CN212263293U - 一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，涉及环境监测技术领域，包括从上到下依次键合而成的通道层、介电层和基底层；所述通道层内设置有依次连通的进口单元、细菌电泳操控单元和出口单元；所述进口单元和所述出口单元均依次贯穿所述通道层和所述介电层。本实用新型具有单细菌分析能力、高集成化、操作简单的优点。根据本实用新型的微流控芯片装置制作简单，易于操作，能够控制流体在通道中的流动状态的优点，能够实现对水中尤其是压载水中细菌的种类和数量的定性定量检测分析，适用于环境水中尤其是压载水的可生存生物分析和药物监测。

Description

一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片

技术领域

本实用新型涉及环境监测技术领域，特别是涉及一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片。

背景技术

细菌污染指标是用来衡量水源是否被细菌污染和描述污染程度的一系列指标。人类常通过饮用、触碰等途径接触到水中的致病菌，对人体健康造成危害，最常见的疾病包括霍乱、伤寒、痢疾等。为了保证水体的卫生质量，应对不同类型的水质进行微生物的检测。由于水中致病菌含量少，检测步骤复杂，耗时长，所以难度较大。因此世界各国一般都是先检测统一的卫生指示菌，必要时才对各种致病菌逐一检测。这种卫生指示菌就可以作为一种细菌污染指标。同时，船舶压载水中常常携带大量外来海洋生物物种，包括浮游动植物、细菌和病毒等。据统计，全球船舶携带的压载水中，平均每立方米压载水含有浮游动植物个体1.1亿个。船舶压载水能够在船的航行途中将各种细菌散布到全球各地，已对海洋生态系统的安全造成威胁，甚至导致灾难性后果。因此，常常需要对水体中的可生存生物尤其是细菌(病菌)进行检测。目前，对于微生物尤其是细菌的检测主要是培养、化学发光、生物发光，质谱和聚合酶链式反应(PCR)等方法，这些方法具有检测周期较长、程序复杂、价格昂贵等缺点。3M微生物测试片在压载水卫生监测中得到应用，结果发现适用于水中细菌总数的测定，但不适合压载水体中大肠菌群检测。微生物的检测由于受到微生物的生长速度和水体排放时间的不确定性限制，其实效性一直未能达到。因此，迫切需要建立一种水体中微生物快速检测方法，才能有效地开展对于水体的评估。

微流控芯片具有高通量、集成化和低成本的特点，由于其通道结构的尺寸与细菌在同一尺度(微米级)，因此利用微流控芯片技术即可以实现对细菌的捕获、鉴别和检测等一键式封闭操作，具有效率高，误差小等优点。因此，微流控芯片技术可以作为现场快速检测压载水中细菌的一个有力工具。现阶段细菌芯片分析系统主要有光学分析检测系统和电化学分析检测系统。光学分析检测系统由于系统复杂、体积庞大，阻碍了系统的微型化发展；而电化学分析检测系统由于具有灵敏度高、信号处理系统等外围设备比较简单、易于与芯片上的微电极匹配等优点，在微型化和便携化以及检测高效、快速等方面有着良好的前景。Wang ShuQi通过在微流控芯片上固定与大肠杆菌表面蛋白特异性结合的抗体，实现了对血液和牛奶中大肠杆菌的71.8％±5％捕获。Renjie Wang等搭建了简洁的微流控芯片平台，通过免疫捕获技术并结合对应的发光二极管诱导荧光检测系统实现了鼠伤寒沙门氏菌的原位快速检测。S Furutani等人在一块便携式原位实时PCR分析芯片上，通过Taq Man荧光探针，可在7min内检测出草生大肠杆菌。Fronczek等在微流控纸芯片上，利用LED灯和智能手机为荧光成像系统，5min便实现了鼠伤寒沙门氏菌的检测，操作简单方便。

从微流控芯片的分析性能看，其未来的应用领域将十分广泛，但目前的重点应用领域显然是在生命科学领域。其在分析仪器微型化、集成化和便携化等方面的优势为其在环境监测与保护、生物医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、卫生免疫等众多领域的应用提供了广阔的前景。

发明内容

为解决以上技术问题，本实用新型提供一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，该芯片结构简单、微型化、成本低、易于制备和操作，能够实现水体中尤其是压载水中的微生物检测，并且能够对水中各细菌含量进行定量分析。

为实现上述目的，本实用新型提供了如下方案：

本实用新型提供一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，包括从上到下依次键合而成的通道层、介电层和基底层；所述通道层内设置有依次连通的进口单元、细菌电泳操控单元和出口单元；所述进口单元和所述出口单元均依次贯穿所述通道层和所述介电层。

可选的，所述进口单元包括细菌混合液槽、缓冲液槽和侧通道；所述出口单元包括两个废液槽；所述细菌电泳操控单元包括主通道、金属微电极组和平板驱动电极；所述细菌混合液槽设置于所述主通道一端，所述两个废液槽设置于所述主通道另一端；所述缓冲液槽和所述侧通道位于所述细菌混合液槽两侧并与所述主通道相连通，所述主通道与所述细菌混合液槽、所述缓冲液槽和所述废液槽之间通过侧通道连通；所述金属微电极组设置于所述基底层上并伸入所述介电层内，所述平板驱动电极的输入引脚设置于所述基底层上用于与外界驱动电路连接。

可选的，所述金属微电极组包括9个金属微电极。

可选的，所述金属微电极为矩形或条形，宽度为30μm，相邻所述金属微电极之间相距10μm。

可选的，所述主通道深度为20-50μm，宽30-70μm，长380-450μm。

可选的，所述主通道与所述细菌混合液槽之间的高度差为70μm。

可选的，所述细菌混合液槽、所述缓冲液槽和所述废液槽均为圆柱状，直径为60μm，深度为130μm。

可选的，所述侧通道宽40μm，长150μm，深度与所述主通道一致。

可选的，所述金属微电极组和所述平板驱动电极均采用导电金属铜或银。

可选的，所述通道层为聚二甲基硅氧烷层。

可选的，所述介电层为光刻胶层，优选SU-8光刻胶。

可选的，所述基底层为玻璃或硅或陶瓷或聚合物层，厚度为0.5mm-3mm。

本实用新型还公开一种包括上述用于水体中可生存生物检测的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤:

首先，细菌混合液从细菌混合液槽进入，流经细菌电泳操控单元时，在施加了频率F1的电驱动的平板驱动电极的作用下，使细胞进行正向电泳移动至微电极之间；

其次，缓冲液从缓冲液槽进入，通过侧通道对流形成径向挤压力，使细菌沿直线流动，为捕获目标细胞，在施加了频率F2电驱动的金属微电极的作用下，使金属微电极附近的细菌进行电聚焦而单个排列沿主通道轴向前进；

最后，缓冲液槽再注入缓冲液将细菌不断稀释，通过检测区再从出口单元移出。

可选的，所述频率F1的电驱动和所述频率F2的电驱动的波形为三角波、方波或正弦波，频率为1Hz-0.6MHz，峰值为5V-20V。

本实用新型相对于现有技术取得了以下技术效果：

本实用新型中的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，利用细菌电泳特性，驱动分离不同种类细菌，然后利用流体力学操控细菌流动状态，再通过微电极使细菌发生电聚焦，从而使细菌单个流经检测区。相对于普通电泳芯片而言，提高了芯片的检测精度；相对于三维电极而言，又避免了三维电极复杂的制备工艺。

本实用新型中的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，用于压载水中细菌检测的三维微流控芯片装置展示了一些显著的优点，包括：制作简单，易于操作，所用材料生物兼容性好、低导电性、光学透明度高、透气、生物惰性、易加工、成本低等特点与微流控芯片的传统优势相结合，使得检测高效可靠。

与常规的分析流程相比，本实用新型用于细菌检测，只需一台设备和一个芯片就可完成检测，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本；提高了分析过程的自动化，提高工作效率，避免了试样在不同设备之间的转移，简化了人工操作，降低了试样污染的风险；微流控芯片减少了样品和试剂的消耗，降低了运行成本；本实用新型的装置体积小，可形成便携式设备，满足实时化、现场化的检测需要。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实用新型所涉及的芯片A-A’截面示意图；

图2为本实用新型所涉及的三维微流控芯片装置的结构示意图；

图3为本实用新型所涉及的芯片设计图及电极系统图；

图4为根据本实用新型所涉及的微流控通道进行Comsol软件模拟生成的细菌颗粒运动轨迹。

图5为根据本实用新型所涉及的微流控通道施加一种电场频率，细菌颗粒分离情况对比图；

图6为根据本实用新型所涉及的微流控通道施加另一种电场频率，细菌颗粒分离情况对比图；

图7为根据本实用新型所涉及的微流控通道进行Comsol软件模拟生成的微流控通道中电势的空间变化图。

附图标记说明：1、基底层；2、介电层；3、主通道；4、通道层；5、细菌混合液槽；6、侧通道；7、缓冲液槽；8、金属微电极。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

实施例1：芯片的制备

如图1所示，本实施例中的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片采用“一次曝光”技术用紫外光刻方法制作而成。将硅片用硫酸双氧水配比溶液处理、洗净、烘干后，用匀胶机以3000rpm的转速在表面甩一层SU-8 2035负光胶，在65℃烘烤10min,95℃烘烤4min后，经紫外曝光、二次固化、显影、氮气吹干后，即得到各槽室和微通道网络的图案。再将硅烷化使得模具表面疏水，聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物与引发剂以质量比10：1混合覆盖模具，除气泡后在75℃放置固化。将聚合后的PDMS片小心揭下，切割成型，用平头注射器针打孔，然后经氧等离子体处理，与处理过的基底进行键合，芯片即制作成功。

实施例2：芯片的结构

如图1所示，本实施例中的用于水体中可生存生物检测的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片包括从上到下依次键合而成的通道层4、介电层2和基底层1；所述通道层4内设置有依次连通的进口单元、细菌电泳操控单元和出口单元；所述进口单元和所述出口单元均依次贯穿所述通道层4和所述介电层2。

所述进口单元包括细菌混合液槽5、缓冲液槽7和侧通道6；所述出口单元包括两个废液槽；所述细菌电泳操控单元包括主通道3、金属微电极8组和平板驱动电极；所述细菌混合液槽5设置于所述主通道3一端，所述两个废液槽设置于所述主通道3另一端；所述缓冲液槽7和所述侧通道6位于所述细菌混合液槽5两侧并与所述主通道3相连通，所述主通道3与所述细菌混合液槽5、所述缓冲液槽7和所述废液槽之间通过侧通道6连通；所述金属微电极8组设置于所述基底层1上并伸入所述介电层2内，所述平板驱动电极的输入引脚设置于所述基底层1上用于与外界驱动电路连接。

所述金属微电极8组包括9个金属微电极8。

所述金属微电极8为矩形或条形，宽度为30μm，相邻所述金属微电极8之间相距10μm。平板驱动电极宽度为30μm，相邻的平板驱动电极之间相距30μm，厚度与金属微电极8的厚度相同。

所述主通道3深度为20-50μm，优选30μm，宽30-70μm，优选50μm，长380-450μm，优选420μm。

所述主通道3与所述细菌混合液槽5之间的高度差为70μm。

所述细菌混合液槽5、所述缓冲液槽7和所述废液槽均为圆柱状，直径为60μm，深度为130μm。

所述侧通道6宽40μm，长150μm，深度与所述主通道3一致。

所述金属微电极8组和所述平板驱动电极均采用导电金属银。

所述通道层4为聚二甲基硅氧烷层。

所述介电层2为光刻胶层，优选SU-8光刻胶，本实施例中采用SU-8 2035光刻胶。

所述基底层1为玻璃，厚度为0.5mm-3mm。

实施例3：介电泳技术用于细菌检测分离

装置底部安装有电极系统，在检测中对不同种细菌产生不同驱动作用。如图4通过样品槽底部一侧的电极驱动细菌，使不同种细菌间产生轴向的相互分离作用，即不同细菌因理化性质差异而分离，并集中于某一区带向前推进。分离后主通道3两侧错开的金属微电极8对分离后的细菌区带进行电聚焦作用，使各种细菌集中分布于各自区带中心，便于通过检测。检测区两侧的传感电极则实时监测、传导检测区域溶液电导率的变化用以定量分析。如图4所示，为利用介电泳作用在微流控通道中细菌颗粒的分离运动轨迹，施加电压为5v的正负交替的电压，直径为3μm的颗粒和直径为5μm的颗粒分别已在图中标出。

实施例4：电场频率的优化用于微流控芯片内细菌的分离

对微流控通道内细菌溶液施加不同的电场频率，颗粒所受的电场力有所不同，频率过高时，将无法实现不同粒径大小的细菌颗粒的分离与分选。因此，基于本实用新型设计的微流控芯片，分别实验施加电场频率为1HZ-1MHZ范围内，细菌分离情况。结果如图5和图6对比所示，当频率为0.6MHZ(图5)时，细菌是实现分离；当频率为0.7MHZ(图6)时，细菌无法实现分离。

实施例5：阻抗检测技术的应用

细菌阻抗检测技术选择了电化学测量方法中交流阻抗法，并对该阻抗测量技术的原理和电极制备进行了分析和优化。交流阻抗法一般使用电化学工作站便携设备进行电化学体系的阻抗测量，通常采用三电极体系对电极系统进行小幅度的正弦波电压信号扰动。现通过采用双金属微电极8体系，使用微电极来作为工作电极实现了对电极检测装置的微型化，并将待测量细菌样品注于储液槽中，总储液量仅为几立方毫米，相比于普通电化学测量浪费的大量电解质溶液，本检测方法的电解质溶液消耗微乎其微，并且对于细菌样品的消耗也非常小，电极的小面积也节省了细菌检测的时间，大大提高了检测效率。

对于微流控通道中流体流动及电压施加过程中电势的空间变化及电流密度模拟，结果如图7所示。细菌阻抗检测就是对细菌施加一个小幅度的交流扰动信号(电压或者电流)，来测量细菌的电学特性，分析细菌的生理状态和变化。该技术不需要对细菌进行标记，小幅度的扰动不会对细菌有任何损伤，同时可以持续对细菌进行阻抗测量，还可以和微流控技术结合实现测量设备的微型化

需要说明的是，对于本领域技术人员而言，显然本实用新型不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本实用新型的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本实用新型。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本实用新型的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本实用新型内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

本说明书中应用了具体个例对本实用新型的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本实用新型的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实用新型的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本实用新型的限制。

Claims (8)

1.一种用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，包括从上到下依次键合而成的通道层、介电层和基底层；所述通道层内设置有依次连通的进口单元、细菌电泳操控单元和出口单元；所述进口单元和所述出口单元均依次贯穿所述通道层和所述介电层。

2.根据权利要求1所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述进口单元包括细菌混合液槽、缓冲液槽和侧通道；所述出口单元包括两个废液槽；所述细菌电泳操控单元包括主通道、金属微电极组和平板驱动电极；所述细菌混合液槽设置于所述主通道一端，所述两个废液槽设置于所述主通道另一端；所述缓冲液槽和所述侧通道位于所述细菌混合液槽两侧并与所述主通道相连通，所述主通道与所述细菌混合液槽、所述缓冲液槽和所述废液槽之间通过侧通道连通；所述金属微电极组设置于所述基底层上并伸入所述介电层内，所述平板驱动电极的输入引脚设置于所述基底层上用于与外界驱动电路连接。

3.根据权利要求2所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述金属微电极组包括9个金属微电极。

4.根据权利要求3所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述金属微电极为矩形或条形，宽度为30μm，相邻所述金属微电极之间相距10μm。

5.根据权利要求2所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述主通道深度为20-50μm，宽30-70μm，长380-450μm。

6.根据权利要求2所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述主通道与所述细菌混合液槽之间的高度差为70μm。

7.根据权利要求2所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述细菌混合液槽、所述缓冲液槽和所述废液槽均为圆柱状，直径为60μm，深度为130μm。

8.根据权利要求2所述的用于水体中可生存生物检测的微流控芯片，其特征在于，所述侧通道宽40μm，长150μm，深度与所述主通道一致。

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