CN211847960U - 用于多级pcr的反应装置 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于多级PCR的反应装置,具体地,所述的反应装置包括:多级PCR反应管,其中所述的反应管包括:管身部分,所述的管身部分具有一空腔部;位于所述空腔部内的两个或多个PCR反应腔或隔室,所述的两个或多个隔室之间互相独立,并且所述的两个或多个隔室之间具有连通区域,从而用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从第一隔室(101)转移至第二隔室(102);可闭合管盖,所述的可闭合管盖具有一封闭状态和一开启状态,且当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的PCR反应管构成一个对外界封闭的空间。
Description
技术领域
本实用新型涉及生物和检测领域,具体地,本实用新型涉及多级PCR检测病原体的方法和试剂盒及其应用。
背景技术
PCR是涉及通过多个循环,指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的,并且已经被广泛使用。PCR技术一般包括以下步骤:变性多核苷酸,然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后,具有聚合酶活性的酶,使用最初的变性多核苷酸作为合成模板,催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。随着循环的重复,新合成的多核苷酸的量指数增加,因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。
PCR技术具有广泛的生物学应用,包括例如,DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。然而,在实际应用中,无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系,如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染,就可能出现假阳性结果。为了防止污染,一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。
在PCR反应过程中,各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败,降低其灵敏度和特异性。
此外,现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意,尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时,因无关核酸物质的存在,检测灵敏度一直难以提高。
综上所述,本领域目前尚缺乏一种准确,快速,高效的PCR检测方法和设备。
实用新型内容
本实用新型是发明人基于前期发明专利(ZL 201210564539.0)的进一步研究,旨在提供一种准确,快速,高效的PCR检测方法和设备的同时,使企业大大降低制作多级PCR反应管的难度和成本,有力促进本体系在科学界和医学界的更广泛的应用。
本实用新型的第一方面,提供一种用于多级PCR的PCR反应装置,所述的反应装置包括:
多级PCR反应管,其中所述的反应管包括:
管身部分,所述的管身部分具有一空腔部;
位于所述空腔部内的两个或多个PCR反应腔或隔室,所述的两个或多个反应隔室之间互相独立,并且所述的两个或多个反应隔室之间具有连通区域,从而用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室转移至下游隔室;
可闭合管盖,所述的可闭合管盖具有一封闭状态和一开启状态,且当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的PCR反应管构成一个对外界封闭的空间。
在另一优选例中,所述连通区域位于反应腔或隔室上部。
在另一优选例中,所述的反应腔或隔室内可放置PCR反应体系。
在另一优选例中,所述的包括:可携带PCR扩增产物的固体颗粒,和PCR扩增引物对。
在另一优选例中,当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述连接通道在上游隔室的上部,并且位于腔盖下沿下方,从而使得携带PCR扩增产物的固体颗粒被抬升从而离开位于上游隔室下方的反应体系后,进入所述连接通道,再通过所述连接通道进入下游隔室。
在另一优选例中,所述的固体颗粒是磁性微球。
在另一优选例中,各PCR隔室中引物对是不同的。
在另一优选例中,所述互相独立的PCR反应腔或隔室之间通过隔板分离。
在另一优选例中,所述的隔板为双向或三向隔板。
在另一优选例中,当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的隔板顶端低于所述的可闭合管盖,从而构成所述的连通区域。
在另一优选例中,所述的PCR反应管具有一内层管壁,所述的内层管壁位于所述的管身部分内部,从而在管身部分内形成独立的PCR反应腔。
在另一优选例中,所述的内层管壁顶端低于所述的可闭合管盖,从而在所述的内层管壁上方形成所述的连通区域。
在另一优选例中,所述的可闭合管盖与所述的管身部分是一体式的或分离式的。
在另一优选例中,所述的反应装置还包括用于控制所述反应孔温度的控温装置,从而使得反应管的隔室内能够进行预定的PCR反应。
在另一优选例中,所述的反应装置还包括用于控制携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室通过所述连接通道转移至下游隔室的控制装置。
在另一优选例中,所述的控制装置是磁铁或电磁铁。
在另一优选例中,所述的反应装置还包括磁场控制装置;所述的磁场控制装置用于控制磁铁的移动或控制电磁铁的开启/移动,从而实现磁性微球同步和自动可控转移。
应理解,在本实用新型范围内中,本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为本实用新型的一个实施方式中的多级PCR反应管示意图,其中,101和102为PCR反应腔或隔室,20为可封闭管盖,其中所述的可封闭管盖处于开启状态。
图2为本实用新型的一个实施方式中的多级PCR反应管示意图,其中,101和102为PCR反应腔或隔室,20为可封闭管盖,其中所述的可封闭管盖处于封闭状态。
图3为本实用新型的一个实施方式中的多级PCR反应管示意图,其中,101和102为PCR反应腔或隔室,20为可封闭管盖,虚线表示PCR反应管使用过程中固体颗粒的转移路径。
图4为本实用新型另一个实施方式中的多级PCR反应管示意图,其中,101和102为PCR反应腔或隔室,20为可封闭管盖,虚线表示PCR反应管使用过程中固体颗粒的转移路径;
图5为本实用新型另一个实施方式中的多级PCR反应管示意图,其中,101、102和103为PCR反应腔或隔室。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的多级PCR反应管、设备、系统和方法。使用本实用新型的多级PCR反应管进行多级PCR反应,能够具有极其优异的抗污染和抗干扰能力,且可在封闭反应体系内实现PCR扩增产物的定量或半定量转移。在此基础上,发明人完成了本实用新型。
多级PCR反应管
本实用新型供了一种PCR反应装置,所述PCR反应装置包括:多级PCR反应管,其中所述的反应管包括:
管身部分,所述的管身部分具有一空腔部;
位于所述空腔部内的两个或多个PCR反应腔或隔室,所述的两个或多个隔室之间互相独立,并且所述的两个或多个隔室之间具有连通区域,从而用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从第一隔室(101)转移至第二隔室(102);
可闭合管盖,所述的可闭合管盖具有一封闭状态和一开启状态,且当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的PCR反应管构成一个对外界封闭的空间。
如本文所用,术语“本实用新型反应管”、“多级PCR反应管”、“PCR多级反应管”、“多级PCR反应管”、“级联PCR反应管”可互换使用,指具有至少两个相对独立的、PCR反应隔室的PCR反应管,并且在所述PCR反应隔室之间设有允许携带PCR扩增产物的固体颗粒通过的转移通道。
在本实用新型中,对于通过转移通道进行连通的任何两个PCR反应隔室,可将其中先进行PCR反应的反应隔室称为“上游隔室”、“上游反应隔室”或“上游PCR反应隔室”,而将另一PCR反应隔室称为“下游隔室”、“下游反应隔室”或“下游PCR反应隔室”。
参见图1。图中示出的本实用新型多级PCR反应管包括两个可封闭的PCR反应腔或隔室(compartment)。所述的反应管还设有可闭合管盖(20)。较佳地,所述可闭合管盖通过连接件与管身部分连为一体。
此外,在两个隔室之间还存在可以互相连通的连通区域,所述连通区域用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从通过一个隔室(即上游隔室)转移至另一隔室(即下游隔室)。
所述的管身部分可以被倾斜,通常,连接通道的倾斜角度(连接通道与水平线的夹角)为0-30度,较佳地为0-15度,更佳地为0-10度。当管身部分呈现一定倾斜角度时,来自上游隔室的、携带PCR扩增产物的固体颗粒可方便地借助重力或外部施加的磁场力,通过连通区域的从第一隔室或上游隔室滚向或滑向第二隔室或下游隔室。
在本实用新型中,所述连接通道的内径和长度没有特别限制,只要能够让携带PCR扩增产物的固体颗粒通过即可。
本实用新型多级PCR反应管的隔室大小没有特别限制。通常,单个PCR隔室的容积约为10-10000微升,较佳地20-2000微升,更佳地30-1000微升,最佳地40-500微升。
本实用新型多级PCR反应管的隔室形状没有特别限制,可以是圆柱形、圆锥形、或其他类似形状。
本实用新型多级PCR反应管的材质没有特别限制,可以是塑料、玻璃或可透过磁场的其他材料。优选塑料,例如聚丙烯塑料等。
在另一优选例中,所述的反应管包括n个隔室,其中n为2-5000的任一正整数;较佳地,n为2-500的任一正整数。
在另一优选例中,所述的PCR反应管的隔室呈直链构型、支链构型、或环形构型。较佳地,呈“一”字构型、“V”字构型、或“□”或“○”字等构型。
在另一优选例中,所述的隔室呈矩阵排列,所述矩阵为a×b矩阵,其中a为2-100的正整数,b为2-100的正整数。
在另一优选例中,所述的矩阵为6×8、6×16、8×12、12×16矩阵。
在另一优选例中,所述腔盖为密封盖。
在另一优选例中,所述腔盖与隔室是一体化的;更佳地,上述腔盖通过连接件(22)与隔室腔体连接。
在另一优选例中,所述的腔盖与隔室腔体是分离的。
在另一优选例中,所述多个或全部腔盖是一体的。
在另一优选例中,所述连接通道位于反应腔或隔室上部。
在另一优选例中,所述的连接通道高于隔室中预定的液相PCR反应体系的液面。
在另一优选例中,所述的连接通道入口的下沿距离隔室上沿的距离H1与隔室上沿与隔室底部的垂直高度H之比满足:H1/H≤1/2,较佳地≤1/3,更佳地≤1/4,最佳地≤1/5。
在另一优选例中,所述PCR反应管具有2个或3个互相连通的PCR隔室。
在另一优选例中,所述的上游隔室设有引导板,用于引导携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室进入连接通道入口。
携带PCR扩增产物的固体颗粒
在本实用新型中,在隔室中进行PCR反应之中或之后,形成的PCR扩增产物中的一部分会吸附或粘附于置于所述隔室的固体颗粒表面,从而形成携带PCR扩增产物的固体颗粒。当所述固体颗粒从上游隔室转移下游隔室时,所携带的PCR扩增产物就可作为下游隔室中的PCR模板。
在本实用新型中,固体颗粒的形状没有特别限制,可以是球形、卵圆形、圆柱形、锥形、立方形或其他形状。固体颗粒可以是实心的、空心的、网格状的或其他结构,只要该固体颗粒可以吸附或携带PCR扩增产物。
固体颗粒的材质没有特别限制,然而优选的固体颗粒是磁性颗粒,如磁性微球。在本实用新型中,所述的磁性颗粒包括已具有磁性的颗粒以及在磁场作用下具有磁性的颗粒。
在另一优选例中,所述的磁性微球为核壳结构。
在另一优选例中,所述的磁性微球是表面未修饰的、表面修饰的、或表面带有涂层。
在本实用新型中,所述固体颗粒的大小没有特别限制。通常,固体颗粒的平均粒径为0.01~10mm,较佳地为0.1-5mm,最佳地为0.2-2mm。
所述固体颗粒的核酸吸附力受到颗粒表面积和表面性质等因素的影响。技术人员可以购得或用常规方法制备各种不同的能携带PCR扩增产物的固体颗粒。
一种优选的固体颗粒是表面亲水性的或带有羟基等亲水性基团的颗粒。这样,不仅能够吸附核酸分子,还可在转移时携带部分反应混合液,从而将一定量的PCR扩增产物转移至下游隔室。
当颗粒大小和材质确定后,通过常规方法,可以测定出每个固体颗粒所携带的PCR产物的数量。通常,每个颗粒可携带整个PCR反应体系中PCR扩增产物的约1/200-1/10,较佳地约1/100-1/15,更佳地1/50-1/20。按体积计,通常一个颗粒可携带0.1-2微升的反应液体,这取决于颗粒的大小以及表面特性。
取决于需要以及固体颗粒的大小,可以在上游隔室中放置一个或多个固体颗粒。此外,可以在下游隔室中放置或不放置一个或多个固体颗粒。
当一个隔室中有多个颗粒时,这些颗粒可以一起或分别被转移至一个或多个下游隔室。
多级PCR反应
在本实用新型中,对于通过转移通道连通的上游反应隔室和下游PCR反应隔室而言,通常在所述上游PCR反应隔室进行了PCR反应(“第一级PCR反应”)之后或之中,置于反应体系中固体颗粒会吸附一部分扩增产物。将所述吸附有一部分PCR扩增产物的固体颗粒,通过所述转移通道从上游反应隔室转移至下游隔室,就可在下游隔室内作为后续PCR反应的模板,从而进行下一级的PCR反应。
应理解,在本实用新型中,虽然会在至少两个上游PCR反应隔室进行PCR反应,然而,在某些PCR反应隔室也可不进行任何反应,或不进行PCR反应。例如,仅进行探针杂交、测序、电泳或其他检测反应。
在本实用新型中,对于进行PCR反应所需的试剂没有特别限制,可以采用本领域常规的各种不同的PCR反应所需的试剂。代表性的试剂包括(但并不限于):PCR引物、聚合酶;dNTP、缓冲液、镁离子等。
在本实用新型中,所述的PCR反应包括常规PCR(高温PCR)、低温PCR、多级PCR、双引物PCR反应、多引物PCR反应、RT-PCR反应、DNA聚合酶PCR反应、RNA聚合酶PCR反应。
在另一优选例中,所述PCR引物的长度为12-100bp,较佳地15-50bp,更佳地18~30bp。
在另一优选例中,所述反应体系包括以下组分:10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物、各类DNA聚合酶、Mg2+。
在另一优选例中,所述反应体系的各组分含量如下:10×扩增缓冲液5~20μl、4种dNTP混合物50~500μl、PCR引物10~100μl、模板DNA 0.1~2μg、Taq DNA聚合酶1~5μl、Mg2+0.5~3mmol/L、水50~200μl。
在本实用新型中,各隔室内的PCR引物可相同或不同。例如,对于通过两个连接通道连通的三个PCR反应隔室而言,第一PCR引物对、第二PCR引物对和第三PCR引物对分别位于不同的PCR隔室内。三级PCR反应管(三联体)可以通过将例如图1中的二级PCR反应管内部的隔板换成三向隔板而形成,三级PCR反应管的俯视图示意图如图5中所示。
现结合图1-4,描述本实用新型的代表性的多级PCR方法。
图1中,提供了一种二级PCR反应管的示意图,其中反应管的管身部分被隔板分离,形成互相独立的腔室101和102,在PCR反应过程中,可分别作为反应的上游隔室和下游隔室。所述的隔板顶端低于所述的可闭合管盖,从而构成所述的连通区域。
在反应过程中,先在所述多级PCR反应管的PCR反应隔室101和102中分别加入进行PCR反应所需的试剂,形成第一液相PCR反应体系和第二液相PCR反应体系,并且在上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附扩增产物的固体颗粒(如磁性颗粒),但在下游隔室中不加入PCR模板材料,并且两个隔室内的第一液相PCR反应体系和第二液相PCR反应体系互不连通且互不接触;
添加所述的PCR反应体系后,封闭所述的可闭合管盖,从而使得所述的多级PCR反应管构成一个封闭空间,如图2中所示。所述的多级PCR反应管具有一连通区域,用于使固体颗粒结合扩增产物后在不同反应隔室之间互相转移;
在作为上游隔室的反应隔室101中进行PCR反应,形成第一PCR扩增产物以及吸附有所述第一PCR扩增产物的固体颗粒;
抬升(如通过磁力或磁场)所述吸附PCR扩增产物的固体颗粒,离开位于所述上游隔室下方的液相PCR反应体系后,通过所述连通区域进入作为下游隔室的反应隔室102,作为所述下游隔室中的PCR模板材料;其转移路线如图3中所示。
在所述下游隔室R2中进行PCR反应,形成第二PCR扩增产物;
在二级以上(如三级)PCR反应中,可重复上述步骤:将下游隔室Ri(i为≥2的正整数)中形成的吸附有第i级PCR扩增产物的固体颗粒,通过另一连接通道转移至次一级的下游隔室Ri+1,并在所述下游隔室Ri+1中进行PCR反应,从而形成第i+1级PCR扩增产物。
上述PCR反应管同样可以设计为如图4中所述的结构,其中所述的PCR反应管具有一内层管壁,所述的内层管壁位于所述的管身部分内部,从而在管身部分内形成独立的PCR反应腔。所述的内层管壁顶端低于所述的可闭合管盖,从而在所述的内层管壁上方形成所述的连通区域。
与现有技术的PCR反应管相比,本实用新型的多级PCR反应管结构更为紧凑,可在反应空间处于封闭的情况下,将第一次PCR反应产物吸附于固体颗粒(如磁性微球),然后方便地将其从上游隔室转移至下游隔室,从而在下游隔室中将转移的扩增产物作为模板进行第二次PCR,从而在保持高特异性的情况下,通过两次或多次PCR反应显著提高检测灵敏度。
另外,本实用新型的另一显著特点是在两次或多次PCR反应过程中,整个多级PCR反应管或各连通的多级组处于封闭状态,故有效防止了环境以及操作过程中引入污染源,也防止了对环境的污染,因而不必需要洁净程度极高的操作设备或操作室。
在本实用新型中,虽然整个多级PCR反应管或各连通的多级组处于封闭状态,但仍可非常简便地利用固体颗粒在将反应产物(如PCR扩增产物)从上游隔室定量或半定量地转移下游隔室,从而在下游进行下一级的PCR反应。核酸转移量的大小,可通过调节固体颗粒的大小和数量来实现。
PCR扩增设备
本实用新型还提供了一种可用于本实用新型方法的PCR扩增设备。一种优选设备包括:
用于放置PCR反应管的反应孔,其中所述PCR反应管具有上游隔室和下游隔室,以及连接所述上游隔室和下游隔室的连接通道;
用于控制所述反应孔温度的控温装置,从而使得反应管的隔室内能够进行预定的PCR反应;和
用于控制携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室通过所述连接通道转移至下游隔室的控制装置。
通常,所述的固体颗粒是磁性微球,而所述的控制装置是磁铁或电磁铁。该磁体一般位于反应孔的上方,其磁场可以覆盖反应孔区域的全部或部分,从而将磁性微球一次性或分批从上游隔室转移至下游隔室。
在另一优选例中,所述的反应孔呈矩阵排列,所述矩阵为a×b矩阵,其中a为2-100的正整数,b为2-100的正整数,以便与常规的96孔板等配合使用。
使用本实用新型的PCR扩增设备,可以实现大规模、高通量和自动化操作。
本实用新型的主要优点包括:
(a)PCR反应灵敏度高;
(b)特异性好;
(c)抗干扰能力强;
(d)操作简便。
(e)可实现定量和半定量的转移。在多级PCR过程中,按需在级间转移PCR扩增产物。
(f)可在普通医院的实验室进行。
(g)检测结果可靠、精确。
(h)减少或消除对环境的污染。
在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的反应装置包括:
多级PCR反应管,其中所述的反应管包括:
管身部分,所述的管身部分具有一空腔部;
位于所述空腔部内的两个或多个PCR反应腔或反应隔室,所述的两个或多个反应隔室之间互相独立,并且所述的两个或多个反应隔室之间具有连通区域,从而用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室转移至下游隔室;
可闭合管盖,所述的可闭合管盖具有一封闭状态和一开启状态,且当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的PCR反应管构成一个对外界封闭的空间。
2.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述互相独立的PCR反应腔或隔室之间通过隔板分离。
3.如权利要求2所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,当所述的可闭合管盖处于封闭状态时,所述的隔板顶端低于所述的可闭合管盖,从而构成所述的连通区域。
4.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的PCR反应管具有一内层管壁,所述的内层管壁位于所述的管身部分内部,从而在管身部分内形成独立的PCR反应腔。
5.如权利要求4所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的内层管壁顶端低于所述的可闭合管盖,从而在所述的内层管壁上方形成所述的连通区域。
6.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的可闭合管盖与所述的管身部分是一体式的或分离式的。
7.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的反应装置还包括用于控制所述反应隔室温度的控温装置,从而使得反应隔室内能够进行预定的PCR反应。
8.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的反应装置还包括用于控制携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室通过所述连通区域转移至下游隔室的控制装置。
9.如权利要求8所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的控制装置是磁铁或电磁铁。
10.如权利要求1所述的用于多级PCR的反应装置,其特征在于,所述的反应装置还包括磁场控制装置;所述的磁场控制装置用于控制磁铁的移动或控制电磁铁的开启/移动,从而实现磁性微球同步和自动可控转移。
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GR01 | Patent grant | ||
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