CN207468646U

CN207468646U - 高效细胞培养瓶

Info

Publication number: CN207468646U
Application number: CN201721025442.7U
Authority: CN
Inventors: 林晨; 张大鹤; 滕小锘; 张京奎; 邱忠; 易小萍
Original assignee: Suzhou Midi Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2027-08-16

Abstract

本实用新型公开了一种高效细胞培养瓶，其包括：培养瓶本体，其包括依次连接的瓶颈、瓶主体以及瓶底，所述瓶颈的上端形成瓶口，所述瓶颈邻近所述瓶口处设置有外螺纹；瓶帽，其与所述培养瓶本体密封连接，所述瓶帽上设置有至少一通气孔、至少一取样口、至少一补料口以及至少一转移口，所述瓶帽内设置有与所外螺纹相匹配的内螺纹，所述补料口或转移口与电磁阀或蠕动泵连接，所述电磁阀或蠕动泵与控制装置电连接。本实用新型提供的高效细胞培养瓶且具有大敞开瓶口以及通气性瓶帽设计，可以提供良好的通气和混合效果，氧传质效率高；本实用新型可原位取样，取样简单、快速，改变了传统取样需在超净工作内无菌操作完成。

Description

高效细胞培养瓶

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，更具体地说涉及一种高效细胞培养瓶。

背景技术

细胞培养瓶可在有限的人力、物力、空间的条件下，获得大量的实验数据。此外，摇瓶实验结果提供了细胞基本的生长信息和培养工艺参数，为大规模细胞培养提供技术参考。因此，细胞培养瓶被广泛应用于实验室研究和工业化生产。然而传统的细胞培养瓶仍存在以下问题：

(1)细胞的生长、发育、分裂、繁殖等生命活动均需消耗大量的氧气，参与三羧酸循环过程。传统的培养瓶瓶颈小且瓶底深且大，严重阻挡了气体的流通。培养瓶在摇床上沿培养瓶中心轴线作旋转运动，流体形态呈层流状态，不利于混合和氧传递。目前，研究者们常采用降低装液系数、提高转速的方法提高氧传质系数。然而，若装液系数过低，随着培养过程的进行，培养瓶内的水分大量蒸发，导致培养基的渗透压升高，抑制细胞生长。较高的摇床转速产生高剪切力，引起细胞破损或溶解死亡；此外，长时间极限转速运转会大大缩短摇床的寿命。

(2)为了解细胞的生长代谢状态，需不定时取样测定细胞生长参数，观察细胞形态。传统的培养瓶取样是在超净工作台通过无菌操作技术完成的。整个过程需耗费大量的时间、人力和物力。此外，取样过程需打开瓶帽和通气包装纸，并且需引入枪头、移液管等取样装置，增加了染菌风险。

(3)为维持细胞高生长速率和高细胞活力，需补充大量的营养物质。传统的培养瓶无补料添加装置，营养供给不足导致后期细胞生长缓慢，甚至趋向于裂解死亡，最终影响细胞密度和产物表达量。

(4)传统的培养瓶内壁焊接挡板或瓶体自身凹凸形成挡板，这无疑加大了培养瓶制造工艺的难度。传统的培养瓶加工的难点在于不能精准的设计挡板的尺寸、位置和形状，且瓶内焊接挡板构件工艺复杂。此外，培养瓶内设固定挡板，无疑也增加了清洗的困难，特别是细胞培养分泌产生的粘性物质难以清洗。

因此，有必要在满足细胞生长需求，特别是在满足溶氧需求的前提下，设计一种可快速取样、补料、转移的高效细胞培养瓶。

实用新型内容

本实用新型的主要目的在于提供一种高效细胞培养瓶，以克服现有技术的不足。

为了实现上述目的，本实用新型的技术方案如下：

本实用新型实施例提供了一种高效细胞培养瓶，其包括：

培养瓶本体，其包括依次连接的瓶颈、瓶主体以及瓶底，所述瓶颈的上端形成瓶口，所述瓶颈邻近所述瓶口处设置有外螺纹；

瓶帽，其与所述培养瓶本体密封连接，所述瓶帽上设置有至少一通气孔、至少一取样口、至少一补料口以及至少一转移口，所述瓶帽内设置有与所外螺纹相匹配的内螺纹，所述补料口或转移口与电磁阀或蠕动泵连接，所述电磁阀或蠕动泵与控制装置电连接。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体侧壁下部与培养瓶本体中心轴线平行，所述培养瓶本体侧壁中部倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，所述培养瓶本体侧壁上部也倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°。

进一步的，所述培养瓶本体侧壁中部倾斜于中心轴线，倾斜角度为5～45°，所述培养瓶本体侧壁上部也倾斜于中心轴线，倾斜角度为5～45°。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体底壁与侧壁通过平滑过渡的圆拐角或弧面连接。

进一步的，所述培养瓶本体底壁的高度略高于所述圆拐角或弧面。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体为锥形瓶。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体的瓶口的直径接近于所述瓶颈的长度。

作为较佳优选实施方案之一，所述瓶帽内侧设有环形密封圈，所述环形密封圈位于所述培养瓶本体的瓶口边缘处和瓶盖之间，以提供液体密封。

作为较佳优选实施方案之一，所述的培养瓶本体的侧壁标有刻度线。

与现有技术相比，本实用新型的优点至少在于:

(1)可原位取样，取样简单、快速，改变了传统取样需在超净工作内无菌操作完成。

(2)氧传质效率高，本实用新型提供的高效细胞培养瓶具有大敞开瓶口和通气性瓶帽设计，可以提供良好的通气和混合效果。

(3)转移效率高，与传统转接工艺相比，本实用新型提供的高效细胞培养瓶的瓶帽具有转移口，节省了液体转移至生物反应器的时间，转移时间仅为几分钟，降低了溢出的几率，且可单人操作。

(4)本实用新型提供的高效细胞培养瓶装液系数高，最高可高达60％。

(5)优异的放大性能，可轻松地从小尺寸(125ml)高效细胞培养瓶放大至大尺寸(5L) 高效细胞培养瓶。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型结构特征和技术要点，下面结合附图和具体实施方式对本实用新型进行详细说明。

图1为本实用新型实施例提供的高效细胞培养瓶本体的结构示意图；

图2为本实用新型实施例提供的瓶帽的结构示意图；

图3为本实用新型实施例提供的高效细胞培养瓶的取样示意图；

图4为本实用新型实施例提供的高效细胞培养瓶的补料示意图；

图5为本实用新型实施例提供的高效细胞培养瓶的培养液转移示意图(重力转移法)；

图6为本实用新型实施例提供的高效细胞培养瓶的培养液转移示意图(蠕动泵转移法)；

图7为本实用新型实施例提供的250ml高效细胞培养瓶与5L高效细胞培养瓶内的细胞数、细胞活性比较示意图。

附图标记说明：1-瓶口，2-瓶颈边缘，3-瓶颈，4-侧壁，5-侧壁，6-侧壁，8-外螺纹结构，9-侧壁与底部拐角处，10-瓶底，17-通气孔，18-取样口，19-瓶帽外侧，20-瓶帽内侧，21-补料口，22-转移口，23-注射器，24-取样口密封，25-瓶内取样管，26-补料泵，27-250ml补料瓶瓶外补料管，28-250ml补料瓶瓶内补料管，29-250ml补料瓶，30-个人计算机，31-5L培养瓶瓶内补料管，32-5L高效细胞培养瓶，33-250ml培养瓶瓶外转移管，34-250ml高效细胞培养瓶，35-250ml培养瓶瓶内转移管，36-培养液转移泵，37-5L高效细胞培养瓶。

具体实施方式

以下将结合本实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行具体、清楚、完整地描述。

如图1～2所示，本实施例提供的高效细胞培养瓶包括密封连接的培养瓶本体和瓶盖，瓶帽内侧20有内部螺纹线，与培养瓶瓶颈处的外螺纹结构8配合，瓶帽外侧19为平面环形，瓶帽的顶部具有一个通气孔17、一个或多个端口(取样口18、补料口21、转移口22中任意的一种或几种)。

在瓶帽内侧20，沿着环形瓶帽外侧19处设有一环形密封圈。优选的，环形密封圈的外部边缘邻接瓶帽外侧19的内部，环形密封圈的内部边缘邻接环形法兰(瓶盖下)，环形法兰和瓶帽外侧19与环形密封圈形成咬合连接。优选的，环形密封圈由弹性密封材料构成，如天然橡胶、丁钠橡胶(人造合成橡胶)。当瓶盖与瓶颈卡接时，密封圈位于瓶颈边缘2处和瓶盖之间，形成液体密封。优选的，为避免瓶盖与瓶颈之间的螺纹连接过于紧或打滑，瓶帽外侧19应足够长，当瓶颈边缘2邻接环形密封圈时，瓶颈主体3末端邻接截止法兰。

优选的，密封圈包括O型密封圈或D型密封圈。可供选择的是，密封通过粘结或凹槽的方式连接，密封圈的大小与凹槽的大小吻合。密封最好可以是单层密封，也可以是双层密封或多层密封，各层密封之间最好以一定距离间隔。

所述的补料端21口或转移端口22与电磁阀或蠕动泵26、蠕动泵36连接，计算机控制电磁阀或蠕动泵26、蠕动泵36的开关或运转，以阻断或关闭料液进入培养瓶。补料的时间和补料量可通过计算机30人工设定。优选的是，通气孔17应当采用适当尺寸(通气孔最适直径为1.6mm)，即要满足液体能够从培养液转移口22和取样口18连续流出，避免气体堵塞，也要避免瓶内液体从通气孔溅出以及降低染菌风险。

在实际使用时，生长培养基通过瓶颈的敞开口，注入至培养瓶中，大的敞开瓶口使得操作更简易，通气孔允许气体自由进入培养瓶，确保液体连续流动。

可选择的是，位于盖子上的提示线可以提示使用者如何旋开瓶盖。当培养瓶内的液体低于瓶盖30与培养瓶的邻接处时，确保液体低于刻度线以及通气孔17保持打开。

所述的培养瓶本体又进一步包括瓶底10、瓶主体(瓶主体包括侧壁4，5，6)、瓶颈2、瓶口1。2.5L培养瓶底部直径为50mm，高为28cm，瓶颈长75mm，直径为75mm。优选的是，培养瓶由玻璃、聚合物材料构成，如聚丙烯。优选的是，培养瓶本体可以选用注塑成型或吹塑成型的方式，且可抛弃，减少循环使用带来的污染。

所述的培养瓶本体呈圆锥形、圆柱形、球形、正方体形、长方体形，但不限于此，还可以是其他形状。优选的，培养瓶本体呈圆锥形，培养瓶本体的底壁10与侧壁6之间以及侧壁 4、5、6之间通过平滑过渡的圆拐角或弧面连接，瓶体底壁10略凸起，当培养瓶装液量比较低时，培养瓶内的流体可沿着瓶体底壁10的拐角处流动。瓶体的侧壁6与培养瓶中心轴线平行；侧壁5倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，优选的，倾斜角度为5～45°；侧壁4也倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，优选的，倾斜角度为5～45°。培养瓶本体的侧壁处也可设置液位线，并标有对应的培养瓶容积。

所述的瓶颈2位于瓶体侧壁4的末端，呈圆柱形、方形，但也不限于其它形状，优选的是圆柱形。瓶颈3边缘处设置有外螺纹结构8。外螺纹结构8可以为单条线、多条线，也可以为连续线或中断线，优选的是多条中断线。螺纹的形式不限于插销、法兰连接以及其它连接方式。法兰位于螺纹以下的位置，并延伸至瓶颈外，瓶颈2足够小以便于单手操作。瓶颈 2的直径和其长度可改变，标记可打印至拐角9或培养瓶侧壁4、5、6。

如图1，在更优选的实例中，培养瓶包括瓶底10，培养瓶的底壁10与培养瓶侧壁4、5、6通过圆拐角的方式连接；但可供选择的，培养瓶侧壁4、5、6呈锥形，以一个或多个倾斜度接近中心轴线。培养瓶侧壁4、5、6连接瓶颈2。瓶颈2边缘处有一敞开瓶口1。侧壁6与中心轴线平行，侧壁5缓慢倾斜于中心轴线，侧壁5急速倾斜于中心轴线。

如图3所示，高效细胞培养瓶34或高效细胞培养瓶32的取样方法如下：

1)旋开取样端口18处的取样口密封24；

2)连接注射器23和取样端口18后取样，其中瓶内取样管25与取样端口18连通；

3)旋紧取样端口18处的取样口密封24。

如图4所示，高效细胞培养瓶32的补料方法如下(高效细胞培养瓶34相同)：

1)将高效细胞培养瓶32内的5L培养瓶瓶内补料管31与250ml补料瓶29的补料硅胶管 27无菌焊接；

2)将补料硅胶管27安装在补料泵26泵头内，并且补料硅胶管27与250ml补料瓶瓶内补料管28连通；

3)调整补料泵26的转速和时间或电磁阀的开闭时间，并打开补料阀门，根据细胞生长状况开始补料。

高效细胞培养瓶34内的培养液转移至另一的高效细胞培养瓶37的方法包括以下方法：

a)重力转移法(如图5所示)

a1)将细胞培养瓶34内的250ml培养瓶瓶内转移管与转移硅胶管33连接，并使得转移硅胶管33与高效细胞培养瓶37无菌焊接；

a2)细胞培养瓶34倒置或调整至适宜的位置；

a3)打开液体转移阀门，将培养液完全转入至高效细胞培养瓶37内。

b)蠕动泵转移法(如图6所示)

b1)将细胞培养瓶34内的250ml培养瓶瓶内转移管与转移硅胶管33连接，并使得转移硅胶管33与高效细胞培养瓶37无菌焊接；

b2)将转移硅胶管33安装在培养液转移泵36的泵头内；

b3)设置培养液转移泵36的转速和时间，并打开液体转移阀门，将培养液完全转入至高效细胞培养瓶37内。

以下结合具体的实施例及附图对本实用新型做进一步详细的说明。

实施例1

为评价高效细胞培养瓶的高效的培养性能、装液系数、可操作性(染菌率、单次取样耗时、单次接种转移耗时)，对PK-15细胞和CHO细胞进行培养，每种细胞各培养50瓶，培养条件如下：

PK-15细胞的培养条件：(1)高效细胞培养瓶：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5L高效细胞培养瓶32，接种密度为0.6×10⁶cells/ml，2g/L载体介质(GE公司生产的Cytodex-1)，37℃，5％CO₂培养。每隔1d利用补料泵26流加补加补料培养基。培养至第4d时，收集细胞。(2)常规细胞培养瓶：从250ml常规细胞培养瓶接种至5L常规细胞培养瓶，接种密度为0.6×10⁶cells/ml，2g/L载体介质(GE公司生产的Cytodex-1)，37℃，5％CO₂培养。每隔1d利用人工补加补料培养基，培养至第4d时，收集细胞。

CHO细胞的培养条件：(1)高效细胞培养瓶：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5L高效细胞培养瓶32，接种密度为0.8×10⁶cells/ml，37℃，5％CO₂培养。当葡萄糖耗尽时，补料泵26补加补料培养基和葡萄糖。培养至第5d时，培养温度调至32℃。培养至第14d时，收集细胞。(2)常规细胞培养瓶：从250ml常规细胞培养瓶接种至5L常规细胞培养瓶，接种密度为0.8×10⁶cells/ml，37℃，5％CO₂培养。当葡萄糖耗尽时，人工补加补料培养基和葡萄糖。培养至第5d时，培养温度调至32℃，培养至第14d时，收集细胞。

取样和接种转移时，计算单次取样耗时和单次接种耗时；培养结束时，取样测定最终的平均细胞数和观察染菌状况结果并计算染菌率。

样品1000rpm离心15min，弃掉上清液，加入0.1％结晶紫染液，37℃水浴1h，采用血球计数板测定样品中细胞数。并观察细胞染菌状况，染菌率的计算公式为：染菌率(％)＝染菌瓶数/(未染菌瓶数+染菌瓶数)。

表1高效细胞培养瓶与常规细胞培养瓶的培养性能与可操作性比价

高效培养瓶培养的PK-15细胞和CHO细胞的细胞密度比常规培养分别高达53.6％和 37.8％。高效培养瓶不仅能保证细胞高密度生长，还能增加摇瓶的装液量，5L高效细胞培养瓶的装液系数可高达60％，而常规培养瓶的装液系数仅为30％。高效培养瓶和常规培养瓶分别采用离位取样和原位取样的方式，单次取样分别耗时6.9～7.6min和2.1～2.2min。高效培养瓶采用补料泵转移的方式接种，单次接种耗时仅为常规培养瓶接种时间的一半，且大大避免了染菌。

实施例2

考察HEK-239细胞在高效细胞培养瓶中的放大性能。细胞的培养条件：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5L高效细胞培养瓶32，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，37℃，5％CO2培养。每隔1d补加补料培养基。培养至第7d时，收集细胞。每天取样测定细胞数和细胞活性。

细胞活性测定采用碘化丙啶(PI)染色的方法。藻细胞染色时，向样品中加入PI储备液 (0.2μm滤膜过滤，于4℃下保存，最终浓度为10μmol/L，在黑暗室温条件下孵育20min。PI染料无法标记活细胞，而死亡细胞胞内PI染料被488nm激光激发后发射红荧光，被FL2 通道(585nm)接收，FL2通道至少检测到10000个细胞。样品的分析流速为60μl/min，上样体积为10μl。

由图7可知，在250ml和5L高效培养瓶中HEK-239细胞的细胞生长变化趋势相似，初期生长缓慢，然后进入快速生长期，在培养第6d时趋向稳定，培养第7d时细胞数达到4.6×10⁶cells/ml。该结果表明，HEK-239细胞在250ml和5L高效培养瓶中获得基本一致的生长效果。

上述具体实施方式，仅为说明本实用新型的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本实用新型的保护范围，凡是依据本实用新型的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本实用新型的保护范围之内。

Claims

1.一种高效细胞培养瓶，其特征在于包括：

2.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体侧壁下部与培养瓶本体中心轴线平行，所述培养瓶本体侧壁中部倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，所述培养瓶本体侧壁上部也倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°。

3.根据权利要求2所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体侧壁中部倾斜于中心轴线，倾斜角度为5～45°，所述培养瓶本体侧壁上部也倾斜于中心轴线，倾斜角度为5～45°。

4.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体底壁与侧壁通过平滑过渡的圆拐角或弧面连接。

5.根据权利要求4所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体底壁的高度略高于所述圆拐角或弧面。

6.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体为锥形瓶。

7.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述培养瓶本体的瓶口的直径接近于所述瓶颈的长度。

8.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述瓶帽内侧设有环形密封圈，所述环形密封圈位于所述培养瓶本体的瓶口边缘处和瓶盖之间，以提供液体密封。

9.根据权利要求1所述的高效细胞培养瓶，其特征在于：所述的培养瓶本体的侧壁标有刻度线。