CN205193000U - 一种用于检测he4浓度的电化学免疫传感器 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，包括基底层、电极层和绝缘层，在绝缘层上还开有凹槽，凹槽内设有石墨烯-纳米金膜，并包被了链霉亲和素，通过双抗体夹心法原理将生物素化的HE4一抗、待捕获抗原和辣根过氧化物酶标记的HE4二抗依次修饰到石墨烯-纳米金膜上，即制成了所述的电化学免疫传感器，该传感器结合了免疫反应的特异性和电化学检测的灵敏性，利用了纳米金，石墨烯等新型纳米材料，促进了电子传递，极大地提高了传感器检测的灵敏度。制备的这种传感器具有操作简单、携带方便，检测成本低廉等优点。

Description

一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器

技术领域

本实用新型属于分析化学与电化学传感器领域，涉及一种基于纳米金(AuNPs)和石墨烯(Graphenesheets，GS)联合修饰并包被有链霉亲和素的丝网印刷电极的电化学免疫传感器，可对血清中人附睾蛋白4(Humanepididymis-specificprotein4，HE4)浓度进行检测，用于早期诊断卵巢癌。

背景技术

HE4首先在附睾远端的上皮中被发现，并且最初认为它是一种与精子成熟相关的蛋白酶抑制剂。一直以来有报道认为HE4在卵巢癌组织的上皮内有所表达。不仅在细胞水平上有所表达，分泌型HE4已经在卵巢癌患者的血清中检测到有高水平表达。在卵巢癌患者与良性状态下的健康者的病例/对照对比性研究中发现HE4检测卵巢癌在特异性水平为96％时具有67％的敏感性。在对卵巢癌相关的大量生物标志物的评价研究中，HE4在疾病的早期阶段检测卵巢癌时具有最高的灵敏度。因此，对HE4进行检测对卵巢癌的早期的诊治预防具有重要意义。

目前，血清HE4测定可用酶联免疫吸附试验和化学发光免疫检测法，这两种方法需要实验室大型仪器检测并需配备专业人员，且检测时间相对较长。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，该传感器可快速检测早期卵巢癌患者的HE4浓度，且操作简单、检测成本低廉。

本实用新型的用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，在基底层上依次有电极层和绝缘层，电极层为由工作电极、参比电极和对电极构成的三电极体系，绝缘层覆盖在电极层上使三电极一端裸露用于检测，在绝缘层上还开有凹槽，凹槽处三电极裸露，在凹槽内工作电极表面自下而上依次覆盖有石墨烯-纳米金膜、链霉亲和素层、生物素化的HE4一抗层、HE4抗原层以及辣根过氧化物酶标记二抗层。

上述技术方案中，所述的基底层通常为PET基板或硅片。

所述的对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极，工作电极是碳电极。所述的石墨烯-纳米金膜是采用将混合均匀的石墨烯-纳米金-DMF分散液进行滴加并烘干制得，膜中石墨烯与纳米金的质量比为1:1。

所述的绝缘层可以为环氧树脂。

上述用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：

a)用超纯水、无水乙醇清洗基板表面。使用丝网印刷工艺，将电极层、绝缘层依次印在基板上，使电极层一端裸露，同时使绝缘层上开有凹槽，凹槽内三电极裸露；90℃真空干燥箱内干燥处理15min后待用；

b)将石墨烯和纳米金溶液均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF)中，超声处理10min，制成石墨烯-纳米金DMF分散液，其中石墨烯与纳米金质量比1:1；

c)取上述分散液均匀滴涂于凹槽内的工作电极上，室温下干燥2h，制成GS-AuNPs/SPE电极；

d)取链霉亲和素溶液滴加于上述GS-AuNPs/SPE电极的石墨烯-纳米金粒子复合膜上，利用纳米粒子吸附性强的特性将链霉亲和素固定在丝网印刷电极上；

e)将生物素化的HE4抗体滴加到凹槽内工作电极上，室温孵育1小时后，用冲洗液冲去未结合的生物素化的HE4抗体；

f)将HE4标准品滴加到凹槽内工作电极上，室温孵育1小时后，用冲洗液冲去未结合的HE4标准品；

g)将经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗滴加到凹槽内工作电极上，室温孵育1小时后，加入0.25％的小牛血清蛋白(BSA)封闭抗体的非特异性吸附位点10分钟，然后用冲洗液冲去未结合的经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗；获得用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器。

在上述传感器工作电极表面滴加5μl的过氧化氢溶液，可测定其氧化还原电位的变化，利用辣根过氧化物酶可催化过氧化氢产生的电流值与HE4的浓度值呈线性关系，绘制标准曲线。

本实用新型利用链霉亲和素固定生物素化抗体特异性强，纳米金比表面积大、吸附性好以及石墨烯机械强度高、电子传导性好及化学性质稳定等优点，构建了一种新型的电化学免疫传感器，该传感器采用双纳米材料修饰并包被链霉亲和素，并在电极表面形成抗体-抗原-抗体的“三明治夹心”结构，不仅利用了电化学检测的高灵敏性，也结合了酶联免疫吸附实验特异性强的优点。该传感器可用于HE4浓度的床边快速检测或病人自我监测，其操作简便、检测下限低、灵敏度较高、重复性好且检测成本低廉，检测范围可达0～400pmol/L，检出限为0.5pmol/L，线性相关系数为0.99376，检测时间<30min。

附图说明

图1电化学免疫传感器的结构示意图；

图2电化学免疫传感器的俯视结构示意图；

图3工作电极上石墨烯-纳米金膜的扫描电镜图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本实用新型做详细说明，本实施例在以本实用新型技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型的保护范围不限于下述的实施例。

如图1、2所示，用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，在基底层1上依次有电极层2和绝缘层3，电极层2为由工作电极、参比电极和对电极构成的三电极体系，绝缘层3覆盖在电极层2上使三电极一端裸露用于检测，在绝缘层上还开有凹槽4，凹槽4处三电极裸露，在凹槽内工作电极表面自下而上依次覆盖有石墨烯-纳米金膜9、链霉亲和素层8、生物素化的HE4一抗层7、逮捕获的HE4抗原层6以及辣根过氧化物酶标记二抗层5。

上述技术方案中，所述的基底层通常为PET基板或硅片。

所述的对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极，工作电极是碳电极。所述的石墨烯-纳米金膜是采用将混合均匀的石墨烯-纳米金-DMF分散液进行滴加并烘干制得，膜中石墨烯与纳米金的质量比为1:1。

所述的绝缘层可以为环氧树脂。

其制备方法如下：

(1)以0.5mm厚PET板为基板。用超纯水、无水乙醇清洗基板表面。使用丝网印刷工艺，将电极层、绝缘层依次印在基板上；使电极层一端裸露，同时使绝缘层上开有凹槽，凹槽内工作电极裸露；90℃真空干燥箱内干燥处理15min后待用。

(2)将10mg石墨烯和纳米金按质量比1:1均匀分散在10ml0.2mg/ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF)中，超声处理10min，制成1.0mg/ml的石墨烯-纳米金分散液。

(3)取5μl该分散液均匀滴涂于上述凹槽内的工作电极(4mm²)上，室温下干燥2h，制成GS-AuNPs/SPE电极。

(4)取5μl链霉亲和素溶液滴加于上述电极的石墨烯-纳米金膜上，利用纳米粒子吸附性强的特性将链霉亲和素固定在丝网印刷电极上。

图2为在工作电极表面修饰了石墨烯纳米金粒子复合物的的扫描电镜图，图中可见粒径为16纳米的纳米金粒子均匀散在地分布单层的石墨烯表面。

(5)将5μl生物素化的HE4抗体滴加到上述4mm²工作电极上，室温孵育1小时后，用冲洗液冲去未结合的生物素化的HE4抗体；

(6)将5μl一系列不同浓度的HE4标准品滴加到工作电极上，室温孵育1小时后，用冲洗液冲去未结合的HE4标准品；

(7)将5μl经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗滴加到工作电极上，室温孵育1小时后，加入0.25％的小牛血清蛋白(BSA)封闭抗体的非特异性吸附位点10分钟，然后用冲洗液冲去未结合的经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗；获得用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器；

最后在电极表面滴加5μl的过氧化氢溶液，并测定其氧化还原电位的变化。仪器开机，在待检状态时将电极插入仪器接口，根据所得的电流值与HE4标准品的浓度呈线性关系，绘制标准曲线。

Claims (4)

1.一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，其特征在于，在基底层（1）上依次有电极层（2）和绝缘层（3），电极层（2）为由工作电极、参比电极和对电极构成的三电极体系，绝缘层（3）覆盖在电极层（2）上使三电极一端裸露用于检测，在绝缘层上还开有凹槽（4），凹槽（4）处三电极裸露，在凹槽内工作电极上自下而上依次覆盖有石墨烯-纳米金膜（9）、链霉亲和素层（8）、生物素化的HE4一抗层（7）、HE4抗原层（6）以及辣根过氧化物酶标记二抗层（5）。

2.根据权利要求1所述的用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，其特征在于，所述的基底层（1）为PET基板或硅片。

3.根据权利要求1所述的用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，其特征在于，所述的对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极，工作电极是碳电极。

4.根据权利要求1所述的用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，其特征在于，所述的绝缘层（3）为环氧树脂。