CN211445737U

CN211445737U - 用于微生物细胞计数的仪器

Info

Publication number: CN211445737U
Application number: CN201922282063.1U
Authority: CN
Inventors: 李恭新; 刘飞; 王志国; 陈珺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2029-12-18

Abstract

本实用新型公开了一种用于微生物细胞计数的仪器。本实用新型一种用于微生物细胞计数的仪器，包括：泵、DMD模块、透明通道芯片模块、分束器、上位机和光检测器件；所述透明通道芯片模块上设有液体通道，所述液体通道上设有若干圆孔，所述圆孔的直径大于所述液体通道的宽度，所述液体通道的宽度与所述细胞的直径相适配；所述DMD模块中的微镜与所述圆孔对应设置。本实用新型的有益效果：本实用新型通过将传统的自动化的间歇计数过程转换成连续计数过程，将传统计数器中血细胞板内固定的细胞液变成该实用新型的微通道中流动的细胞液，拉长细胞检测时间和距离；微通道的尺寸略大于微生物细胞直径，保证在流通过程中逐个细胞流过通道的横截面。

Description

用于微生物细胞计数的仪器

技术领域

本实用新型涉及细胞计数领域，具体涉及一种用于微生物细胞计数的仪器。

背景技术

微生物发酵工业是生物技术的重要组成部分和基础，在现代食品、能源、医药等高附加值工业中发挥的作用越来越大。微生物发酵的实质是借助于微生物细胞群落来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。微生物细胞功能的体现需要以微生物群落的形式共同作用，因此，微生物细胞数量或浓度直接影响着微生物发酵效益。

传统技术存在以下技术问题：

实现微生物细胞精确技术对微生物细胞本身研究及发酵效益的提高有着至关重要的作用。目前，对微生物细胞计数方法可归纳为两类：人工显微镜计数法和自动血细胞计数方法。人工显微镜计数法先将细胞样本做适当稀疏，充入细胞计数池，在显微镜下统计计数板中一定体积内细胞数，经换算得每升标本的细胞数。该方法纯人工计数方法，计数误差较大、且费时费力。自动血细胞计数方法将细胞悬浮液混匀后滴加在血细胞板，然后将细胞板插入细胞计数仪，计数仪能够自动完成细胞计数。目前细胞计数仪从原理上可分为：基于图像处理的方法、基于光谱学的方法和基于免疫学的方法。基于图像的方法通过图像识别的方法检测出血细胞悬浮液中样本细胞轮廓，然后统计检测出的细胞轮廓，再换算成细胞浓度。基于图像识别方法的细胞计数仪在国内外都有较为成熟的产品，如ThermoFisher公司的Countess II系列计数仪。然而，基于图形处理方法的计数仪在悬浮液存在细胞团聚或者杂质较多时容易产生较大的计数误差。而基于光谱学的方法通过计算投射在细胞液上光谱强度差，反推出细胞浓度。该方法实际的到的是悬浮细胞液中细胞群落的统计值，依然存在的问题是无法排除细胞液中存在细胞残渣等而导致的误差。基于免疫学方法的细胞计数用台盼蓝等试剂对细胞染色后，通过荧光检测的方法计算细胞数量。该方法存在的明显缺陷在于需要对细胞染色处理，样品处理复杂，且损害细胞。

实用新型内容

本实用新型要解决的技术问题是提供一种用于微生物细胞计数的仪器及方法，针对目前活细胞计数方法存在误差较大的问题，该实用新型通过将传统自动化细胞的间歇计数过程变成连续化的过程，不仅有效提高了细胞计数精度，同时能够实现对细胞尺寸分布的精确统计。

为了解决上述技术问题，本实用新型提供了一种用于微生物细胞计数的仪器，包括：泵、DMD模块、透明通道芯片模块、分束器、上位机和光检测器件；

所述透明通道芯片模块上设有液体通道，所述液体通道上设有若干圆孔，所述圆孔的直径大于所述液体通道的宽度，所述液体通道的宽度与所述细胞的直径相适配，所述细胞在液体通道内逐个地流通；所述DMD模块中的微镜与所述圆孔对应设置，每个微镜的翻转方向和经微镜反射后光强大小能够控制；

所述泵将待测量容器内细胞悬浮液溶液吸取后经过液体通道后再次输出到另一个容器；

入射光经过所述分束器的反射后依次穿过所述通道芯片模块和所述DMD模块，形成反射光之后穿过所述分束器后被所述光检测器件检测，其中，所述入射光与所述反射光垂直；所述光检测器件与所述上位机电连接，所述光检测器件将检测到的所述反射光的光强通过电流表征。

在其中一个实施例中，还包括入射平凸透镜；所述入射光先经过所述入射平凸透镜放大后，再经过所述分束器的反射。

在其中一个实施例中，还包括反射平凸透镜、反射平凹透镜和聚焦物镜；所述反射光的光束依次穿过所述反射平凸透镜和所述反射平凹透镜，缩小并平行射入所述聚焦物镜后汇聚到所述光检测器件上。

在其中一个实施例中，所述透明通道芯片模块包括通道板和盖住所述通道板的盖板；所述通道板上形成768×768个“栅格”，每个“栅格”是边长为13.7μm的正方形，中心有个直径为7μm圆孔，孔深7μm，所有的孔通过一个截面为5μm×5μm的通道连通，通道在相邻行之间以Z字型连接；通道进口和出口在所述通道板的一个对角线上，并直接与通道连通，通道进口和出口尺寸都为50μm×50μm×7μm。

在其中一个实施例中，所述DMD模块包括从上往下的DMD模块固定件、DMD、用于固定所述DMD的所述DMD固定架、DMD控制板、固定所述DMD控制板的DMD控制板固定件和DMD模块安装件；DMD模块固定件两边对称螺丝孔连接着DMD控制板、DMD控制板固定件和DMD模块安装件；所述DMD控制板控制所述DMD中每个微镜的翻转方向和微镜反射后光强大小。

一种利用所述用于微生物细胞计数的仪器的用于微生物细胞计数的方法，其特征在于，包括：设定泵的流速为v，通道截面积为s，采样时间为T，采样率为c，光检测器件在第i个位在t时刻检测到的电流信号与参照电流值的差值为ΔI_i(t)，定义第i个位点单个采样点的细胞数量P_i＝n(

n为整数)其中，

对应i个细胞的电流值差值的参考值，则，细胞浓度为

k为检测位点数；令k_d表示单位电流差值参考值所对应的细胞直径，则在第i个位在t时刻采样到的细胞直径

则细胞大小分布图可基于每个位点获得的细胞直径求均值后绘制。

一种用于微生物细胞计数的方法，通过将细胞悬浮液注入微通道内，细胞悬浮液在微通道流动的过程中通过光学检测的方法进行连续计数，所述微通道的宽度略大于细胞的直径，所述细胞在微通道内逐个地流通。

一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述程序时实现任一项所述方法的步骤。

一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现任一项所述方法的步骤。

一种处理器，所述处理器用于运行程序，其中，所述程序运行时执行任一项所述的方法。

本实用新型的有益效果：

本实用新型通过将传统的自动化的间歇计数过程转换成连续计数过程，将传统计数器中血细胞板内固定的细胞液变成该实用新型的微通道中流动的细胞液，拉长细胞检测时间和距离；微通道的尺寸略大于微生物细胞直径，保证在流通过程中逐个细胞流过通道的横截面。此外，通过控制DMD中微镜的翻转过程，能够及时地检测通道每一个“栅格”内细胞状况，实现精确地细胞计数，并能够实时检测出每个细胞的尺寸，给出检测细胞尺寸分布图。

附图说明

图1是本实用新型用于微生物细胞计数的方法的原理简图。

图2(a)、(b)、(c)和(d)是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中：(a)微通道；(b)DMD结构简图；(c)微通道与DMD位置关系简图；(d)图(c)方框内的放大图。

图3是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器的结构简图。

图4是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中的透明通道芯片模块示意图。

图5是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中的DMD模块结构。

图6是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中的光路模块的示意图。

图7是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中的安装架的示意图。

图8是本实用新型用于微生物细胞计数的仪器中的反射光路仿真结果：(a)二维光路图；(b)三维光路图；(c)聚焦点信息图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

本实用新型提供了一种基于数字微镜阵列和微通道的微生物细胞精确计数方法，基本原理如图1所示。该实用新型将传统细胞计数的间歇过程连续化，通过将细胞悬浮液注入微通道内，细胞悬浮液在微通道流动的过程中通过光学检测的方法进行连续计数。微通道直径与细胞直径相近，保证了细胞在通道内逐个地流通。在微通道下方平行放置了一个数字微镜阵列(Digital Micromirrors Device，DMD)，检测光入射到DMD上，并反射汇聚到光电检测器件上；通过计算和统计光电器件上光强大小，换算成细胞数量和细胞尺寸。

微通道是用光刻技术加工成的一条连通“栅格”阵列的通道，如图2a所示。每个“栅格”直边长为13.7μm，内含一个圆孔，其直径约7μm；整个通道非“栅格”区域宽约5μm，通道连通所有“栅格”内的圆孔；通道的首尾两端分别连通一个方形的槽，其直径约50μm×50μm×7μm，用于细胞液的流入和流出。

DMD是由一系列微镜组成的微镜阵列，如图2b所示，微镜表面是光滑镜面，对特定波长范围内的光具有较高的反射率；每个微镜边长为13.7μm，且都能沿着微镜对角线向两边翻转12°。通过DMD控制板能够精确和快速地控制每个微镜的翻转方向，从而调节DMD上反射光的位置或形状。

微通道放置在DMD的正上方，且每个“栅格”与DMD的1个微镜子对齐，如图2c和d所示。光垂直入射到DMD上，DMD中置于水平位置的微镜能够将光垂直向上方向反射回去(图1所示)。通过精确控制每一个微镜的翻转方向及相应微镜反射后光强大小，换算成该微镜上方圆孔内细胞的数量和尺寸。

基于上述原理，本实用新型提供了一种微生物细胞精确计数的仪器，如图3所示。该仪器主要包括：通道芯片模块、DMD模块、光路模块、检测分析模块和安装支撑模块。

通道芯片模块包括芯片固定件、微通道、通道盖片、通道固定件、泵和2个液体管道。芯片固定件连接在DMD模块上，主要用于将通道固定在DMD上方的合适位置。芯片固定件中心位置有一个下沉的方形通孔，孔内依次放置微通道、通道盖片和通道固定件。液体管道主要用于从外界注入细胞液到通道内及从通道内流出细胞液，两个液体管道的一端分别穿过通道固定件、通道盖面深入到微通道的流入口、流出口，接流入口的液体管道另一端接入到泵的输出口。

DMD模块主要包括DMD芯片、DMD控制板和相应的固定元件。DMD芯片有如图2b所示的微镜阵列及其相应控制电路和封装组成；DMD控制板用于控制DMD芯片中微镜翻转；固定元件用于连接DMD芯片和DMD控制板，连接DMD模块和微通道芯片，及将DMD模块固定在仪器的安装支撑模块上。

光路模块主要包括一系列透镜及其安装笼板、聚焦物镜，检测光源和相应的笼板支杆。光学模块用于实现将入射的检测光放大后通过分束器垂直照射到DMD上，然后经过DMD反射，穿过分束器、透镜组和镜头汇聚于检测器件上。

检测分析模块主要包括光检测器件、PC机、分析软件等。用于检测DMD在垂直方向上反射光，并基于检测数据通过分析软件分析出细胞数量和细胞尺寸分布图。

安装支撑模块主要用于仪器安装支撑和固定其他模块。

微通道是该实用新型实施的核心之一，其目的在于将传统的细胞间歇计数过程连续化，使细胞液逐个流过微通道。在一个实施例中，微通道用光刻方法在透明的钢化玻璃上(也就是微通道板)加工而成，其包括768×768个“栅格”，每个“栅格”是边长为13.7μm的正方形，中心有个直径为7μm圆孔，孔深7μm，所有的孔通过一个截面为5μm×5μm的通道连通，通道在在相邻行之间以“Z”字型连接。通道进口和出口在通道板的一个对角线上，并直接与通道连通，用于实现细胞液的注入和流出，进出口尺寸都为50μm×50μm×7μm。

在一个实施例中，微通道芯片模块设计如图4所示。该模块主要包括芯片固定件、微通道(形成在所述微通道板上)、通道盖片、通道固定件，液体管道和泵组成。芯片固定件中间有个下沉的方形通孔，边上有安装和固定用的螺纹沉孔、及管道槽。微通道直接安装在芯片固定件通孔内，向上依次放置通道盖片和通道固定件。通道固定件上表面与芯片固定件上表面齐平，四周有四个螺丝沉孔，用于将通道固定在芯片固定件上。通道盖片由单层玻璃片制成，其尺寸表面尺寸等于微通道板尺寸。通道盖片其中一条对角线上有两个对称的孔，孔的中心位置分别对应于通道进出口中心。通道固定件和芯片固定件都用铝材加工而成。两个液体管道都是直径为1/16英寸的软管，分别与微通道的进出口相连，其中，流入的液体管道的另一端与泵的入口相连。

在一个实施例中，DMD模块直接使用DLP芯片的Discovery系列。DMD类型为0.7英寸VGA系列，包含1024×768个数字微镜，每个微镜边长为13.7μm的正方形，适用于紫外到近红外的所有波段。控制板刷新率最高可达290Hz。DMD模块具体结构如图5所示，从上往下依次是DMD模块固定件、DMD、DMD固定架、DMD控制板、DMD控制板固定件和DMD模块安装件。DMD模块固定件两边对称的四个螺丝孔连接着DMD控制板、DMD控制板固定件和DMD模块安装件，用于固定DMD和DMD控制板。DMD控制板具体如何控制，可以参阅DLP芯片的Discovery系列的相关使用说明，在此不再赘述。

在一个实施例中，光路模块设计如图6所示。整个光路模块用30mm的标准笼板系统搭建而成。检测光为平行度较好的激光器发出的，经过平凸透镜放大后，再经过分束器垂直照射到DMD镜面上；DMD镜面反射的光经过分束器，再分别经过一个平凸透镜和一个平凹透镜，将光束缩小并平行射入一个10倍的聚焦物镜。图8a和b分别是反射光路的二维和三维仿真光路图。直径为5mm的平行入射光束经过平凸和平凹透镜的缩束后，光束的直径缩小到3.3mm并依然保持着良好的平行度，如图8c所示；光束再经聚焦物镜缩小后汇聚在物镜上方的检测器件上。

在一个实施例中，仪器安装架骨架如图7所示。安装骨架主要由支撑杆和固定板组成，用于仪器的安装和其他模块的固定。支撑杆采用截面为10mm×15mm的铝材，固定板采用厚度为10mm的铝板加工而成。

在一个实施例中，检测分析模块在统计细胞数量和绘制细胞大小分布图时采用，恒定流量下多位点采样求均值的方法。具体计算方法是：设定泵的流速为v，通道截面积为s，采样时间为T，采样率为c，在第i个位在t时刻检测到的电流信号与参照电流值的差值为ΔI_i(t)，定义第i个位点单个采样点的细胞数量P_i＝n(

n为整数)其中，

对应i个细胞的电流值差值的参考值，则，细胞浓度为

以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种用于微生物细胞计数的仪器，其特征在于，包括：泵、DMD模块、透明通道芯片模块、分束器、上位机和光检测器件；

2.如权利要求1所述的用于微生物细胞计数的仪器，其特征在于，还包括入射平凸透镜；所述入射光先经过所述入射平凸透镜放大后，再经过所述分束器的反射。

3.如权利要求1所述的用于微生物细胞计数的仪器，其特征在于，还包括反射平凸透镜、反射平凹透镜和聚焦物镜；所述反射光的光束依次穿过所述反射平凸透镜和所述反射平凹透镜，缩小并平行射入所述聚焦物镜后汇聚到所述光检测器件上。

4.如权利要求1所述的用于微生物细胞计数的仪器，其特征在于，所述透明通道芯片模块包括通道板和盖住所述通道板的盖板；所述通道板上形成768×768个“栅格”，每个“栅格”是边长为13.7μm的正方形，中心有个直径为7μm圆孔，孔深7μm，所有的孔通过一个截面为5μm×5μm的通道连通，通道在相邻行之间以Z字型连接；通道进口和出口在所述通道板的一个对角线上，并直接与通道连通，通道进口和出口尺寸都为50μm×50μm×7μm。

5.如权利要求1所述的用于微生物细胞计数的仪器，其特征在于，所述DMD模块包括从上往下的DMD模块固定件、DMD、用于固定所述DMD的所述DMD固定架、DMD控制板、固定所述DMD控制板的DMD控制板固定件和DMD模块安装件；DMD模块固定件两边对称螺丝孔连接着DMD控制板、DMD控制板固定件和DMD模块安装件；所述DMD控制板控制所述DMD中每个微镜的翻转方向和微镜反射后光强大小。