassium salt of compound 38295. Other readily obtainable compounds are the salts of compound 38295 copper, zinc, ammonium, calcium, magnesium, and lithium. Due to the final use for the prevention and treatment of poultry concdiosis, the entire fermentation liquid containing compound 38295 can be dried, preferably by freeze-drying, and added to the poultry feed in an amount corresponding to the desired level of antiblottic activity.

Sloučenina 38295 se vyznačuje inhibičním účinkem proti růstu řady mikroorganismů, jak plyně z dále uvedené tabulky I. Zkušební organismy se očkují do řady zkušebních nádob obsahujících živnnou půdu a rozdílné koncentrace sloučeniny 38295, aby se zjistila minimální koncentrace antibiotika v mcg/ml, která inhibují růst organismu během 24 hodin.Compound 38295 is characterized by a growth inhibitory effect on a number of microorganisms, as shown in Table I below. Test organisms are inoculated into a series of test vessels containing nutrient medium and different concentrations of compound 38295 to determine the minimum antibiotic concentration in mcg / ml that inhibits growth. organism within 24 hours.

OrganismusOrganism

Tabulka ITable I

Sloučenina 38295 (směsná sodnodraselné sůl)Compound 38295 (mixed sodium potassium salt)

Sloučenina 38295 (volná kyselina)Compound 38295 (free acid)

Stapylococcus aureus 01A005 01A052 01A109 01A110 01A400Stapylococcus aureus 01A005 01A052 01A109 01A110 01A400

Streptomyces faecalls Streptomyces pyogenes Neisseria sicca Bacillus subtilis Lactobacillus casei var casei Lactobacillus catenaforme Clostridlum innocum Clostridlum blfermentans Treponema hyodysenteriaeStreptomyces faecalls Streptomyces pyogenes Bacillus subtilis Lactobacillus casei var casei Lactobacillus catenaforme Clostridlum innocum Clostridlum blfermentans Treponema hyodysenteriae

0,78 0.78 0,39 0.39 0,78 0.78 3,12 3.12 0,78 0.78 0,78 0.78 0,39 0.39 1,56 1.56 0,39 0.39 1,56 1.56 0,20 0.20 1,56 1.56 <0,10 <0.10 <0,10 <0.10 <0,10 <0.10 <0,10 <0.10 <0,10 <0.10 <0,10 <0.10 1,56 1.56 — - 0,78 0.78 — - 0,20 0.20 — - 0,78 0.78 — - 0,39 0.39 — -

Sloučenina 38295 a její soli mají vynikající aktivnost proti kokcidiose u drůbeže. Když se přidávají do potravy kuřat v množství 15 až 250 ppm, jsou tyto sloučeniny účinné k potírání infekcí vyvolaných jak jednotlivými mikroorganismy Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima a dalšími tak i proti infekcím smíšeným vyvolaným těmito mikroorganismy.Compound 38295 and its salts have excellent activity against coccidiosis in poultry. When added to the diet of chickens in an amount of 15 to 250 ppm, these compounds are effective to combat infections caused by individual microorganisms Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima and others, as well as against mixed infections caused by these microorganisms.

Údaje o účinnosti sloučeniny 38292 a jejích solí proti infekční kokcidiose u kuřat se získají dále uváděným způsobem. Skupiny 3 až 5denních kuřat druhu SPF bílé leghornky, (kohoutci) se krmí smíšenou dietou obsahující sloučeninu 38295 nebo některou z jejích solí, která je jednotně z ní dispergována. Po krmení tímto způsobem asi 24 hodiny každé kuře Je očkováno per os jednotlivými druhy Eimeria, které se zkouší. Další kuřata krmená krmivém bez antibiotika se obdobně infikují a slouží jako kontrolní zvířata infikovaná, Neínfikovaná a léčebnému postupu nepodrobená kuřata tvoří normální kontrolní zvířata. Výsledky ošetření se hodnotí po 5 dnech, v případě Eimeria acervulina a po 6 dnech u všech ostatních druhů Eimeria.Data on the efficacy of Compound 38292 and its salts against infectious coccidiosis in chickens are obtained as follows. Groups of 3-5 day old SPF chickens (cocks) are fed a mixed diet containing compound 38295 or one of its salts uniformly dispersed therein. After feeding in this manner for about 24 hours of each chicken, it is vaccinated orally by individual Eimeria species to be tested. Other chickens fed without antibiotics are similarly infected and serve as infected control animals. Uninfected and non-treated chickens form normal control animals. Treatment results are evaluated after 5 days for Eimeria acervulina and after 6 days for all other Eimeria species.

Tabulka II vyjadřuje výsledky získané za použití směsné sodnodraselné soli sloučeniny 38 295.Table II shows the results obtained using the mixed sodium potassium salt of compound 38,295.

^! Tabulka II ^! Table II

Infikující organismus sp. Infecting organism sp. Dávka (ppm) Dose (ppm) Průměrný stupeň . infekce* Average grade. infection* Stupeň poškození (poměr) Degree of damage (ratio) Eimeria tenella Eimeria tenella 250 250 0,0 . 0.0. 0,0 0,0 0.0 0.0 125 125 0,0 0.0 Mí/··..' ¹ Mi / ·· .. ' ¹ 60 60 0,7 0.7 0,21 0.21 30 30 1,7 1.7 0,54 0.54 15 15 Dec 2,7 2.7 0,86 0.86 Eimeria acérvulina Eimeria acérvulina 250 250 0,0 0.0 0,0 0.0 125 125 0,2 0.2 0,1 0.1 60 60 0,0 0.0 0,0 0.0 45 45 0,4 0.4 0,2 0.2 30 30 1,2 1,2 0,6 0.6 15 15 Dec 2,0 2,0 1,0 1.0 Eimeria nfefcatrix Eimeria nfefcatrix 250 250 0,0 0.0 0,0 0.0 125 125 0,2 0.2 0,13 0.13 60 60 0,2 0.2 0,13 0.13 Eimeria maxima Eimeria maxima 250 250 0,0 0.0 0,0 0.0 125 125 0,0 0.0 0,0 0.0 60 60 0,4 0.4 0,25 0.25 45 45 0,6 0.6 0,33 0.33 30 30 0,8 0.8 0,44 0.44 15 15 Dec 1,8 1,8 0,66 0.66 Eimeria brunettl Eimeria brunettl 250 250 0,4 0.4 0,22 0.22 125 125 0,4 0.4 0,22 0.22 60 60 0,8 0.8 0,44 0.44 45 ‘ 45 ‘ 1,2 1,2 0,66 0.66 30 30 1,6 1.6 0,88 0.88 15 15 Dec 1,6 1.6 0,88 0.88 infekce směsí mikroorganismů infection of mixtures of microorganisms 250 250 0,0 0,0** 0.0 0.0 ** 0,0 0,0 0.0 0.0 (Coccivac D, Sterwine Labo- (Coccivac D, Sterwine Labo- 125 125 0,2 0,4 0,2 0,4 0,08 0,18 0.08 0.18 ratoťies, Opelika, Alabama) ratoťies, Opelika, Alabama) 60 60 0,2 0,0 0,2 0,0 0,08 0,0 0,08 0,0 50 50 1,0 0,6 1,0 0,6 0,38 0,21 0.38 0.21 40 40 1,2 1,0 1,2 1,0 0,46 0,35 0.46 0.35 V ' V ' 30 30 2,6 2,0 2,6 2,0 0,85 0,71 0.85 0.71

Poznámka:Note:

* Pro měření anticoctidiosní aktivnosti se používá jako hodnotícího měřítka stupnice míry poškození od 0 do 4 pro E. tenella (J. E. Lynch, Am. J. Vet. Res. 22,324—326, (1961) a 0 až 3 pro další druhy (J. Johnson a W. H. Reid.Exp. Parasit., 28,30—36, 1970). Konstantní poměr je stanoven tím, že se dělí stupeň poškození u každé, skupiny, která byla ošetřena, stupněm poškození infikovaných kontrolních zvířat.* For the measurement of anticoctidiosis activity, the scale of damage rate from 0 to 4 for E. tenella (JE Lynch, Am. J. Vet. Res. 22, 324-326, (1961) and 0 to 3 for other species (J. Johnson and WH Reid.Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970) The constant ratio is determined by dividing the degree of injury in each treatment group by the degree of injury of infected control animals.

** První číslo se vztahuje na poškození vnitřnosti a druhé číslo na poškození zraku.** The first number refers to viscera damage and the second number to vision damage.

Podobné výsledky se mohou dosáhnout za použití volné kyseliny, sodné soli, draselné soli nebo vysušeného fermentačního prostředí obsahujícího sloučeninu 38295 v dávkách potravin za požadované úrovně ántibiotické účinnosti.Similar results can be obtained using free acid, sodium salt, potassium salt, or a dried fermentation broth containing compound 38295 in batches of food at the desired level of antibiotic activity.

Vlastnosti sloučeniny . 38295 podtrhující růst jsou vysvětlovány zkouškami prováděnými na chovaných domácích zvířatech.Properties of compound. 38295 underlining growth is explained by tests conducted on reared domestic animals.

Mladé jalovičky angussko-aberdeenského skotu se libovolně rozdělí do ohrad — 5 zvířat na ohradu — a dodává se jim pes os sloučenina 38295, například ve vodě k pití apod. Sloučenina se ovšem výhodně a snadno dodává z hlediska aktivnosti tak, že se vpracuje do krmivových přípravků v množství 11 až 33 ppm. Sloučenina 38295 může být v různých formách jako volná kyselina, sodná sůl, draselná sůl, směsné sodnodraselné soli nebo jako usušená fermentační kapalina produkovaná mikroorganismem Streptomyces hygroscopicus ATGC 31050.The young heifers of Angus-Aberdeen cattle are arbitrarily divided into pens - 5 animals per pens - and are supplied to the dog by compound 38295, for example in drinking water, etc. 11 to 33 ppm. Compound 38295 may be in various forms as the free acid, sodium salt, potassium salt, mixed sodium potassium salt, or as a dried fermentation liquid produced by Streptomyces hygroscopicus ATGC 31050.

Krmivové směsi se sloučeninou 38295 nebo bez této přísady se podávají v libovolném množství zkušebním zvířatům. Krmivová směs obsahuje 12,5 °/o bílkovin, 75:25 koncentrátu' v objemovém krmivu pro hovězí dobytek v upravených dávkách obsahujících kukuřici, sójovou moučku, moučku z vojtěšky, fosforečnan vápenatý, melasu, vitaminy a stopové prvky. Sloučenina 38295 je obsažena v předběžné směsi spolu s mletou kukuřici s mineráliemi a Vitaminy.Feed mixtures with or without Compound 38295 are administered in any amount to test animals. The feed composition contains 12.5% protein, 75:25 concentrate in bulk cattle feed in adjusted doses containing corn, soybean meal, alfalfa meal, calcium phosphate, molasses, vitamins and trace elements. Compound 38295 is included in the premix together with ground corn with minerals and Vitamins.

Základní dávka (12,5% bílkoviny — 75:25, koncentrát: dávka objemového krmivá pro hovězí dobytek) složky: procent:Basic ration (12.5% protein - 75:25, concentrate: ration by volume of feed for cattle)

mletá kukuřice 55,6 sójová mouka, 48 % bílkovin 6,3 mouká z vojtěžky, 17 % bílkovin 25,0 sušená melasa* 10,0 sójový olej 2,0 fosforečnan vápenatý (24 % vápníku, 18,5 % fosforuj 0,40( stopové minerální soli** 0,50 směs vitaminů a minerálií*** 0,20ground corn 55.6 soy flour, 48% protein 6.3 alfalfa flour, 17% protein 25.0 dried molasses * 10.0 soya oil 2.0 calcium phosphate (24% calcium, 18.5% phosphate 0.40 (trace mineral salts ** 0,50 mixture of vitamins and minerals *** 0,20

Poznámka:Note:

* Třtinová melasa na nosiči tvořeném rozmělněnou kukuřičnou hmotou, nikoliv méně než 3 % surové bílkoviny, nikoliv více než 15 % vláknin, nikoliv méně 42 % inertního cukru, nejvýše 6 % vody.* Cane molasses on a carrier consisting of ground maize, not less than 3% raw protein, not more than 15% fiber, not less 42% inert sugar, not more than 6% water.

** Poskytuje tuto míru stopových prvků v milióntinách: mangan 10, železo 6,25, měď 1,25, jod 0,025, kobalt 0,86, zinek 45.** Provides this trace element rate in micros: manganese 10, iron 6.25, copper 1.25, iodine 0.025, cobalt 0.86, zinc 45.

*** Vytváří tyto úrovně vitaminů na 454 g krmné dávky: vitamin A 1497 M.J.; vitamin*** Produces the following levels of vitamins per 454 g of ration: vitamin A 1497 M.J .; vitamin

D 200 M.J.; vitamin E 25 M.J. D 200 M.J .; vitamin E 25 M.J. Předběžná směs Pre-mix < < Složky: Folders: Množství (1816 g) Quantity (1816 g) Vitamin A dodatkový (30,000 M.J./g) vitamin D3 dodatkový (200,000 M.J ,/g] vitaminový dodatek (0,27000 M.J./g) kysličník zinečnatý (79,4 % zinku) uhličitan kobaltnatý (45 % kobaltu) sójová drť nebo jemně mletá kukuřice sloučenina 38295 Vitamin A Supplemental (30,000 M.J./g) vitamin D3 supplementary (200,000 M.J, / g] vitamin supplement (0.27000 M.J./g) Zinc oxide (79.4% zinc) cobalt carbonate (45% cobalt) soya pulp or finely ground maize Compound 38295 100 g 2,00 g 182 g 38,0 g 1,70 g 1485 g 40,0 g 100 g 2,00 g 182 g 38,0 g 1,70 g 1485 g 40.0 g

454 g předběžné směsi na tunu úplné dávky vytváří výslednou úroveň množství sloučeniny 38295 činící 11 ppm.454 g of premix per tonne of the complete batch produces a final level of 11 ppm of 38295.

Tabulka III vysvětluje výsledky pokusu trvajícího 28 dní, který se získal u tří opakovaných skupin po 5 telatech v ohradě, přičemž přibližná počáteční hmotnost telat byla 115 kg u každého telete.Table III explains the results of the 28-day trial obtained in three repeated groups of 5 calves each, with an approximate initial weight of calves of 115 kg for each calf.

Tabulka III (směsné soli sodnodraselné sloučeniny 38295]Table III (mixed potassium sodium salts 38295)

Působení (ppm) Průměrný Průměrná Krmlvo/přírůstek denní přírůstek denní krmná dávkaEffect (ppm) Average Average Feed / Increment Daily Increment Daily Feed Ration

kg kg index index kg kg index index poměr ratio index index kontrola control 0,56 0.56 100,0 100.0 6,32 6.32 100,0 100.0 1,92 1.92 100,0 100.0 sloučenina 38295 (11) Compound 38295 (11) 0,64 0.64 110,6 110.6 5,68 5.68 95,1 95.1 1,65 1.65 117,0 117.0 sloučenina 38295 (33) compound 38295 (33) 0,67 0.67 116,9 116.9 5,58 5.58 87,3 87.3 1,43 1.43 136,0 136.0

V podstatě stejné výsledky se mohou dosáhnout za použití volné kyseliny, sodné soli, draselné soli nebo sušené fermentační kapaliny se sloučeninou 38295.Substantially the same results can be obtained using the free acid, sodium salt, potassium salt or dried fermentation liquid with compound 38295.

Porovnatelných výsledků se může dosáhnout 1 u jiných přežvýkavců, jako ovcí nebo u monogastrických zvířat, jako koní, prasat a králíků.Comparable results may be obtained 1 in other ruminants such as sheep or in monogastric animals such as horses, pigs and rabbits.

Aktivní sloučenina 38295 se může podávat spolu s krmivém nebo nápojem pro zvířata nebo se může použít z předběžné směsi pro smíšení s krmivém nebo nápojem pro zvířata. Kapalný antibiotický koncentrát v premixu pro přidávání do· vody k pití ke zvýšení krmivové účinnosti u zvířat se může připravit v požadovaných koncentracích rozpuštěním ve vhodném rozpouštědle jako je ethanol nebo propylenglykol sloučeniny 38295.The active compound 38295 may be administered together with an animal feed or beverage, or it may be used from a premix for mixing with an animal feed or beverage. The liquid antibiotic concentrate in the premix for addition to drinking water to increase animal feed efficiency can be prepared at the desired concentrations by dissolving in a suitable solvent such as ethanol or propylene glycol compound 38295.

Kapalný premixový koncentrátLiquid premix concentrate

Kapalný antibiotický premixový koncentrát vhodný pro přidávání do pitné vody pro zvířata se může připravit v požadovaných koncentracích rozpouštěním v přiměřeném rozpouštědle jako ethanolu nebo propylenglykolu antibiotické látky 38295.The liquid antibiotic premix concentrate suitable for addition to drinking water for animals can be prepared at the desired concentrations by dissolving in an appropriate solvent such as ethanol or propylene glycol of antibiotic 38295.

Příklad 1Example 1

Připraví se sterilní vodná živná půda o následujícím složení:Prepare a sterile aqueous medium containing the following composition:

g/1g / 1

glukosa glucose 10,0 10.0 rozpustný škrob soluble starch 20,0 20.0 výtažek z droždí yeast extract 5,0 5.0 produkt enzymatického enzyme product odbourávání kaseinu degradation of casein 5,0 5.0 masová moučka meat meal 5,0 5.0 uhličitan vápenatý calcium carbonate 1,0 1.0

pH - 7,0pH - 7.0

Buňky kmene Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 se přenášejí do série lahví o 300 ml, z nichž každá obsahuje 50 ml uvedené sterilní živné půdy a protřepávají se na rotační třepačce 3 až 4 dni při 28 až 38 °C. 5 ml alikvótních podílů takto namnožené očkovací látky se přenese asepticky do 300 mililitrů velkých lahví obsahujících každá 100 ml výše popsané sterilní živné půdy. Po protřepávání 3 až 4 dni při 28 až 30 °C se přenese namnožená očkovací hmota do čtyřlitrových fermentačních nádob, z nichž každá obsahuje 2 litry následující sterilní živné půdy:Cells of Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 are transferred to a series of 300 ml flasks each containing 50 ml of said sterile broth and shaken on a rotary shaker for 3-4 days at 28-38 ° C. 5 ml aliquots of the propagated vaccine are transferred aseptically to 300 ml large bottles containing 100 ml each of the sterile broth described above. After shaking for 3 to 4 days at 28 to 30 ° C, the multiplied inoculum is transferred to a 4 liter fermenter, each containing 2 liters of the following sterile broth:

g/1g / 1

glukosa glucose 10,0 10.0 kukuřičný škrob cornstarch 10,0 10.0 sójová mouka soy flour 10,0 10.0 rozpustné složky z obilí soluble components from cereals 5,0 5.0 chlorid sodný sodium chloride 5,0 5.0 uhličitan vápenatý calcium carbonate 1,0 1.0

pH — 6,6pH - 6.6

Fermentace se provádí 90 až 120 hodin při 28 až 36 °C za míchání při 1700 otáček/ /min. a za větrání tak, že se přivádí za minutu asi 1 objem vzduchu na 1 objem živné půdy. Velké fermentační nádoby obsahující od 300 1 do 37 000 1 živné půdy se může očkovat asi 2 % této namnožené očkovací látky. Fermentace se dokončí až když se antibiotická účinnost dosáhla nejméně 50 mg/ /litr (90 až 120 hodin).The fermentation is carried out for 90 to 120 hours at 28 to 36 ° C with stirring at 1700 rpm. and with ventilation so that about 1 volume of air per 1 volume of culture medium is supplied per minute. Large fermentation vessels containing from 300 L to 37,000 L of broth can be inoculated with about 2% of this multiplied vaccine. Fermentation is not complete until antibiotic activity is at least 50 mg / l (90 to 120 hours).

100 litrů úplné nefiltrované fermentační kapaliny se 2X extrahuje Vs objemového množství methylisobutylketonu. Oddělený extrakt v rozpouštědle se koncentruje ve vakuu na ole jo vitý zbytek (769 g), který se disperguje na silikagelu tak, že se přidává do roztoku ve 2 litrech chloroformu na jeden kg silikagelu PF254, načež se rozpouštědlo suspenduje do 2 1 směsi chloroformu a hexanu (1:1) a nalije se na lože 300 g silikagelu, na které se umístí vrstva 300 g silikagelu PF254. Silikagel se pak postupně promývá 5,6 1 hexanu, 5,6 1 chloroformu s hexanem (1:1) a100 liters of complete unfiltered fermentation liquid is extracted 2X with 5% by volume of methyl isobutyl ketone. The separated extract in solvent was concentrated in vacuo on an oily residue (769 g) which was dispersed on silica gel by adding to a solution in 2 liters of chloroform per kg of silica gel PF254, after which the solvent was suspended in 2 L of chloroform and hexane (1: 1) and poured onto a bed of 300 g silica gel onto which a layer of 300 g silica gel PF254 was placed. The silica gel was then sequentially washed with 5.6 L of hexane, 5.6 L of chloroform with hexane (1: 1), and

5,6 chloroformu. Antibiotikum se eluuje 3,8 1 octanu ethylnatého. Octan ethylnatý se ve vakuu odpaří á odparek (38 gj se rozpustí ve 400 ml acetonu. Acetonový roztok se míchá za teploty místnosti přibližně 40 minut s přibližně 40 g aktivovaného dřevěného uhlí (Darco G 60). Po filtraci se provádí koncentrace přibližně na 200 ml a zředí se 100 ml vody. Sloučenina 38295 se odděluje jako směsná sodnodraselnó sůl a pH se upraví na 8,5 přidáním 1 N roztoku hydroxidu sodného. Krystalická látka (13,8 g) se rozpustí v octanu ethylnatém a chromatografuje se na koloně silikagelu PF254 za použití hexanu. Sloupec se vyvíjí při tlaku 5,6 kp/cm² hexanem za použití rostoucích množství octanu ethylnatého. Postup oddělování se sledu14 je chromatografií v tenké vrstvě. Vhodné frakce se kombinují, odpaří ve vakuu a Čistá sloučenina krystaluje ze směsi acetonu a vody.5.6 chloroform. The antibiotic was eluted with 3.8 L of ethyl acetate. The ethyl acetate is evaporated in vacuo and the residue (38 g is dissolved in 400 ml of acetone. The acetone solution is stirred at room temperature for about 40 minutes with about 40 g of activated charcoal (Darco G 60). and diluted with 100 mL of water, Compound 38295 was separated as a mixed sodium potassium salt and adjusted to pH 8.5 by addition of 1 N sodium hydroxide solution. The column is developed at a pressure of 5.6 kp / cm ² with hexane using increasing amounts of ethyl acetate.The sequence of separation in sequence 14 is thin layer chromatography. water.

Čistá krystalická směsná sodnodraselná sůl sloučeniny 38295 má teplotu tání 200 °C a optickou otáčivost [a]_D ²⁵ == +36 °C za koncentrace 1% v methanolu. Po vysušení ve vakuu přes noc při 70 °C kysličníkem fosforečným je výsledná analýza na uhlík 60,58 % a vodík 8,56 %.The pure crystalline mixed sodium potassium salt of compound 38295 has a melting point of 200 ° C and an optical rotation of [α] _D ²⁵ = + 36 ° C at a concentration of 1% in methanol. After drying under vacuum overnight at 70 ° C with phosphorus pentoxide, the resulting analysis for carbon was 60.58% and hydrogen was 8.56%.

Sloučenina je rozpustná v methanolu, ethanolu, acetonu, chloroformu, methylenchloridu, diethylethpru, octanu ethylnatém a methylisobutylketonu. Je částečně rozpustná v hexanu a nerozpustná ve vodě.The compound is soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate, and methyl isobutyl ketone. It is partially soluble in hexane and insoluble in water.

Směsná sodnodraselná sůl sloučeniny 38295 nemá žádné charakteristické absorpční čáry v ultrafialovém spektru.The mixed sodium potassium salt of compound 38295 has no characteristic absorption lines in the ultraviolet spectrum.

Na obr. 1 je znázorněno infračervené spektrum směsné soli sodnodraselné. Sodnodraselná sůl vykazuje charakteristické absorpční čáry v infračervené oblasti u následujících vlnových délek vyjádřených v mikronech^,92, 3,40, 6,27, 6,85, 7,22, 8,40, 9,00, 9,15, 9,25, 9,48, 9,98, 10,45, 10,68 a 11,45.Figure 1 shows the infrared spectrum of the mixed sodium potassium salt. The sodium-potassium salt shows characteristic absorption lines in the infrared region at the following wavelengths expressed in microns, 92, 3.40, 6.27, 6.85, 7.22, 8.40, 9.00, 9.15, 9, 25, 9.48, 9.98, 10.45, 10.68 and 11.45.

P ř í k 1 a d 2Example 1 a d 2

Opakuje se způsob podle příkladu 1 za použití vyčeřené fermentační kapaliny místo úplné nezfiltrované fermentační kapaliny.The method of Example 1 was repeated using the clarified fermentation liquid instead of the complete unfiltered fermentation liquid.

P ř í k 1 a d 3Example 1 a d 3

Mycelium oddělené od vyčeřené fermentační kapaliny podle příkladu 2 se několikrát suspenduje v methanolu, methanolový extrakt se vakuově koncentruje a odparek se zpracuje jako v příkladu 1.The mycelium separated from the clarified fermentation liquid of Example 2 is suspended several times in methanol, the methanol extract is concentrated in vacuo and the residue is treated as in Example 1.

Příklad 4Example 4

Fermentační postup podle příkladu 1 se opakuje za použití fermentační živné půdy o tomto složení:The fermentation procedure of Example 1 is repeated using a fermentation broth of the following composition:

g/1g / 1

glukosa glucose 20,0 20.0 kukuřičný škrob cornstarch 10,0 10.0 sójová muoka soya muoka 10,0 10.0 rozpustné složky obilí soluble components of grain 5,0 5.0 síran železitý ferric sulphate 0,2 0.2 chlorid manganičltý Manganese chloride 0,2 0.2 uhličitan vápenatý calcium carbonate 1,0 1.0 chlorid sodný sodium chloride 5,0 5.0 methylester kyseliny olejové oleic acid methyl ester 2,0 2,0 sójový olej soybean oil 2,0 2,0

pH 6,6-6,7pH 6.6-6.7

Na konci fermentačního cyklu se úhrn nezfiltrované fermentační sušiny vysuší do sucha sušením rozprašováním.At the end of the fermentation cycle, the total of unfiltered fermentation solids is dried to dryness by spray drying.

lflf

Příklad 5 zExample 5 of

Smíšená sodnodraselná sůl sloučeniny 38295 se rozpustí v octanu ethylnatém a pH se Upraví zředěnou kyselinou fosforečnou na 4,5. Vrstva,. kterou tvoří rozpouštědlo, se vysuší bezvqdým síranem sodným, odpaří se ve vakuu a odparek krystaluje ze směsi chloroformu a hexanu a získá se krystalická sůl, která má teplotu tání 135 až 138 °C a optickou otáčivost [a]_D ²⁵ = +38°. Při 1% koncentraci v methanolu. Po vakuovém vysušení přes noc při 70 °C za použití kysličníku fosforečného obsahuje směs v průměru 61,65 hmot. % uhlíku, 8,94 hmot. % vodíku aThe mixed sodium potassium salt of compound 38295 was dissolved in ethyl acetate and adjusted to pH 4.5 with dilute phosphoric acid. Layer,. The solvent is dried over anhydrous sodium sulphate, evaporated in vacuo and the residue crystallized from chloroform / hexane to give a crystalline salt having a melting point of 135-138 ° C and an optical rotation [α] _D ²⁵ = + 38 °. At 1% concentration in methanol. After vacuum drying overnight at 70 ° C using phosphorus pentoxide, the mixture contains an average of 61.65 wt. % carbon, 8.94 wt. % hydrogen and

29,41 hmot. % kyslíku; (diferenčně). Volná kyselina sloučeniny 38295 nemá žádné cha-, rakterlstické kresby v ultrafialovém světle.29.41 wt. % oxygen; (differential). The free acid of compound 38295 has no ultraviolet light characteristics.

Infračervehé spektrum volné kyseliny sloučeniny 38295 je na obr. 2. Sloučenina vykazuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti u následujících vlnových délek v mikronech: 2,92, 3,43, 5,47, 6,85, 7,25, 7,35, 8,28, 8,60, 8,80, 9,00, 9,15, 9,80,The infrared spectrum of the free acid of compound 38295 is shown in Figure 2. The compound exhibits characteristic infrared absorption at the following wavelengths in microns: 2.92, 3.43, 5.47, 6.85, 7.25, 7.35, 8.28, 8.60, 8.80, 9.00, 9.15, 9.80,

10,10, 10,45, 10,68, 10,98 a 11,13,10.10, 10.45, 10.68, 10.98 and 11.13,

Analýza krystalu stříbrné, soli sloučeniny 38295 paprsky X vede ke zjištění strukturního vzorceAnalysis of the silver crystal of compound 38295 by X rays yields a structural formula

Příklad 6Example 6

Sodná sůl sloučeniny 38295 se získá přidáním 1 N roztoku hydroxidu sodného do roztoku volné kyseliny podle příkladu 5, vykazujícího pH 8,5 v octanu ethylnatém. Materiál vykrystalovaný ze směsi acetonu a vody má teplotu tání 197 až 198 °C a optickou otáčivost [oí]d²⁵ = +38 ⁰ při 1% koncentraci v.methanolu. Po vysušení ve vakuu přes noc při 70 °C kysličníkem fosforečným obsahuje podle analýzy sodná sůl 60,28 % uhlíku na 8,76 % vodíku.The sodium salt of compound 38295 is obtained by adding 1 N sodium hydroxide solution to the free acid solution of Example 5, having a pH of 8.5 in ethyl acetate. The material crystallized from a mixture of acetone and water has a melting point of 197-198 ° C and an optical rotation [α] d ²⁵ = + 38 ⁰ at a 1% concentration in methanol. After drying in vacuo overnight at 70 ° C with phosphorus pentoxide, the sodium salt was analyzed to contain 60.28% carbon to 8.76% hydrogen.

Na obr. 3 je znázorněno infračervené spektrum sodné soli sloučeniny 38295. Sloučenina vykazuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti na těchto vlnových délkách v mikronech: 2,94, 3,40, 6,25, 6,85, 7,20, 7,45, 8,38, 9,00, 9,27, 9,48, 10,00,Figure 3 shows the infrared spectrum of sodium 38295. The compound exhibits characteristic infrared absorption at the following wavelengths in microns: 2.94, 3.40, 6.25, 6.85, 7.20, 7.45 , 8.38, 9.00, 9.27, 9.48, 10.00,

10,45, 10,65, 10,90, 11,13 a 11,47.10.45, 10.65, 10.90, 11.13 and 11.47.

Příklad 7Example 7

Draselná sůl sloučeniny 38295 se připraví jako v příkladu 6 za použití hydroxidu draselného místo hydroxidu sodného. Látka vykrystalovaná z acetonu a vody má teplotu tání 196 až 199 °C a optickou otáčivost [ajo²⁵ = +38 ° při l,02°/okoncentraci v methanolu. Po vysušení' ve vakuu přes noc při 60 °C kysličníkem fosforečným obsahuje sloučenina podle analýzy 60,58 % uhlíku a 8,70 % vodíku.The potassium salt of compound 38295 was prepared as in Example 6 using potassium hydroxide instead of sodium hydroxide. A substance crystallized from acetone and water has a melting point of 196-199 ° C and an optical rotation of [α] ²⁵ = +38 ° at 1.02 ° / concentration in methanol. After drying overnight under vacuum at 60 ° C with phosphorus pentoxide, the compound contains 60.58% carbon and 8.70% hydrogen.

Na obr. 4 je připojeno infračervené spektrum draselné spli sloučeniny 38295. Sloučenina vykazuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti v těchto vlnových délkách v mikronech: 2,94, 3,42, 6,27, 6,84, 7,20, 8,75, 9,00, 9,14, 9,30, 9,45, 10,45, 10,92, 11,45 a 11,47.Figure 4 shows the infrared spectrum of potassium spli of compound 38295. The compound exhibits characteristic infrared absorption at the following wavelengths in microns: 2.94, 3.42, 6.27, 6.84, 7.20, 8.75 , 9.00, 9.14, 9.30, 9.45, 10.45, 10.92, 11.45 and 11.47.

Příklad 8Example 8

Stříbrná sůl sloučeniny 38295 se připraví přidáním vodného roztoku dusičnanu stříbrného do ethanolického roztoku směsové sodnodraselné soli podle příkladu 1. Pevná látka která se odděluje, vykrystaluje z methanolu. Má teplotu tání 198 až 200 °C a optickou otáčivost [a]_D ²⁵ — +27° při 0,82% koncentraci v methanolu. Průměrné složení vzorku vysušeného ve vakuu přes noc pří 70 °C kysliěníkem fosforečným činí 55,95 % uhlíku a 7,89 % vodíku. Molekulpvá hmotnost, krystalické spli stříbra a sloučeniny 38295 podle zjištění paprsky X je 1060 + 4 atomové hmotnosti jednotky.The silver salt of compound 38295 was prepared by adding an aqueous solution of silver nitrate to the ethanolic solution of the mixed sodium potassium salt of Example 1. The solid which separated was crystallized from methanol. It has a melting point of 198-200 ° C and an optical rotation of [α] _D ²⁵ - + 27 ° at a 0.82% concentration in methanol. The average composition of the vacuum dried overnight at 70 ° C with phosphorus pentoxide is 55.95% carbon and 7.89% hydrogen. The molecular weight, crystalline spli of silver and compound 38295 determined by X-rays is 1060 + 4 atomic mass units.

Claims

Method for producing new antibiotics based polycyclic ethers of formula wherein the microorganism Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 is cultivated at 28 to 36 ^Q C in an aqueous nutrient medium containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic salts under submerged aerobic conditions, and the antibiotic was isolated either by separating from the fermentation liquid by extraction of the fermentation liquid with a water-immiscible organic solvent and chromatography of the concentrated extract on a silica gel column, or by evaporation of the fermentation liquid.